专利名称：一种静注人免疫球蛋白的制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种静注人免疫球蛋白的制备工艺，属于生物制药领域。
背景技术：
静注人免疫球蛋白的活性成份为蛋白质，其中95%以上为免疫球蛋白。由健康人 血浆，经低温乙醇蛋白分离法(压滤分离法)分离纯化，去除抗补体活性并经病毒灭活处理 制成。目前，静注人免疫球蛋白生产品种一般都为5%低蛋白浓度的静注人免疫球蛋白，因 此，现有静注人免疫球蛋白临床使用时，输注的剂量相对较大，相对高浓度制品输注时间相 对较长；此外，达到血药浓度的时间相对较长。由于其生产方法为低温乙醇离心法，产品得 率低，稳定性不好，同时使用糖作为保护剂，不利于临床忌糖患者使用。为了使静注人免疫 球蛋白的产品得率进一步提高、稳定性增强、适应人群更广，开发出一种能制备出5-11%蛋 白浓度的性能更好的静注人免疫球蛋白的制备工艺显得十分必要。
发明内容
本发明的目的是提供一种采用低温乙醇压滤法与层析法相结合，同时针对临床使 用需求选用麦芽糖或甘氨酸作为保护剂制备出5-11%蛋白浓度的静注人免疫球蛋白的制 备工艺。本发明的目的是这样实现的在传统的5%低蛋白浓度的静注人免疫球蛋白的制 备工艺的基础上，在提取过程中采用压滤法代替离心法；超滤时，将蛋白浓度调整至3% 6%，用0. 5mol/L的NaOH调pH至6. 4 6. 6，然后加lmol/L磷酸一 NaOH缓冲液调节电导率 在T=19°C时测为0. 175 s / m 0.205s / m，调节好后，采用层析法，用离子交换柱进行 上柱层析纯化；能够有效地去除杂蛋白，提高蛋白纯度，并且能够提高产品得率；同时使用 麦芽糖或甘氨酸都为保护剂，
优选方案为
(1)按《中国药典》2010年版三部要求采集，且经复检合格并通过检疫期检疫合格的原 料血浆，在预融间，用75%乙醇消毒、再用低于35°C注射用水冲洗尽乙醇后，进行破袋；破 袋后输送到融浆罐，用30 35°C的循环水进行夹层循环融浆；血浆融化后，及时停止热水 循环，把血浆温度控制在0 4°C之间，取样送质检进行抗-HIV、HBsAg、抗-HCV、梅毒、ALT、 抗-HBs等检测；经过滤或离心，离心速度不大于4L/min/台，出液温度控制在0 4°C，分离 冷沉淀，冷沉淀用于VDI因子生产；将去除冷沉淀的血浆取样进行蛋白含量、组分分析、细菌 内毒素检测；将符合药典要求的去除冷沉淀的血浆输送至蛋白分离反应罐；控制该血浆的 温度在1 3°C之间，按不超过1. 0升/分钟的流速加入pH4. 0缓冲液调节pH值至6. 80 7. 00 ；再加入低于一 15°C的95%乙醇或50%乙醇，流速不超过1. 5升/分，使乙醇体积比 终浓度至8%，温度控制在一 1 一 3°C，加完乙醇后的pH值为6. 80 7. 20 ；搅拌30分钟 以上，进行离心，离心过程中出液流速不超过4升/分/台，出液温度控制在一 1 一 3°C， 离心得组分I沉淀和组分I上清液；(2)取上述组分I上清液，加pH4.0缓冲液调节组分I上清液的pH值为6. 80 6. 85，控 制流速不超过1. 0升/分钟，添加低于一 15°C的95%乙醇至乙醇体积比浓度为20%，温度 控制在一 4 一 6°C;加完乙醇后，pH为6. 80 7. 00 ；搅拌120分钟以上后，静置60分钟以 上，再开启搅拌，按每升反应液加入18g硅藻土，进行压滤，进液压力最高不超过0. 20Mpa, 压滤后得组分II +III沉淀和组分II +III上清液；
