专利名称：星型多臂plga/peg两亲性嵌段共聚物及其应用的制作方法
技术领域：
针对目前尚无有效治疗手段延缓慢性阻塞性肺疾患(简称慢阻肺，C0PD)的病程或抑制小气道及肺实质的炎症，提供一种新型COPD药物载体材料，利用该材料可制备得到的多种剂型的肺靶向药物，通过静脉注射和吸入给药，达到治疗COPD的目的；其可增加药物对靶组织的指向性和滞留性，降低药物对正常细胞的毒性，减少剂量，提高药物制剂的生物利用度。
背景技术：
慢性支气管炎、慢性阻塞性肺气肿、慢性肺源性心脏病甚至心力衰竭、呼吸衰竭等医学上通称为慢性阻塞性肺疾患，据世界卫生组织统计报道，慢性支气管炎、肺心病等慢性阻塞性肺疾患已是世界上第四位死亡原因，且呈上升趋势，我国更为严峻。COPD在世界范围内的重要性和发病率的日益增加已引起广泛的关注，然而，COPD 的药物治疗鲜有进展，有的针对炎性过程，或针对结构细胞。有些特殊的治疗方法是阻止 COPD发生发展中炎症细胞进入气道以及肺实质，包括采用拮抗黏附分子和化学因子的药物，以及拮抗TNF-α和增加IL-10的治疗方法。目前抑制纤维化的疗法主要是针对转化生长因子-β 1和蛋白酶激活受体-2的研究。针对丝氨酸蛋白酶和MMP的抑制剂，阻止对肺的破坏，阻断肺气肿的发展。在新疗法治疗COPD的早期临床研究中，一个需着重考虑的问题是如何将药物有效地运送到周围肺病变区，以及寻找有效的生化标记物和导引技术，而不影响正常的组织和器官。设计和构建能够特异性导向病变器官、组织或细胞的靶向性传递系统，可将药物或显影剂富集于病变部位，而在正常部位分布很少，可以大大降低药物的毒副作用。靶向性给药还对研究疾病的发病机理、提高临床影像诊断的灵敏度、实现个性化治疗具有非常重要的意义，是目前临床治疗COPD的迫切需求。国内外有研究发现，粒径在5 30um范围内的药物分子通过被动靶向浓集于肺， 过小易到达肝，过大易在静注时栓塞。金属氧化物类、多肽与蛋白类(酶)、核苷酸类、糖类及其它生物活性小分子等具有主动靶向作用。金属氧化物或金属螯合物作为物理靶向材料，通过温场、磁场的导向作用，将包载药物的纳米粒子浓集或固定于生物体内的某一个特定部位或区域，并通过扩散和渗透作用使药物得以缓慢释放，且对周围正常组织不产生毒副作用。如在磁共振影像(MRI)中，为得到某一部位的清晰图像，防止其他器官干扰，通过磁靶向作用，将磁性对比剂富集到这个器官附近，药物形成高浓度区域，缓慢释放。多肽和蛋白类靶向分子包括单克隆抗体或抗体片段、RGD短肽类、细胞生长因子的受体等。单克隆抗体或抗体片段是最普遍的靶向分子，常用的抗体有抗血小板内皮细胞粘附分子(PECAM)-I抗体、抗肿瘤相关抗原(TAA)抗体、抗组织因子(TF)单克隆抗体一因子 VIKfactor, f VII)、抗血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体等，是炎症、心血管及肿瘤疾病靶向治疗中常用的靶向抗体分子。RGD短肽是指含精-甘-天冬序列片段的短肽分子，靶向于内皮细胞表面的整合素类粘附受体，可以调控内皮细胞与纤维蛋白原、层粘连蛋白的粘附，是药理学干预的主要靶标。
