专利名称：微小rna的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，尤其是微小RNA的新用途，即miR-17-5p和miR-20a 的新用途。
背景技术：
髓系抑制细胞(MDSCs)作为免疫抑制系统的重要组成部分在免疫应答中发挥广 泛的免疫抑制作用，尤其是T淋巴细胞。MDSCs在小鼠细胞特征性表达Ly 6C/G和CDllb表 面分子，而在人类细胞特征性的表面分子为⑶llb+CD33+HLA-DR_。小鼠⑶llb+Gr-Γ细胞通 过形态学、分子组成和功能学三方面分成了两个亚型单核细胞型(MO-MDSCs)类似炎症性 的单核细胞，表达Ly6C标记；低密度的多形核白细胞型(PMN-MDSCs)类似不成熟的白细胞， 表达Ly6G标记，它们都对T淋巴细胞有抑制作用。近年来研究发现肿瘤患者体内大量积聚 MDSCs,因此清除和改变MDSCs的功能成为近年来的研究热点。然而调节MDSCs功能的合理 机制始终难解，一些研究证实MDSCs调节JAK2-STAT3通路。STAT3 (信号传导子和激活子 3)转录因子使MDSCs扩增并且增加了小鼠肿瘤的免疫耐受。因此，抑制或沉默STAT3可以 抵抗MDSCs的作用从而促进机体对于肿瘤的免疫应答。
小干扰RNAs (MicroRNAs，miRNAs)是一类短小的非编码RNA。MicroRNAs这种非 编码调控RNA，是由机体自我产生，具有18-25个碱基，主要通过与靶基因信使RNA (mRNA) 3’ 非翻译区(3’ -UTR)配对结合来实现对基因的调控。在生理和病理条件下，MicroRNAs在 细胞增殖、细胞死亡、细胞分化发育、新陈代谢、病毒感染和肿瘤中均发挥着重要作用。许 多克隆于小鼠骨髓细胞的MicroRNAs调节着造血系统，同时MicroRNAs对于免疫细胞的发 育，固有免疫和适应性免疫起着决定性作用。MicroRNAs选择性的或高表达于免疫细胞，例 如miR-17 92，miR-155，miR-181和miR-223在骨髓和淋巴细胞的成熟、增殖、分化过程中有 “允许”作用。
肿瘤是危害人类身体健康的首要疾病之一，据报道癌症患者的平均生存率仅为5 年，而癌症治愈率只有20% -30%左右。过去十年我国虽然在肿瘤的防治方面取得了很大 进展，出现了许多新技术新方法，发展了多种抗肿瘤免疫治疗，但到目前为止，这些方法远 没有达到人们的预期效果，一个重要的原因就是缺少生物治疗。目前肿瘤治疗中发展最为 迅速的一个领域是靶向药物治疗，被大家广泛重视，同时基因治疗代表着未来肿瘤防治方 向。发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供miR-17_5p和miR-20a的新用途。通过沉默 STAT3，miR-17-5p和miR_20a减轻了 MDSCs的免疫抑制，成为作为制备应用miRNA免疫治 疗作用的药物来治疗一些疾病特别是肿瘤的切入点。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是
miR-17-5p具有抑制髓系抑制细胞积聚的用途。3
优选的，所述miR-17_5p通过阻碍髓系抑制细胞(MDSCs)的积聚从而具有抑制肿 瘤生长的用途。
优选的，所述肿瘤为结肠癌、肺癌或卵巢癌。
优选的，所述miR-17_5p在制备通过调节免疫细胞的表达抑制髓系抑制细胞积聚 以抑制肿瘤生长的靶向药物中的用途，即制备以miR-17-5p为靶点的药物来抑制肿瘤生长。
优选的，所述miR-17-5p在制备通过调节免疫细胞抑制结肠癌、肺癌或卵巢癌生 长的靶向药物中的用途。
miR-20a具有抑制髓系抑制细胞积聚的用途。
优选的，所述miR-20a通过阻碍髓系抑制细胞(MDSCs)的积聚从而具有抑制肿瘤 生长的用途。
优选的，所述肿瘤为结肠癌、肺癌或卵巢癌。
优选的，所述miR-20a在制备通过调节免疫细胞的表达抑制髓系抑制细胞积聚以 抑制肿瘤生长的靶向药物中的用途，即制备以miR-20a为靶点的药物来抑制肿瘤生长。
优选的，所述miR-20a在制备通过调节免疫细胞抑制结肠癌、肺癌或卵巢癌生长 的靶向药物中的用途。
本发明的有益效果是
本发明利用现代生物学技术和生物信息学分析对miR-17_5p和miR-20a的功能 进行了初步研究，发现miR-17-5p和miR-20a具有抑制MDSCs的功能，进而发现miR-17_5p 和miR-20a具有抑制肿瘤生长的用途，可以将miR-17_5p和miR-20a设计为靶向药物来治 疗肿瘤，对肿瘤临床免疫治疗有着潜在的巨大应用价值，并且为进一步研究miR-17-5p和 miR-20a的生物学功能奠定了基础。