(3)取10 15倍上述组分II+III沉淀的重量的注射用水，用氯化钠调整注射用水的 钠离子浓度为0. 01mol/L ；加入搅拌机中开启搅拌，降温至0°C 3°C时，将上述组分II + III 沉淀倒入搅拌机中搅拌溶解；待沉淀完全溶解，在搅拌过程中以不大于0. 5升/分钟的流 量缓慢加入PH4.0缓冲液到反应液中，调整反应液的pH至5. 20士0. 1，控制反应液温度 为0°C -rC，加完pH4. 0缓冲液，继续搅拌至少10分钟；开启制冷循环，加低于-15°C的 95%乙醇，控制流速不大于1. 5升/分钟，使反应液最终的乙醇体积比浓度为17% ；反应液 最终温度控制在_4°C _6°C，加完乙醇继续搅拌2小时，静置4小时以上进行压缩过滤； 先用_4°C以下的压缩空气吹出滤器中的水，启动反应罐搅拌器，按每升反应液加入18g硅 藻土，使硅藻土与反应液混合均勻10分钟以上边搅拌边过滤，在过滤过程中保持出液温度 为-4 _6 °C，过滤压力不超过0. 2 Mpa，得压滤液上清；
(4)上述压滤液上清计量后，启动反应罐搅拌器和制冷循环，控制温度为_4 -6°C， 进行深层过滤，过滤出液温度控制在_4 -6°C，过滤后用lmol/L的HCl调节pH为3. 8 4. 0，输入超滤透析罐中进行下道工序的脱醇、纯化；
(5)开始对上述调节完毕pH值的过滤液进行超滤，浓缩至5%以上，用5倍体积的2 80C的注射用水进行透析；将蛋白浓度调整至3% 6%，用0. 5mol/L的NaOH调pH至6. 4 6. 6，然后加lmol/L磷酸一 NaOH缓冲液调节电导率在T=19°C时测为0. 175 s / m 0.205s / m，调节好后用离子交换柱进行上柱层析纯化；层析完毕用lmol/L的HCl调节pH为 3. 8 4. 0，开启超滤机浓缩至5%以上，用5倍体积2 8°C注射用水进行透析，使乙醇含 量< 0. 025%，然后将蛋白液浓缩至6%以上，将麦芽糖或甘氨酸加入蛋白液内，用lmol/L的 HCl调节pH值，使麦芽糖含量为10 士 1%或甘氨酸含量为2 士0. 2%，pH为3. 8 4. 4，蛋白含 量为8士3%，得配制后的蛋白液；
(6)配制后的蛋白液经0.2μ m除菌滤芯过滤，放置在孵放室，经24°C 士 1°C在孵放21 天；孵放结束后用DV50滤芯除病毒过滤，并根据蛋白含量调整过滤液，过滤液蛋白含量符 合生产要求；用0. 2 μ m除菌滤芯过滤分装，分装后的制品送检、灯检，检验合格后包装、入 库；
所述PH4. 0缓冲液是由乙酸钠与冰乙酸组成的水溶液，每升水中添加244. 9ml冰乙酸 和65. 6g乙酸钠；
所述磷酸一 NaOH缓冲液为每升水中添加1. 6ml磷酸和1. 2gNa0H ；
以上百分比除特别说明，其余均为重量百分比。组分I上清液，组分I沉淀，组分II + III沉淀，组分II + III上清液为所属技术领域 的通用分类方法，在本发明中是对特定物质的名称的命名；并不是指单纯的序号。本发明具有积极的意义
1、采用压滤法代替离心法，产品得率显著提高，得率提高15-20%；
2、超滤时，将蛋白浓度调整至3% 6%，用0.5mol/L的NaOH调pH至6. 4 6. 6，然后加lmol/L磷酸一 NaOH缓冲液调节电导率在T=19°C时测为0. 175 s / m 0. 205s / m， 调节好后，采用层析法，用离子交换柱进行上柱层析纯化；能够有效地去除杂蛋白，提高蛋 白纯度，并且能够提高产品得率；
3、麦芽糖或甘氨酸都为保护剂，有利于提高静注人免疫球蛋白稳定性，甘氨酸作保护 剂可满足了糖尿病患者临床使用；
4、本发明可得到5-11%蛋白浓度的静注人免疫球蛋白。
具体实施例方式
本发明具体实施方式
在发明内容中得以体现，发明内容可以直接用于实施例。
权利要求
一种静注人免疫球蛋白的制备工艺，其特征是制备工艺如下(1)将符合药典要求的去除冷沉淀的血浆输送至蛋白分离反应罐；控制该血浆的温度在1～3℃之间，按不超过1.0升/分钟的流速加入pH4.0缓冲液调节pH值至6.80～7.00；再加入低于－15℃的95％乙醇或50％乙醇，流速不超过1.5升/分，使乙醇体积比终浓度至8％，温度控制在－1～－3℃，加完乙醇后的pH值为6.80～7.20；搅拌30分钟以上，进行离心，离心过程中出液流速不超过4升∕分∕台，出液温度控制在－1～－3℃，离心得组分I沉淀和组分Ⅰ上清液； (2)取上述组分Ⅰ上清液，加pH4.0缓冲液调节组分I上清液的pH值为6.80～