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糖类靶向分子包括乳糖、半乳糖为末端的糖蛋白、肝素等，作用于肝实质细胞(PC) 上的去唾液酸蛋白受体，该受体介导的胞吞作用使其携载的药物定向转运。天然或人工合成与SLeX结构类似的低聚糖，如甘草多糖、路易斯寡糖及其衍生物等，能与选择素特异性识别和结合，从而靶向到处于激活状态的血管内皮表面，阻断选择素的生理效用，达到抗炎的目的。理论上，如果我们能够设计同时高效载药和靶向分子的载体，通过靶向分子的主动靶向作用，将药物导向病变部位，即实现直接对病症细胞释放药物，可大大降低药物的全身毒副作用，将从根本上改变目前的COPD治疗现状。因此研究和发展多功能靶向性药物传递系统具有非常重要的意义，是当今医学界的迫切需求。基于以上需求的主动靶向药物的设计和合成，成为生物医药领域研究的核心挑战。要求药物载体分子在载靶分子、载药前后不仅具有稳定性、体内安全性，还要求具有多个活性基团以连接靶向分子、连接后不影响靶向分子的活性；具有灵活可调的亲水性和疏水性链段，可通过化学或物理结合包载诊断显影剂、治疗药物，实现高载药容量；具有相对简单的制备工艺，可制成不同剂型适应不同靶向部位、不同给药途径的需要。当前靶向药物由于存在靶点选择的不准确性，会引起免疫原性，单一靶点结合不强，会导致肝脏的快速清除作用或对肝脏或心脏造成损害，并导致给药系统的靶向效率很低。例如，最近用于乳腺癌治疗的曲妥珠单抗引起了的严重并发症，出现心衰和心功能下降，而抗血管生成靶向治疗药物的常常引起高血压等副作用。设计具有多个活性位点的载体分子，可以同时结合多个靶向分子和多种药物，实现靶向多价性和药物的协同作用，可以更加精确定位药物在病灶部位的分布，更快地促进病症消失。具有这些特性的候选载体有聚乳酸PLA，聚乙醇酸(PGA)以及共聚物(PLGA)， PLGA/聚乙二醇(PEG)类嵌段共聚物、PEG与聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚氰基丙烯酸丁酯、聚3-羟丁酸酯、壳聚糖和聚己内酯(PCL)的接枝或共混产物、聚乙烯亚胺(PEI)、聚酰胺-胺型(PAMAM)树枝状大分子(dendrimer)、聚丙二撑胺(PPI)和肽类树枝状大分子(含肽键结构)等。但已有的PLGA/PEG嵌段共聚物主要为线型共聚物，分子结构中缺乏可修饰位点， 无法连接有效剂量的靶向分子，不能满足体内靶向载体的要求。有的研究者在PLGA微球表面修饰多糖类聚合物，如壳聚糖等，增加表面的可修饰性功能基团，这种方法虽然可解决靶向分子的修饰问题，但是却丧失了 PLGA/PEG胶束的长循环功能。具有体内导向和靶向功能的载体材料尚处于初始研究阶段，缺乏系统性和规律性，迄今尚没有任何一种成功主动靶向药物传递载体用于临床COPD治疗。
发明内容
本发明采用具有优良生物相容性和两亲性的系列新型的星型多臂PLGA/PEG两亲性嵌段共聚物，其以PEG为亲水链段，PLGA为疏水链段，不改变聚合物化学成分，而是通过分子构型的改变调控其性能，保持了单聚物原有的生物安全性和性能可控性；并通过其丰富的可修饰端基，携带多种靶向分子，并在体内复杂环境中能灵活机动地导向靶分子，从而可极大提高体内与靶分子结合的能力；其两亲性结构可组装形成核壳胶束，星型多臂的分子构型可使胶束外壳的PEG亲水层更具有稳定性，从而可更有效保护载体不被人体网状内皮系统清除，实现体内长循环。有报道显示，相同分子量的六臂聚合物对于药物的包封率要高于线型共聚物，星型多臂PLGA/PEG两亲性嵌段共聚作为体内靶向药物载体将具有独特的优越性。PLGA/PEG两亲性嵌段共聚物胶束，其特征在于该嵌段共聚物具有星型多臂结构； 其以PEG为亲水链段，PLGA为疏水链段；该共聚物的端基携带靶向分子，并在体内复杂环境中能导向靶分子；其两亲性结构可组装形成核壳胶束，星型多臂的分子构型可使胶束外壳的PEG亲水层稳定。