图 1 是miR-17-5p 和 miR_20a 结合于 STAT3 3，UTR ；
图 2 是miR-17-5p 和 miR_20a 调节 STAT3 的表达；
图3是在体外，miR-17-5p和miR_20a减轻MDSCs的抑制作用；
图4是在体内，miR-17_5p和miR_20a减轻MDSCs的抑制作用，其中Al-大小、 A2-重量、A3-体积，Bl-重量、B2-体积；
图5是肿瘤相关因子调节miR-17_5p和miR-20a的表达，其中图5B1显示的是成 熟miR-17-5p的表达水平，图5B2显示的是成熟miR-20a的表达水平，图5B3显示的是STAT3 mRNA的表达水平；
图6是本研究中所用引物。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图及具体实 施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
实施例1
构建肿瘤小鼠模型、BMCs的制备以及miRNA基因和3’ -UTR的表达构建4
(1)肿瘤鼠模型的建立
使用4-6周的雌性的BALB/C鼠和C57BL/6鼠和裸鼠(北京动物中心)，实验前一 周将鼠饲养在不存在对鼠致病的病原体的环境内，保证鼠处于病原体免疫状态。实验构建 了 s. c.肿瘤模型(静脉注射肿瘤模型)，包括在BALB/C鼠内构建CD6结肠癌(ATCC)模 型，以及在C57BL/6鼠体内构建Lewis肺癌模型(ATCC)和1D8卵巢癌模型(Ruby，Texas大 学)。鼠皮下一次性注射100微升PBS (磷酸盐缓冲液)，内含5 X IO5肿瘤细胞。模型构建 时每个模型所注射的肿瘤细胞的数量是以在注射后3-4周内能形成一直径约为1. 5厘米的 肿瘤为依据的。
(2)细胞系和髓系抑制细胞的准备。
实验所需要的人的胚胎肾细胞系HEK493 T细胞，鼠的单核白细胞/巨噬细胞系 RAW264. 7和人的单核白细胞系U937均是从美国型培养菌种集(ATCC)购买的。鼠的髓系 抑制细胞(MDSCs)从骨髓细胞(BMCs)诱导获得，从模型鼠的股骨中收集BMCs，室温下悬浮 于aiilACK缓冲液5分钟，使红细胞裂解。T细胞和B细胞通过磁力珠进行选择，选择完成之 后，⑶4 T细胞，⑶8 T细胞和B细胞与BMCs的比例不超过1%。除非特殊说明，以下实施例 中所使用的BMCs均为经过上述选择获得的细胞。MDSCs从这些获得的BMCs诱导获得。首 先在M孔板内，37°C，5% C02的条件下，处理单核白细胞-粒细胞集落刺激因子(GM-CSF ； 20ng/ml)五天，在含有RPMI1640媒介和3% FCS，1 %青霉素和链霉素，以及经过处理的白 细胞-粒细胞集落刺激因子(GM-CSF ;20ng/ml)和IL-4(10ng/ml)的M孔转染板内，再将 5 X IO4的CT-26，Lewis或1D8肿瘤细胞分别与2 X IO6BMCs共培养。收集细胞并用流式细 胞仪进行分析。
鼠的MDSCs同样按照制造商(Miltenyi Biotech)提供的方法步骤使用Gr-1抗体 和LS柱的免疫磁珠从CD6肿瘤模型鼠的脾脏中分离获得，再使用抗Gr-I和CDllb抗体染 色后使用流式细胞分选进行分类。具体实现上，杀死CD6结肠癌模型鼠，以无菌注射器分 别从小鼠的脾脏和血液中获取细胞，使用水破坏红细胞，并进行血清封闭。用:3mlPBS悬浮 细胞，首先加入⑶8+T淋巴细胞、⑶4+T淋巴细胞和B淋巴细胞的抗体30 μ 1，在冰上静置15 分钟后，用PBS洗一遍；之后加入⑶4+Τ淋巴细胞、⑶8+Τ淋巴细胞和B淋巴细胞的阳性选定 的磁珠(MACS) 35 μ 1，冰上静置30分钟，用PBS洗两遍，得到不含⑶8+淋巴细胞、⑶4+Τ淋巴 细胞和B淋巴细胞的BMCs。提纯的脾的MDSCs 90%以上为Grl+⑶Ilb+细胞。
从脾脏制备单细胞悬液，使用ACK缓冲液除去红细胞。在使用这些单独的细胞前， 转染这些Grl+细胞并在肿瘤上清液中培养M小时。
(3)miRNA、siRNA 和 3' -UTR 的表达构建