6.85，控制流速不超过1.0升/分钟，添加低于－15℃的95％乙醇至乙醇体积比浓度为20％，温度控制在－4～－6℃；加完乙醇后，pH为6.80～7.00；搅拌120分钟以上后，静置60分钟以上，再开启搅拌，按每升反应液加入18g硅藻土，进行压滤，进液压力最高不超过0.20Mpa，压滤后得组分Ⅱ+Ⅲ沉淀和组分Ⅱ+Ⅲ上清液；(3)取10～15倍上述组分Ⅱ+Ⅲ沉淀的重量的注射用水，用氯化钠调整注射用水的钠离子浓度为0.01mol/L；加入搅拌机中开启搅拌，降温至0℃～3℃时，将上述组分Ⅱ+Ⅲ沉淀倒入搅拌机中搅拌溶解；待沉淀完全溶解，在搅拌过程中以不大于0.5升/分钟的流量缓慢加入pH4.0缓冲液到反应液中，调整反应液的pH至5.20±0.1，控制反应液温度为0℃～ 1℃，加完pH4.0缓冲液，继续搅拌至少10分钟；开启制冷循环，加低于 15℃的95%乙醇，控制流速不大于1.5升/分钟，使反应液最终的乙醇体积比浓度为17%；反应液最终温度控制在 4℃～ 6℃，加完乙醇继续搅拌2小时，静置4小时以上进行压缩过滤；先用 4℃以下的压缩空气吹出滤器中的水，启动反应罐搅拌器，按每升反应液加入18g硅藻土，使硅藻土与反应液混合均匀10分钟以上边搅拌边过滤，在过滤过程中保持出液温度为 4～ 6℃，过滤压力不超过0.2 Mpa，得压滤液上清；(4)上述压滤液上清计量后，启动反应罐搅拌器和制冷循环，控制温度为 4～ 6℃，进行深层过滤，过滤出液温度控制在 4～ 6℃，过滤后用1mol/L的HCl调节pH为3.8～4.0，输入超滤透析罐中进行下道工序的脱醇、纯化； (5)开始对上述调节完毕pH值的过滤液进行超滤，浓缩至5%以上，用5倍体积的2～8℃的注射用水进行透析；将蛋白浓度调整至3%～6%，用0.5mol/L的NaOH调pH至6.4～6.6，然后加1mol/L磷酸－NaOH缓冲液调节电导率在T=19℃时测为0.175 s / m～0.205s / m ，调节好后用离子交换柱进行上柱层析纯化；层析完毕用1mol/L的HCl调节pH为3.8～4.0，开启超滤机浓缩至5%以上, 用5倍体积2～8℃注射用水进行透析，使乙醇含量≤0.025%，然后将蛋白液浓缩至6%以上，将麦芽糖或甘氨酸加入蛋白液内，用1mol/L的HCl调节pH值，使麦芽糖含量为10±1%或甘氨酸含量为2±0.2%，pH为3.8～4.4，蛋白含量为8±3％，得配制后的蛋白液；(6)配制后的蛋白液经0.2μm除菌滤芯过滤，放置在孵放室，经24℃±1℃在孵放21天；孵放结束后用DV50滤芯除病毒过滤，并根据蛋白含量调整过滤液，过滤液蛋白含量符合生产要求；用0.2μm除菌滤芯过滤分装，分装后的制品送检、灯检，检验合格后包装、入库；所述pH4.0缓冲液是由乙酸钠与冰乙酸组成的水溶液，每升水中添加244.9ml冰乙酸和65.6g乙酸钠；所述磷酸－NaOH缓冲液为每升水中添加1.6ml磷酸和1.2gNaOH；以上百分比除特别说明，其余均为重量百分比。
全文摘要
本发明涉及一种静注人免疫球蛋白的制备工艺，属于生物制药领域。本发明在传统的5%低蛋白浓度的静注人免疫球蛋白的制备工艺的基础上，在提取过程中采用压滤法代替离心法；超滤时，将蛋白浓度调整至3%～6%，用0.5mol/L的NaOH调pH至6.4～6.6，然后加1mol/L磷酸－NaOH缓冲液调节电导率在T=19℃时测为0.175s/m～0.205s/m，调节好后，采用层析法，用离子交换柱进行上柱层析纯化；能够有效地去除杂蛋白，提高蛋白纯度，并且能够提高产品得率；使用麦芽糖或甘氨酸为保护剂，有利于提高静注人免疫球蛋白稳定性，甘氨酸作保护剂可满足了糖尿病患者临床使用；本发明可得到5-11%蛋白浓度的静注人免疫球蛋白。
文档编号A61K39/395GK101972479SQ201010534828
公开日2011年2月16日 申请日期2010年11月8日 优先权日2010年11月8日
发明者何淑琴, 姜国亮, 尧振, 徐建新, 梁小明 申请人:江西博雅生物制药股份有限公司