该共聚物胶束与靶向分子进行共价连接，靶向分子为糖分子、多肽或蛋白分子、核酸分子中的一种或多种。其中糖分子选自乳糖、半乳糖、甘露糖、甘草多糖、唾液酸化或者岩藻糖化N-乙酰氨基乳糖中的一种或多种；多肽或蛋白分子选自单克隆抗体或抗体片段、RGD肽、细胞生长因子的受体中的一种或多种，其中多肽或蛋白分子与端胺基 PLGA/PEG嵌段共聚物载体的连接，采用胺基偶连方法与端羧基载体偶连、羧基偶连方法与端氨基载体偶连或巯基偶连方法与端氨基载体偶连。如上所述的PLGA/PEG两亲性嵌段共聚物与药物分子制成的靶向复合载药胶束， 其特征在于，该胶束对两种以上靶向分子及药物分子体系进行组装，先分别连接靶向分子和药物分子，然后将两个体系混合，得到复合胶束；或在载体自组装载药以后，分步偶连每种靶向分子，得到复合胶束。上述共聚物胶束可包载纳米超顺磁四氧化三铁；该胶束包载纳米超顺磁四氧化三铁的嵌段共聚物的制备方法，其步骤如下将星型PLGA/PEG共聚物溶于疏水性有机溶剂中，将纳米四氧化三铁超声分散于有机相中，在高速搅拌下将有机相滴加到蒸馏水中，持续搅拌使有机溶剂挥发后即可得到包有铁磁流体的纳米胶束。如上所述的两亲性嵌段共聚物用于制备体内肺部器官的靶向药物载体中的应用； 如上所述的两亲性嵌段共聚物用于制备体内靶向治疗慢性阻塞性肺疾患的药物载体中的应用；如上所述的两亲性嵌段共聚物，其特征在于治疗慢性阻塞性肺疾患的药物为皮质类固醇或支气管扩张。发明详述如下(1)系列多臂星型PLGA/PEG嵌段共聚物胶束包载纳米超顺磁四氧化三铁纳米超顺磁四氧化三铁(SPIO)可用于磁靶向定位、MRI显影。制备方法是将星型 PLGA/PEG共聚物溶于疏水性有机溶剂中，将纳米四氧化三铁超声分散于有机相中，在高速搅拌下将有机相滴加到蒸馏水中，持续搅拌使有机溶剂挥发后即可得到包有铁磁流体的纳米胶束，如附图1所示。(2)星型PLGA/PEG嵌段共聚物与靶向分子的共价连接分别与糖、肽或蛋白、核酸靶向分子与载体分子的连接。(i)糖类分子，如乳糖、半乳糖、甘露糖、甘草多糖、唾液酸化及岩藻糖化N-乙酰氨基乳糖(sLeX及sLeA)等。对于不含胺基的糖类，对其羟基进行羧化后，通过羧基与端胺基星型PLGA/PEG嵌段共聚物进行偶连，对于含有胺基的糖类，直接用其氨基偶连。如图3所
7J\ ο(ii)多肽或蛋白类分子，如单克隆抗体或抗体片段、RGD肽、细胞生长因子的受体等。靶向分子或多肽及蛋白类药物分子与端胺基星型PLGA/PEG嵌段共聚物载体的连接，采用胺基偶连方法与端羧基载体偶连、采用羧基偶连方法与端氨基载体偶连、采用巯基偶连方法与端氨基载体偶连。对于蛋白质多肽类大分子与载体分子的偶连，考虑偶连后蛋白质的失活问题，因此将选择特定的蛋白质偶连剂，如sulfo-SMCC，在温和的条件下进行偶连， 尽量避免蛋白的失活。同时，在蛋白质的偶连反应中，由于蛋白的分子量较大，需要考虑靶向分子偶连后对共聚物结构以及自组装形态的影响。因此，采用两种偶连-组装方式先偶连后组装；或先组装后偶连。(iii)核酸配体(aptamer)分子。通过端胺基星型PLGA/PEG嵌段共聚物连接抗核酸抗体、亲合素-生物素、慢病毒、腺病毒等基因载体系统后再结合核酸分子；也可通过端氨基星型PLGA/PEG共聚物载体的正电荷作用直接结合核酸分子，通过电荷相互作用自组装形成高分子载体-核酸聚电解质复合物，但需要考虑核酸配体空间结构变化而引起的靶向性失活。