从广东锐博生物公司购买miR-17-5p mimics 和 miR_20a mimics, miR-17-5p 的抑制物，miR-20a的抑制物以及miRNA抑制物的阴性对照。从广东锐博生物公司购买 STAT3 siRNA和siRNA阴性对照。从hvitrogen公司购买空白iT荧光寡核苷酸。从Open biosystem 公司购买 pCMV-SP0RT6/STAT3 完全编码序列(cDNA clone ID :3593588 Catalog No :MMM4769_99609717)的表达载体，此编码序列中包含一个miR-17_5p and miR_20a种子 序列的3’ UTR。使用引物，将鼠的基因组中的Pri-miR-17-5p和Pri_miR-20a基因于Hind III和Xho I位点克隆到pcDNA3. 1表达载体上。获得的构造物称为pcDNA3. l-miR-17_5p 和 pcDNA3. l-miR-20a。
通过PCR(聚合酶链式反应)的方法从鼠脾脏细胞的基因组DNA克隆STAT的 3，UTR,并将其在Me I和^CbaI位点连接到pIS2荧光素酶报告载体(Addgene)上。通过 PCR的方法构建了 STAT3的3 ‘ UTR的突变体，突变体经过质粒DNA测序进行确认，在图六 中列出了实验中所用的引物。
如图IAl所示，设计了 4种不同的引物并通过PCR的方法构建STAT的3’-UTR的突 变体(Mut) 1、突变体2。如图1A2所示，构建的荧光报告质粒包括种子序列1 (156-162，STAT3 3，UTR1)、种子序歹Ij 2(403-409, STAT3 3，UTR2)、突变种子序列 1 (STAT3 3，UTRl Mut)、突 变种子序列2(STAT3 3，UTR2 Mut)、种子序列1和种子序列2 (STAT3 3，UTR1+2)、突变种 子序列1和种子序列2(STAT3 3，UTRl Mut+2)或者种子序列1和突变种子序列2 (STAT3 3，UTRl+2Mut)。
PCR 条件
IOX扩增缓冲液IOul
4 种 dNTP 混合物各 200umol/L
引物各 10 IOOpmol
模板 DNA 0. 1 2ug
Taq DNA 聚合酶 2. 5u
Mg2+ 1. 5mmol/L
加双或三蒸水至IOOul
实施例2
验证miR-17-5p 和 miR_20a 与 STAT3 3，UTR 的绑定关系
应用荧光素酶报告基因来分析验证miR-17-5p和miR-20a与STAT3 3'UTR的绑定 关系。对于转染的肾(人胚肾)293T细胞，转染前一天用250毫升细胞密度为4X104的培 养基将细胞在48孔板进行铺板，按照说明书，将细胞与表达质粒、海肾荧光素酶报告质粒 和对照质粒(ftOmega)用脂质体2000 (Invitrogen公司)进行共转染，通过转染后24小时 使用双荧光素酶试剂盒测定海肾和萤火虫荧光素酶的活动，海肾荧光素酶的活性根据萤火 虫荧光素酶活性进行标准化并进行统计分析，统计分析采用检定的方法，95%的置信限度 被认为是有意义的，*(单一星号)P < 0. 05，**(双星号)P < 0. 01。转染了抑制剂阴性对 照的细胞作为对照组(Ctr.)，有pLS2-REP0RT-STAT3 3，UTR和miRNA对照结构物(miRctr) 的活性直接被设定为1。
具体实现为
1)转染用 STAT3 的 3，UTRU STAT3 的 3，UTRl 突变体，STAT3 的 3，UTR2、STAT3 的 3，UTR2 突变体禾口 STAT3 的 3，UTR1+2、STAT3 的 3，UTR1+2 的突变体分别与 pcDNA3. 1-pr i-miR17-5p(miR-17-5p)、pcDNA3. l-pri_miR-20a 或者对照结构物(miRctr)共转肾(人胚 肾)293T细胞。另外构建一组由miR-17-5p和miR-20a抑制剂分别在0. InMUOnM和IOOnM 浓度下转染的细胞。
2)制备被动裂解缓冲液IXPLB 将1倍体积的5XPLB (Passive LysisBuffer)加 到4倍体积的蒸馏水中，混合均勻，在4°C储存1个月。
3)制备 LAR II 用 Luciferase Assay Buffer II (目录号 E1980 105ml)溶解冻 干粉 Luciferase Assay Substrate，_20°C存储 1 个月。
4)制备 Stop & Glo 试剂加 0. 2ml 的 50 X Stop & Glo 酶到 IOml 的 Stop & Glo 缓冲液中，制成IXMop & Glo试剂。
5)按照说明书将细胞与表达质粒、海肾荧光素酶报告质粒和对照质粒(!Iomega) 用脂质体2000(InvitrOgen公司)进行共转染。
6)细胞裂解
(1)除去培养细胞中的培养基；
(2)用IXPBS清洗培养细胞，去掉清洗液；
