一种肺肿瘤实验动物模型的构建方法

专利名称：一种肺肿瘤实验动物模型的构建方法
技术领域：
本发明涉及疾病的实验动物模型构建领域，具体涉及一种肺肿瘤实验动物模型的 构建方法。
背景技术：
近年来，随着动脉化疗栓塞、经皮消融(射频、微波、激光、冷冻)和经皮放射性粒 子植入等介入微创技术在肺部肿瘤的广泛应用，给大多数中晚期患者带来了控制病灶甚至 治愈的希望。但相关介入技术的基础实验研究却相对滞后，其主要原因之一是目前国内外 常见的肺肿瘤动物模型，多应用于病因及发病机制的研究，例如化学诱导模型、转基因鼠 模型和肿瘤异种移植模型等。不同的实验模型适用于不同的研究目的，其中可移植性的肿瘤实验模型如VX2瘤 在鼠和兔子上已经取得了成功，然而由于这些动物体型较小，造成应用相当局限。比较成熟 的、适合于介入治疗研究的大动物肺肿瘤模型却相对罕见。犬传染性性病肿瘤(Canine transmissible venereal tumor, CTVT)是一种犬类 动物生殖系统自然发生的圆细胞类肿瘤，传播主要以性接触为主，也可经舔咬传播。CTVS肿瘤具有以下几个特点第一，可靠的稳定性既往研究表明体外培养的 CTVT肿瘤细胞与移植性肿瘤的生物学特性均与原发肿瘤相似，没有显著的差异；第二，原 位移植的多样性=CTVT没有明显的组织特异性，可以在多种组织内进行生长，能够模拟多 种器官肿瘤的特性；第三，异种移植性CTVT的接种需要新鲜肿瘤组织，可以先移植至鼠建 立转移性的肿瘤，移植鼠的肿瘤组织又可以成功的接种到犬体内而致瘤，并且通过细胞学、 组织学及分子生物学研究均证实细胞的特性没有发生改变；第四，良好的模拟性，Ahrar等 研究表明将新鲜的CTVT组织浆液经皮注入或经动脉注入肺内可以很好的模拟人类肿瘤生 长及转移的模式。正是由于CTVT的上述特点，使其具备了成为移植瘤的必要条件。同时，CTVT —方 面解决了原位移植的问题，另一方面使移植肿瘤的各项指标接近人类疾病。动物犬的生活 习性与人类近似，体型较大，是非常适合行介入等研究的实验动物。肺移植瘤种植方式主要有以下几种第一种，移植瘤细胞悬液或组织浆液经皮穿刺植入。如国外Ahrar的实验中即采 用组织浆液，组织浆液或细胞悬液可经皮穿刺由较细穿刺针(20-22G)植入，其优点是创伤 小，操作容易，缺点是容易出现反流、弥散及胸膜种植等。第二种，组织块开胸植入，该种方法操作复杂，创伤较大，极易出现气胸、血胸等并 发症，轻者影响成瘤率，重者危及性命，导致动物实验成功率不高。第三种，组织块经皮穿刺植入，此方法理论上可有效避免细胞反流所致的胸膜种 植，但所需穿刺针较粗，其成功率及并发症在国内外未见相关报道。因此，利用肺移植瘤种植方式建立一个行之有效、成功率高的大动物肺肿瘤模型， 成为目前实验研究的迫切要求。
发明内容
针对上述缺陷，本发明的目的是提供一种肺肿瘤实验动物模型的构建方法，利用 CTVT肿瘤经皮穿刺建立一个成功率高的大动物肺肿瘤模型，满足目前实验研究的迫切要 求。为实现上述目的，本发明采用了以下的技术方案一种肺肿瘤实验动物模型的构建方法，包括以下步骤步骤一，在接种前4天开始予待接种犬口饲环孢霉素10mg/kg ；步骤二，制备CTVT组织块；步骤三，接种以16G导引穿刺针穿刺至预定靶部位，将CTVT组织块2-3枚置入穿 刺针内，并在CTVT组织块后放置无菌明胶海绵条，针芯将其推入肺组织后拔针。依照本发明较佳实施例所述的构建方法，所述CTVT组织块是无菌条件下以圆刀 片配合眼科剪将接种传代的CTVT肿瘤组织切制成，并且浸在Hank's液中冰存的1.5-2. Omm 的组织块。依照本发明较佳实施例所述的构建方法，在步骤一中，所述待接种犬在接种前4 天口饲环孢霉素，每日2次，两周后每日1次。