(3)具有靶向分子的星型PLGA/PEG嵌段共聚物胶束的载药实验(i)抗体、核酸配体、药物前体(prodrug)类药物的连接，同上节。(ii)其它亲水、疏水性药物的胶束自组装方法，疏水性(以皮质类固醇为例)、亲水性(以异丙托溴铵为例)。对于疏水性药物，将星型PLGA/PEG嵌段共聚物、疏水性药物共同溶解于疏水性有机溶剂中，将该有机相缓慢滴加到大量蒸馏水中，持续搅拌，使有机溶剂蒸发，有机相固化后即可得到含有疏水性药物的纳米胶束，如附图2所示。对于亲水性药物，采用复乳法包埋，通过调节两亲性星型PLGA/PEG嵌段共聚物的亲水链段与疏水链段的比例，使其在水溶液中自组装形成纳米微囊结构，通过其内水相包载亲水性药物，如附图3 所示。为克服当前COPD治疗药物的半衰期短、易受酶解和难以通过肺毛细血管等缺点， 结合皮质类固醇和支气管扩张剂等多种临床有效COPD治疗药物，以达到更好的临床治疗效果。(4)多功能靶向复合载药胶束体系的组装及表征对于两种以上靶向分子及药物分子体系的组装，可以采用以上方法分别连接靶向分子和药物分子，然后将两个体系混合，得到复合胶束；也可以在载体自组装载药以后，分步偶连每种靶向分子，最终得到的复合胶束如图4所示。按照中国药典2005版的方法测定制备后胶束的载药量、包封率和体外释放。采用表面等离子共振检测技术，在检测芯片上固化对应的靶标分子，在模拟血流条件下测定修饰后纳米胶束与靶标分子之间的结合常数和结合量，动态、量化地评价载体靶向分子与靶标分子的结合活性，结合容量和结合稳定性。靶向载药复合物的临界胶束浓度拟采用芘为探针，用荧光方法测定。胶束的形态、尺寸、电性，分散度、平均聚集数及内核密度、聚集体稳定性拟通过低温扫描电镜(SEM)，透射电镜(TEM)、原子力显微镜(AFM)、动态光散射(DLS)、静态光散射 (SLS)、zeta电位仪等方法表征。采用表面红外光谱、X射线光电子能谱仪(XPQ、荧光及化学发光法测定靶向分子在纳米胶束中的结合量。(5)生物体外靶向定位性能研究(i)体外细胞培养研究多功能靶向载药纳米胶束的细胞靶向性、药物缓释性和生物利用度。采用双荧光探针分别标记胶束内药物和胶束表面的靶向分子，通过激光共聚焦显微镜动态观察纳米胶束在细胞黏附和细胞摄入过程中的状态，观察细胞过程、测定细胞
6摄入量；通过标记物及溶酶体检测试剂等，研究细胞摄入途径和机制，评价药物的体外生物利用度。(ii)在外磁场作用下，研究各种流变力学因素对测试系统内的磁性纳米胶束的定位性能的影响。(iii)采用离体肺灌流系统研究各种流变力学因素对活性聚合物黏附的影响。测定时，按一定流速灌注血液后，采用形态学或放射性核素的方法，观察血小板在内皮下组织的黏附情况。采用离体肺灌流系统研究各种流变力学因素对靶向纳米载药胶束的血管黏附影响。通过体外荧光标记法观察纳米胶束对血管损伤部位特异性结合情况，以及体内观察纳米胶束对靶向血管损伤部位以及黏附性的情况。(6)生物安全性评价根据生物材料国家评价标准，对靶向药物载体纳米胶束的生物安全性包括细胞毒性(如通过噻唑蓝比色法，即MTT法)等进行安全性评价；观察降解产物对局部生理环境的影响，包括PH值、离子浓度等；研究各种载药纳米粒子在体内的降解过程及分布；研究载体分子降解后共价或鳌合的靶向诊断与治疗分子的细胞毒性、免疫毒性及体内清除机制；采用小鼠急性毒性试验、致敏试验对新型聚合物进行初步生物安全性评价。本发明选用的治疗药剂，均是批准上市的或已经进入临床实验的药品，如皮质类固醇和异丙托溴铵。综上所述，本发明申请的内容未见文献报导，具有新颖性/创造性和切实的可行性。