(3)按48孔65ul将1 XPLB加入到培养孔中。
7)被动裂解
在室温轻缓晃动培养板15分钟，把裂解液转移到检测试管中。
8)转染后M小时测定海肾和萤火虫荧光素酶的活动
设置自动进样器1和2分别分装IOOul的LARII和Mop&Glo试剂。测量时，使用 1-2秒延迟和5-10秒读数，在萤光发光仪上(Luminometer)
(1)加入 20ulPLB 裂解液
(2)加入 lOOulLARII
(3)检测萤火虫萤光素酶
(4)加入 100uBtop&Glo 试剂
(5)检测海肾萤光素酶的活性
(6)其它孔如此循环操作。
如图IB所示，通过荧光素酶活性的比较可以看出，miR-17_5p和miR-20a都能够 直接的与STAT3 3，UTR的位置156-162 (Bi)和位置403-409 (B2)相互作用进而抑制报告 基因的表达。而STAT的3，UTR种子序列的突变体解除了 miR-17-5p和miR-20a的抑制活性。
如图IC 所示，显示了转染了 STAT3 3，UTR1+2 和 pcDNA3. l-pri-miR17-5p 或者 pcDNA3. l-pri-miR-20a以及浓度上升的miR-17_5p抑制剂(Cl)或者miR_20a抑制剂(C2) 的四31~细胞的荧光素酶活性，转染了抑制剂阴性对照的细胞作为对照组(Ctr.)。我们可以 看出miR-17-5p的抑制剂和miR-20a的抑制剂也能分别明显的阻塞miR-17_5p和miR_20a 对荧光素酶活性的负调控。
实施例3
STAT3 的表达被 miR-17_5p 和 miR_20a 调控
用空白iT荧光寡核苷酸转染单核白细胞/巨噬细胞系RA\^64.7。转染后M小时 用荧光显微镜观察结果如图2A所示。
使用Western印迹分析的方法和定时定量PCR的方法观察miR-17_5p和miR_20a 对STAT表达水平的影响。
(1)在室温下封闭液中与抗鼠STAT3和抗鼠p47phaX分别反应一个小时，通过用 过氧化物酶偶联的二抗(试剂盒)和增强化学发光剂(Amersham公司)对这种蛋白质抗体 复合物进行检测，其中抗鼠STAT3和抗鼠p47phax从SantaCruz Biotechnology公司获得。 具体实现为
1)转染按照说明书的步骤，通过核转染的方法，用miR-17-5pmimicS、miR-20a7mimics,STAT3 siRNA或者由miRNA mimics、miRNA抑制剂和siRNA阴性对照寡核苷酸混合 组成的阴性对照(Ctr.)分别转染7细胞，共转48小时后进行Western蛋白印迹分 析以检测STAT3，gp91和P47在各种共转条件下mRNA和蛋白表达。
2)蛋白样品的制备
1>倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液；
2>每瓶细胞加:3ml4°C预冷的PBS，平放轻轻摇动1分钟洗涤细胞，然后弃去洗液， 重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液，然后把培养瓶置于冰上；
3>按Iml裂解液加IOyL苯甲基磺酰氟(PMSF) (IOOmM)，摇勻置于冰上；
4>每瓶细胞加400 μ L含PMSF的裂解液，于冰上裂解30分钟，为使细胞裂解充分 培养瓶要经常来回摇动；
5>裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧，然后用加样器将细胞碎片 和裂解液移至1. 5ml离心管中；
6>4°C 12000rpm 离心 5 分钟；
7>将离心后的上清分装转移到0. 5ml的离心管中放平_20°C保存。
3)电泳
DSDS-PAGE 凝胶配制
SDS-PAGE凝胶使用SDS-PAGE凝胶配制试剂盒进行配置；
2>样品处理
在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，于沸水浴中加 热4分钟，以充分变性蛋白；
3>上样与电泳
冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE凝胶加样孔内即可。为了便于观 察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，使用预染蛋白质分子量标准，70V电压 至分离胶与浓缩胶界面，后120V电压至底。
4)转膜
1>取一块PAGE胶，浸泡于电转缓冲液中，同时把两张同样大小的滤纸和两张海绵 也浸泡于缓冲液中；