依照本发明较佳实施例所述的构建方法，在步骤三中，在接种前晚对接种犬禁食、 禁水。依照本发明较佳实施例所述的构建方法，在步骤三进一步包括选择预接种点以 及理想穿刺点，并在消毒铺巾后，标记进针点。依照本发明较佳实施例所述的构建方法，所述肿瘤组织通过以下方式制备CTVT新鲜瘤株在Beagle犬皮下传代，6_8周后取CTVT荷瘤犬1只，消毒，铺巾，在 全麻条件下取出肿瘤组织，剔除周围包膜、肌肉、腱膜及血管，并置入Hank’ s液中。依照本发明较佳实施例所述的构建方法，所述接种是在全麻条件下取出肿瘤组织 后2小时内进行的。依照本发明较佳实施例所述的构建方法，所述待接种犬的平均体重为 10. 56 士 1. 86kg。由于采用了以上的技术方案，使得本发明相比于现有技术，具有如下的优点和积 极效果第一，本发明以CTVT细胞为瘤株，利用该细胞的可移植性及遗传稳定的特性，通 过肿瘤皮下细胞传代，制作肿瘤组织块，并以微创介入的方法进行肺内种植，在国内首次建 立了犬移植性肺癌模型，同时优化了国外报道的该模型的制作方法，可以广泛应用于大型 动物肺部肿瘤的生长、侵犯和转移等相关实验研究，也对于介入等治疗方法的疗效及监测 提供了合适的动物模型。第二，本发明采用的CTVT组织块接种方式，操作更加简单，成功率更高，成瘤周期 缩短，易于复制，成瘤后的胸腔积液及转移情况较少见，成瘤犬一般状态好，利于后续实验 的进行。第三，本发明采用了定向穿刺的方法，种植的目的性强，可以得到期望的肺叶成 瘤，有利于制作适合不同研究目的的肿瘤模型。
当然，实施本发明内容的任何一个具体实施例，并不一定同时达到以上全部的技 术效果。


图1是本发明一种肺肿瘤实验动物模型的构建方法的流程图。
具体实施例方式
本发明的核心思想在于，以CTVT细胞为瘤株，利用其可移植性及遗传稳定的特 性，通过肿瘤皮下细胞传代，制作肿瘤组织块，并以微创介入的方法进行肺内种植，建立了 犬移植性肺癌模型，可以应用于大型动物肺部肿瘤的生长、侵犯和转移等相关实验研究。为便于理解以下结合附图，对本发明所提供方法的较佳实施例做进一步详细叙 述。本发明提供一种肺肿瘤实验动物模型的构建方法，包括以下步骤SlOl 在接种前4天开始予待接种犬口饲环孢霉素10mg/kg ；S102 制备 CTVT 组织块；S103 接种以16G导引穿刺针穿刺至预定靶部位，将CTVT组织块2-3枚置入穿刺 针内，并在CTVT组织块后放置无菌明胶海绵条，针芯将其推入肺组织后拔针。实施例为了便于对比实验效果，在本实施例中以CTVT细胞悬浮液穿刺接种与CTVT细胞 组织块穿刺置入接种两种方式分组对比来说明。一、实验前准备1、将实验动物及分组纯种Beagle犬18只，平均体重10. 56士 1. 86kg，随机分为两组CTVT组织块组6 只、CTVT细胞悬液组12只，每组雌雄均等。2、传代取瘤将CTVT新鲜瘤株先在Beagle犬皮下传代，6-8周后取CTVT荷瘤犬1只，消毒、铺 巾，全麻下取出肿瘤组织，剔除周围包膜、肌肉、腱膜及血管，置入Hank’ s液中。二、实验接种物制备1、CTVT细胞悬液的制备无菌条件下以圆刀片配合眼科剪将肿瘤组织切制成细碎组织块，细胞过滤筛分离 细胞和组织，离心去上清，沉淀物经Hank’ s液处理，苔盘蓝法细胞染色，行细胞活力测定后 调整活细胞浓度达到108/ml，抽取1. Oml肿瘤细胞悬液，置于冰上。2、CTVT组织块的制备无菌条件下以圆刀片配合眼科剪将肿瘤组织切制成1.5-2. Omm小组织块，浸入 Hank’ s液的试管中，置于冰上。三、肺内接种1、所有待接种犬接种前4天开始口饲环孢霉素10mg/kg，2次/日，两周后每日1 次，接种前晚犬禁食、禁水。接种时犬全麻后取仰卧位固定，CT胸部平扫，选择预接种点及 理想穿刺位点，消毒铺巾后，以标记物标记进针点，重复扫描确认。