1、附图1为磁性纳米胶束示意图。2、附图2为连接有靶向分子的载体包载疏水性药物示意图。3、附图3为连接有靶向分子的载体包载亲水性药物(如异丙托溴铵)所形成的微囊结构示意图。4、附图4两种以上载靶分子及靶药分子体系的混合示意图
权利要求
1.一种PLGA/PEG两亲性嵌段共聚物胶束，其特征在于该嵌段共聚物具有星型多臂结构；其以PEG为亲水链段，PLGA为疏水链段；该共聚物的端基携带靶向分子，并在体内复杂环境中能导向靶分子；其两亲性结构可组装形成核壳胶束，星型多臂的分子构型可使胶束外壳的PEG亲水层稳定。
2.如权利要求1所述的PLGA/PEG两亲性嵌段共聚物胶束，其特征在于胶束包载纳米超顺磁四氧化三铁。
3.如权利要求1所述的PLGA/PEG两亲性嵌段共聚物胶束，其特征在于所述共聚物胶束与靶向分子进行共价连接，靶向分子为糖分子、多肽或蛋白分子、核酸分子中的一种或多种。
4.如权利要求3所述的PLGA/PEG两亲性嵌段共聚物胶束，其特征在于糖分子选自乳糖、半乳糖、甘露糖、甘草多糖、唾液酸化或者岩藻糖化N-乙酰氨基乳糖中的一种或多种。
5.如权利要求3所述的PLGA/PEG两亲性嵌段共聚物胶束，其特征在于多肽或蛋白分子选自单克隆抗体或抗体片段、RGD肽、细胞生长因子的受体中的一种或多种，其中多肽或蛋白分子与端胺基PLGA/PEG嵌段共聚物载体的连接，采用胺基偶连方法与端羧基载体偶连、 羧基偶连方法与端氨基载体偶连或巯基偶连方法与端氨基载体偶连。
6.一种如权利要求1-5之一所述的PLGA/PEG两亲性嵌段共聚物与药物分子制成的靶向复合载药胶束，其特征在于，该胶束对两种以上靶向分子及药物分子体系进行组装，先分别连接靶向分子和药物分子，然后将两个体系混合，得到复合胶束；或在载体自组装载药以后，分步偶连每种靶向分子，得到复合胶束。
7.如权利要求2所述的包载纳米超顺磁四氧化三铁的嵌段共聚物的制备方法，其步骤如下将星型PLGA/PEG共聚物溶于疏水性有机溶剂中，将纳米四氧化三铁超声分散于有机相中，在高速搅拌下将有机相滴加到蒸馏水中，持续搅拌使有机溶剂挥发后即可得到包有铁磁流体的纳米胶束。
8.如权利要求1-6之一所述的两亲性嵌段共聚物用于制备体内肺部器官的靶向药物载体中的应用。
9.如权利要求1-6之一所述的两亲性嵌段共聚物用于制备体内靶向治疗慢性阻塞性肺疾患的药物载体中的应用。
10.如权利要求1-6之一所述的两亲性嵌段共聚物，其特征在于治疗慢性阻塞性肺疾患的药物为皮质类固醇或支气管扩张剂。
全文摘要
提供一种新型COPD药物载体材料，采用具有优良生物相容性和两亲性的系列新型的星型多臂PLGA/PEG两亲性嵌段共聚物，其以PEG为亲水链段，PLGA为疏水链段不改变聚合物化学成分；并通过其丰富的可修饰端基，携带多种靶向分子，并在体内复杂环境中能灵活机动地导向靶分子，从而可极大提高体内与靶分子结合的能力；其两亲性结构可组装形成核壳胶束，星型多臂的分子构型可使胶束外壳的PEG亲水层更具有稳定性，从而可更有效保护载体不被人体网状内皮系统清除，实现体内长循环；利用该材料可制备得到的多种剂型的肺靶向药物，达到治疗COPD的目的；其可增加药物对靶组织的指向性和滞留性，降低药物对正常细胞的毒性，减少剂量，提高药物制剂的生物利用度。
文档编号A61K49/12GK102464874SQ20101054111
公开日2012年5月23日 申请日期2010年11月12日 优先权日2010年11月12日
发明者王小倩, 王蕾, 韩双红 申请人:王小倩, 王蕾, 韩双红