2>剪一块同样大小的PVDF膜，做如下处理首先浸于100%甲醇溶液10秒，然后 浸于去离子水中3分钟，最后浸于转移缓冲液中3分钟；
3>电转三明治顺序如下正极(白色)海绵
滤纸
PVDF 膜
蛋白胶
滤纸
海绵
负极(黑色)。
5)将三明治夹子放入预装有电转缓冲液的电泳槽中，加盖，接通电源恒压200V， 120分钟；
6)将完成后的PVDF膜用去离子水冲洗，放入5%脱脂奶粉中，室温60分钟；
7)分别加入一抗(抗鼠STAT3和抗鼠p47phax)，室温一小时，用TBST洗膜3次， 每次5分钟；
8)加入酶标二抗(试剂盒)，室温一小时，用TBST洗膜3次，每次5分钟；
9)ECL显色A液和B液按1 1混合加到膜上，暗室压片，显影液1分钟，定影液 1分钟。
(2) RNA 分离和定时定量 PCR(qRT-PCR)
对于基因和miRNA前体，qRT_PCR使用BIO-RAD荧光定量PCR设备，设计特异性的 引物。对于成熟的miR-17-5p和miR-20a，qRT-PCR使用应用生物系统公司的7900的一羟 色胺的序列检测系统的标准荧光定量PCR试剂盒。扩增U6的小RNA(用于成熟miRNA的， 应用生物系统公司)和GAPDH mRNA (用于基因和miRNA前体，应用生物系统公司)作为每 一个实验样品的内源性对照。所有的反应都平行进行三组。因为折叠产生的变化按照制造 商的说明(应用生物系统公司)采用-Δ ACt的方法进行计算。
结果如图2B1所示，miR-17-5p和miR_20a均能影响gp91，p47and STAT3的转录 和表达。miR-17-5p和miR-20a降低gp91和p47的转录但是对STAT3的转录影响不大。然 而与此同时,如图2B2所示，miR-17-5p和miR_20a降低了 STAT3 and p47的表达水平。
在RAW264. 7中，STAT3，gp91 and p47的转录和表达的相关水平通过用不用浓度的 miR-17-5p或miR-20a mimic转染进行检测。图2C1. 1和Cl. 2显示了在转染了 miR-17_5p mimics或miR-20a mimics的7中成熟的miR-17_5p和miR_20a各自的表达水平。图 2 的 C2. 1 和 C2. 2，C3. 1 和 C3. 2 以及 C4. 1 和 C4. 2 则分别显示了转录了 miR-17_5p mimics 或 miR-20a mimics 的 RAW264. 7 中 STAT3, gp91 和 p47 的转录水平。图 2 的 C5. 1 和 C5. 2 则显示了转染了 miR-17-5p mimics 或miR_20a mimics 的7 中 STAT3 的蛋白水平。 由定时定量PCR的结果我们可以发现随着miR-17-5p和miR-20a表达水平的升高，对于转 录了 miR-17-5p mimics 或 miR_20a mimics 的 7，细胞内的 STAT3 转录水平并无明 显的变化，gp91和p47的转录水平均逐渐下调；而由Western Blot的结果我们可以发现随 着转录的miR-17-5p和miR-20a浓度的升高，STAT3的蛋白水平明显下调。
实施例4
miR-17-5p和miR_20a对于MDSCs的潜在抑制作用的体外实验
(1)转染
用miR-17-5p mimics,miR-20a mimics, STAT3 siRNA或混合阴性对照(混合miRNA mimics阴性对照寡核苷酸和siRNA阴性对照寡核苷酸)转染7细胞。为了调查 肿瘤相关的Gr-Γ⑶Ilb+MDSC上在抗原特异性反应中的抑制作用，用miR-17_5p mimics和 miR-20a mimics, miR-17_5p抑制剂和miR_20a抑制剂，STAT3 siRNA或者它们的阴性对照 (miRNA mimics对照，抑制剂对照和siRNA对照的混合物)转染MDSCs (除非特殊说明每孔 5X IO5) ,Grl+CDlIb+MDSCs是从CD6肿瘤鼠的脾分离获得的。VLP(25 μ g/ml)刺激下，将转 染的MDSCs加入培养的脾的⑶4或⑶8 T细胞(1X106)。用miRNA、miRNA抑制剂或s iRNA 转染MDSCs，用人类乳头瘤病毒16的病毒样粒子(VLPs)免疫鼠脾内的单独的CD4和CD8T 细胞，两天后收取上层清液。VLPs分别的作为抑制因子、应答因子和刺激因子，所有的阴性 对照都不能影响STAT3的表达。使用ELISA检测上层清液中的IFN- y。VLPs特异性的⑶4 或CD8T细胞是与实施例1步骤O)的方法相同，使用CD4和CD8的阳性选择磁珠和LS柱子(Mitenyi Biotech)筛选获得的。