2、CTVT细胞悬液组以22G Chiba针穿刺预定靶部位，1. Oml肿瘤细胞悬液经针尾 缓慢、勻速注入，后以0. 2ml空气将针内液体推空，拔针后行CT扫描。3、CTVT组织块组以16G导引穿刺针穿刺至预定靶部位，取肿瘤组织块2_3枚置 入穿刺针内，瘤块后放置无菌明胶海绵条2块，用针芯推入肺组织后拔针。拔针后重复CT 扫描，观察肺内情况，两组接种时间控制在取瘤后2小时内。三、接种的成功率及并发症1、CTVT细胞悬液接种组 所有犬均按原计划接种成功，技术成功率达100%。少量皮下气肿1例，少量气胸 3例，肺内出血2例，患犬均无气急、气促、呼吸困难等不适症状，无大量血、气胸等致死性并 发症发生。2、CTVT组织块接种组所有犬均按原计划接种成功，技术成功率达100%。穿刺过程中未见皮下气肿，少 量气胸4例，实验犬均无气急、气促、呼吸困难等不适症状，无其它致死性并发症发生。四、观察接种犬的成瘤率行胸部CT平扫监测。
1、CTVT细胞悬液接种组12只犬中9只犬最终肺内成瘤，接种成瘤率为75%。15个接种点至第10周观察 最终10个成瘤，成瘤率为66. 67%。肿瘤至第10周最大可达3. 5cm。6只犬可见胸壁及皮 下种植，其中5只发生于肺内成瘤犬，1只犬仅见胸壁种植，肺内未成瘤，但该犬有大量胸腔 积液。2、CTVT组织块接种组6只犬12个接种点最终全部肺内成瘤，接种成瘤率为100%。肿瘤最大可达 3. 85cm。2只犬于第10周时发现肺内多发转移灶，大小约0. 3cm，位于其它肺叶内。五、观察肺部肿瘤的生长情况行胸部CT平扫监测。1、CTVT细胞悬液接种组接种后第2-4周内各犬均未见肿瘤生长。第5周仅2只犬可见肺内成瘤，直径约0. 3cm,圆形，边缘光滑。第6周9只犬肺内成瘤，肿瘤呈圆形，边缘光滑，密度均勻，肿瘤直径0. 3-1. 4cm, 肿瘤最大层面均径约1.059士0. 113cm，纵隔淋巴结无肿大，未见胸腔积液。第7周肿瘤呈圆形，边缘光滑，但部分相邻病灶可见融合，形状变得不规则，肿瘤 大小不等，主病灶直径0. 6-2. 9cm ；2只接种犬可见少量胸腔积液及纵隔淋巴结肿大。第10周肺内接种肿瘤平均直径约为2. 189士0. 153cm，最大达3. 5cm，所有接种犬 均出现中_大量胸腔积液，心包积液，前纵隔淋巴结明显肿大，部分病犬胸膜呈“飘絮”样增 厚。2、CTVT组织块接种组接种后第2-4周内各犬肺内均未见肿瘤生长。第5周所有犬肺接种区内见肿瘤生长，直径0. 2-0. 6cm，呈圆形，边缘光滑，密度 均勻。
第6周所有犬肺接种区均成瘤，肿瘤最大径线为0. 8-2. 3cm ；肿瘤呈类卵圆形，部 分形态欠规则，肿瘤最大层面均径1. 716士0. 102cm，肿瘤边界清楚，密度均勻；纵隔淋巴结 无肿大，无胸腔积液。第10周肿瘤继续增大，肿瘤最大层面均径2. 734士0. 138cm，边缘清楚，4只肿瘤 内部见少许坏死征象，未发现胸腔积液、纵隔淋巴结肿大及远处器官转移。六、尸检病理造模犬第10周处死，行尸检和病理学检查。1、CTVT细胞悬液接种组尸检发现双侧大量淡红色胸腔积液，局部呈包裹性积 液，壁、脏层胸膜见数量不等之小结节，胸膜腔内见大饼状网膜结构，表面密布大小不等之 红色颗粒，切面呈白色鱼肉状，与肺内肿瘤切面相同；肺内见最大直径约3. 5X3. 0X2. 8cm 肿瘤，肿瘤周围见1-3个0. 5cm左右结节。纵隔淋巴结广泛转移，且相互融合，以前纵隔明显，并伴有心包积液。2、CTVT组织块接种组肺内肿瘤大小和形态与细胞悬液接种组差别不大，但未见 到明显胸腔积液、胸膜结节及淋巴结增大。