(2)酶联免疫吸附实验(ELISA)
ELISA夹心法酶联免疫试剂盒(Pierce Endogen)用于IFN-γ的定量检测。使用 SpectraMax190ELISA检测仪测定450nm时每个样品(上述步骤(1)中获取的上层清液)的 吸光度，细胞因子的水平通过标准曲线的三次滴定进行量化，单位为pg/ml。
(3) ROS 和 H2A 检测
按照说明书，使用氧化敏感染料DCFDA(分子探针/Invitrogen)测定7 或 MDSC 产生的 ROS (活性氧)。单个的 CDllb+Gr-I+MDSCs 在 2. 5 μ MDCFDA 和 30ng/ml PMA(Sigma-Aldrich公司购买)中处理30分钟，然后使用流式细胞分析进行分析；在冰 上，PBS收集细胞，使用以下的抗体(均从BD生物公司购买)异硫氰酸荧光素、聚乙烯和 与抗原呈递细胞结合的抗 CD4 (L3T4)、抗 CD8 α (Ly-2)、抗 CD 19 (1D8)、抗 CDllb (Ml/70)、 抗Gr-l(RB6-8(^)、抗Ly6G(lA^和抗Ly6C(AL21)抗体。清洗细胞两次并在含有4% 多聚甲醛和1 % FCS(胎牛血清)的PBS溶液中再悬浮，在进行流氏细胞分析(FAkan， BectonDickson)前将悬液在4°C条件下保存，每组分析过程都用同型的单克隆抗体对照作 为负对照。
H2O2的检测使用过氧化氢检测试剂盒(Invitrogen)，将IX IO4个细胞悬浮于PBS， 加入PMA(30ng/ml) 30分钟后，使用荧光分光光度计(Bio-Rad)测量37°C、560nm的吸光度。 吸光度的结果使用连续稀释20mM H2O2所做的标准曲线进行标准化。
如图3々所示，1^1 -17-5 和1^1 -2(^均能降低在1^^^64.7细胞中1 05仏1)的表达 和H202 (A2)的产生；如图;3B所示，miR-17-5p和miR-20a同样能够降低在肿瘤相关的MDSCs 中ROS的表达和H2O2的产生，其中图3的Bi. 1和B2. LBL 2和B2. 2以及Bi. 3和B2. 3分别显 不了转染了 miR-17-5p mimics (miR-17_5p. mi),miR-20a mimics (miR-20a. mi)，miR-17_5p 抑制剂(miR-17-5p. inh)和 miR_20a 抑制剂(miR-20a. inh)和阴性对照(Ctr.)的 MDSCs 中成熟miR-17-5p和miR-20a的表达水平、ROS的表达水平和H2A的产生，Geo代表几何平 均数；如图3C所示，miR-17-5p和miR-20a降低了肿瘤相关MDSCs的抑制潜能。miR-17_5p 和miR-20a阻塞了肿瘤相关MDSCs对于VUs特异性的CD4(C1，C2)和CD8T淋巴细胞(C3， C4)的影响效果。然而，miR17-5p和miR-20a抑制剂促进了肿瘤相关MDSCs对于VLPs特异 性的CD4(C1，C3)和CD8T淋巴细胞(C2，C4)的抑制效果。抑制率(Inhibition% )=在共 培养的T细胞中上清液所含有的IFN- γ的浓度加上MDSCs的抗原除以在共培养的T细胞 中上清液所含有的IFN- γ的浓度加上没有MDSCs的抗原，即
在共培养的τ细胞中上清液所含有的IFN- Y的浓度+MDSCs的抗原抑制率=_在共培养的T细胞中上清液所含有的IFN- γ的浓度+没有MDSCs的抗原
统计分析时采用了检定的方法，95%的置信限度被认为是有意义的，*(单个星 号)P < 0. 05，**(双星号)P < 0. 01。
实施例5
miR-17-5p和miR_20a对于MDSCs的潜在抑制作用的体内实验
在MDSC抑制的体内实验中，在接种了 CT46肿瘤细胞之后的第一天到第七天，将miR-17-5p mimics 和 miR_20a mimics、miR-17_5p 抑制剂和 miR_20a 抑制剂、STAT3 siRNA 或STAT3的阴性对照转染的MDSCs注射进入鼠的肿瘤内。对于miRNA mimics、miRNA抑 制剂、siRNA或者siRNA阴性对照的转染，在IOOnM的指示寡核苷酸浓度下，按照生产协议 (Amaxa，Germany)，运用核转染(nucleofection)的方法对BALB/C鼠的BMC进行转染，即杀 死小鼠取骨髓细胞，用1640培养基将BMC吹下来，加PBS离心；用PBS稀释至1*107/100 μ 1 个细胞，加质粒5 μ g\100 μ 1，混勻后放入电转仪；将电转仪调至Stemcell程序进行电转， 每次加样100 μ 1，电转后打入老鼠体内即可。5周龄小鼠首先皮下注射5*105CT46细胞，一 周左右后至肿瘤长至米粒般大小，每只鼠分别注射2X IO6个预先处理好的BMCs，在7、11、 15、19、23、27天后杀死小鼠。测量肿瘤的大小、重量、体积，肿瘤的测量使用卡尺，每组6只 鼠去平均值，误差线代表平均值士SD。统计分析时采用了检定的方法，95%的置信限度被认 为是有意义的，单个星号P < 0. 05，双星号P < 0. 01。
图4A显示了在7、11、15、19、23、27天杀死小鼠，用对照组(天然鼠)与分别移植了 转染了 miR-17-5p mimics,miR-20a mimics 或者 STAT3 siRNA(STAT3siRNA)的 MDSCs 的鼠 体内肿瘤的大小(Al)、重量(A2)、体积(A3)进行比较。与移植了用对照转染的MDSCs(Ctr.) 接种过疫苗的CT-沈肿瘤鼠相比，在移植了转染了 miR-17-5p mimics, miR-20a mimics或 者STAT3 siRNA的MDSCs的鼠体内，肿瘤生长速度减慢。因此miR-17_5p，miR_20a或者 STAT3siRNA能够减轻MDSCs的抑制潜能。
图4B显示了肿瘤的重量(Bi)和在7、11、15、19、23、27天杀死小鼠，移植了用对 照、miR-17-5p 抑制剂(miR-17_5p. inh)、miR_20a 抑制剂(miR_20a. inh)转染的 MDSCs 的 鼠体内肿瘤的体积(B2)，与移植了用对照转染的MDSCs(Ctr.)接种过疫苗的CT46肿瘤鼠 相比，在移植了转染了 miR-17-5p抑制剂(miR-17-5p. inh)，miR_20a抑制剂(miR_20a. inh) 的MDSCs的鼠体内，肿瘤生长加快，因此miR-20a抑制剂和miR-17_5p抑制剂加强MDSCs的 抑制潜能。
实施例6
肿瘤相关因素调节miR-17_5p和mir-20a的表达
(1)流式细胞分析对MDSCs分群
使用研磨法分别从患有CD6结肠癌、Lewis肺癌和1D8卵巢癌的小鼠的脾脏中取 细胞制备单细胞悬液
1)小鼠用C02处死，立即无菌取脾；
2)将脾浸入装有冷PBS的培养皿中，用钝头剪刀剪去白色的结缔组织，换入另一 个装有冷PBS的培养皿中以清洗脾脏；
3)再次换入一个装有冷PBS的培养皿中；
4)用小的弯头手术剪剪切脾脏成3mm左右的小块；
5)用IOml塑料一次性注射器的尾部背面轻轻按压研磨脾脏小块，此时会看到很 多脾单细胞进入PBS中；
6)使用Falcon(BD生物公司)过滤获得单细胞悬液，用冷PBS洗涤2次，每次 1000r/min，离心 10 分钟；
7)将细胞悬浮于RPMI 1640(含10%热灭活胎牛血清)中，用台酚兰染色计数活 细胞数(在95%上)；11
8)调节细胞浓度为2 X IO6细胞/ml。
从BD生物公司购买异硫氰酸荧光素、聚乙烯和与抗原呈递细胞结合的抗 CD4(L3T4)、抗 CD8a(Ly-2)、抗 CD19(1D8)、抗 CDllb (Ml/70)、抗 Gr-1 (RB6-8C5)、抗 Ly6G(lA8)和抗Ly6C(AL21)抗体。细胞染色后在含有4%多聚甲醛和FCS (胎牛血清) 的PBS溶液中再悬浮，得到MDSCs。在进行流氏细胞分析(FAkan，Becton Dickson)前将 悬液在4°C条件下保存，每组分析过程都用同型的单克隆抗体对照作为负对照。
如5A1所示，通过流式细胞分析，可以对MDSCs进行分群，包括Pl (⑶llb+Gr-Γ细 胞)及它的两个亚群P2 (Ly6C+ly6G+细胞)和P3 (ly6G 口 ly6C+细胞)。
(2) qRT-PCR
使用qRT-PCR 的方法检测肿瘤相关的 MDSCs 中 pri-miR-17_5p，pri_miR-20a， STAT3 和 GAPDH 的表达水平。肿瘤相关的 MDSCs 中 pri-miR-17_5p，pri_miR-20a，STAT3 和GAPDH的表达水平如图5A2所示；从CT26肿瘤鼠(CT26)、Lewis肿瘤鼠(Lewis)和 1D8肿瘤鼠(1D8)的脾获得的MDSCs中，成熟miR-17_5p，成熟miR_20a和STAT3在 Grl+CDlIb+MDSCs (A3) ,LyeG+LyeC+MDSCs (A4)和 LyeGl^eC+MDSCs (A5)的表达水平如图 5A3、 A4、A5所示，从CT26结肠癌鼠、Lewis肺癌鼠和1D8卵巢癌鼠体内的MDSCs内，miR-17_5p 和miR-20a的表达水平降低。
将BMCs细胞和CD6肿瘤细胞在一个培养瓶内培养。使用qRT-PCR的方法检测成 熟miR-17-5p(图Bi)和成熟miR_20a(图B2)和STAT3 mRNA(图B3)的表达水平，图5B1 显示的是成熟miR-17-5p的表达水平，图5B2显示的是成熟miR_20a的表达水平，图5B3 显示的是STAT3 mRNA的表达水平。由结果我们可以得出结论肿瘤相关因子调节骨髓细胞 (BMCs)中 miR-17-5p、miR-20a 和 STAT3 的转录。
(3) Western蛋白印记分析
将BMCs细胞和CD6肿瘤细胞在一个培养瓶内培养，使用western blot检测 STAT3的蛋白水平，方法如前所述。如图5C所示，肿瘤相关因子调节STAT3和p47在BMCs 中的水平。
可见，miR-17-5p和miR-20a为具有减缓髓系抑制细胞(MDSCs)抑制作用等功能 的新分子，在免疫应答中发挥重要作用。通过本发明研究发现miR-17-5p和miR-20a功能 之一就是调节STAT3表达量，而STAT3与肿瘤等疾病有着很密切的联系。
在肿瘤患者体内发现MDSCs的大量积聚，参与肿瘤细胞的免疫编辑，包括免疫清 除，免疫对抗，免疫逃逸三个过程，因此抑制MDSCs的表达则很可能成为有效治疗肿瘤的手 段，本发明中miR-17-5p和miR-20a则通过调节STAT3表达来降低MDSCs的积聚，因此本发 明具有积极的效果和意义。
STAT3 表达量可以被 miR-17-5p 和 miR_20a 调节，通过 miR-17_5p 和 miR_20a 结合 STAT3 3，UTR结合位点。转染miR-17-5p和miR_20a后，由STAT3调节的ROS和H2O2的表 达量显著下降。miR-17-5p和miR-20a转染MDSCs后，降低了抗原特异性⑶4和⑶8阳性T 淋巴细胞的免疫抑制。重要的是，miR-17-5p和miR-20a降低了 MDSCs的抑制性，在小鼠肿 瘤MDSCs中转染了 miR-17-5p和miR_20a之后肿瘤的生长速度要比未转染的慢，然而作为 对照组，在小鼠肿瘤MDSCs中转染miR-17-5p和miR-20a的抑制物之后肿瘤的生长速度明 显加快。在肿瘤鼠中miR-17-5p和miR-20a的表达水平比未患病小鼠低，肿瘤相关因子下调miR-17-5p和miR_20a的表达量。可以预见，在肿瘤患者体内，miR-17_5p和miR_20a发 挥着打破肿瘤免疫耐受的重要作用，从而揭示了 miR-17-5p和miR-20a可以作为免疫治疗 肿瘤的靶向分子。
上述参照具体实施方式
对该微小RNA的新用途进行的详细描述，是说明性的而不 是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的 变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
权利要求
1.miR-17"5p在制备通过调节免疫细胞的表达抑制髓系来源抑制细胞积聚以抑制肿瘤 生长的靶向药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的miR-17-5p的新用途，其特征在于所述miR-17_5p在制备 通过调节免疫细胞抑制结肠癌、肺癌或卵巢癌生长的靶向药物中的用途。
3.miR-20a在制备通过调节免疫细胞的表达抑制髓系来源抑制细胞积聚以抑制肿瘤生 长的靶向药物中的用途。
4.根据权利要求3所述的miR-20a的新用途，其特征在于优选的，所述miR_20a在制 备通过调节免疫细胞抑制结肠癌、肺癌或卵巢癌生长的靶向药物中的用途。
全文摘要
miR-17-5p在制备通过调节免疫细胞的表达抑制髓系来源抑制细胞积聚以抑制肿瘤生长的靶向药物中的用途，即制备以miR-17-5p为靶点的药物来抑制肿瘤生长；miR-20a在制备通过调节免疫细胞的表达抑制髓系来源抑制细胞积聚以抑制肿瘤生长的靶向药物中的用途，即制备以miR-20a为靶点的药物来抑制肿瘤生长，对肿瘤临床免疫治疗有着潜在的巨大应用价值，并且为进一步研究miR-17-5p和miR-20a的生物学功能奠定了基础。
文档编号A61P35/00GK102038703SQ20101055165
公开日2011年5月4日 申请日期2010年11月19日 优先权日2010年9月27日
发明者刘乔飞, 张园, 张苗苗, 杨荣存, 王萌萌, 陈颖莹 申请人:南开大学