两组病理学检查基本相同CTVT肿瘤边界清楚，质韧均勻，呈膨胀性生长，肿瘤切 面呈鱼肉状，外缘为质韧、厚度均勻的白色包膜，肿瘤中心无明显坏死，临近支气管及血管 呈受压改变，但无明显侵犯征象。组织学上CTVS瘤巢由大片多形性的肿瘤细胞构成，肿瘤 细胞核浓染，内有粗大成群的染色质和明显增大的核仁。并可观察到大量的有丝分裂现象。通过具体实施例表明，CTVT组织块的接种并未因使用较粗的穿刺针(16G)而使血 胸、气胸的情况有所增加，而且成瘤率高，胸壁种植及胸腔积液等的发生率低，植入过程中 因无推注过程中的肿瘤细胞返流、弥散，使细胞悬液组常见的胸腔及胸壁种植情况大大降 低，从而提高了实验犬的生存时间，为后续实验创造了有利条件。此外，CTVT组织块制作相对简单，操作容易，可大量节省时间，且成瘤时间缩短，肿 瘤平均直径较大。总之，本发明的CTVT组织块接种方式相比于细胞悬液的接种方式具备明 显优势，是制作犬CTVT肺移植瘤模型的理想模式。综上所述，本发明相比于现有技术，具有如下的优点和积极效果第一，本发明以CTVT细胞为瘤株，利用该细胞的可移植性及遗传稳定的特性，通 过肿瘤皮下细胞传代，制作肿瘤组织块，并以微创介入的方法进行肺内种植，在国内首次建 立了犬移植性肺癌模型，同时优化了国外报道的该模型的制作方法，可以广泛应用于大型 动物肺部肿瘤的生长、侵犯和转移等相关实验研究，也对于介入等治疗方法的疗效及监测 提供了合适的动物模型。第二，本发明采用的CTVT组织块接种方式，操作更加简单，成功率更高，且成瘤时 间缩短，肿瘤平均直径较大，易于复制，成瘤后的胸腔积液及转移情况较少见，成瘤犬一般 状态好，利于后续实验的进行。第三，本发明采用了定向穿刺的方法，种植的目的性强，可以得到期望的肺叶成 瘤，有利于制作适合不同研究目的的肿瘤模型。本发明较佳实施例只是用于帮助阐述本发明。较佳实施例并没有完全详尽叙述所 有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式
。显然，根据本说明书的内容，可作很 多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地利用本发明。本发明仅受权利要求书 及其全部范围和等效物的限制。
权利要求
1.一种肺肿瘤实验动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤 步骤一，在接种前4天开始予待接种犬口饲环孢霉素10mg/kg ；步骤二，制备CTVT组织块；步骤三，接种以16G导引穿刺针穿刺至预定靶部位，将CTVT组织块2-3枚置入穿刺针 内，并在CTVT组织块后放置无菌明胶海绵条，针芯将其推入肺组织后拔针。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述CTVT组织块是无菌条件下以圆刀 片配合眼科剪将接种传代的CTVT肿瘤组织切制成，并且浸在Hank's液中冰存的1.5-2. Omm 的组织块。
3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在步骤一中，所述待接种犬在接种前4 天开始口饲环孢霉素，每日2次，两周后每日1次。
4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在步骤三中，在接种前晚对接种犬禁 食、禁水。
5.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在步骤三进一步包括选择预接种点以 及理想穿刺点，并在消毒铺巾后，标记进针点。
6.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述肿瘤组织通过以下方式制备 CTVT新鲜瘤株在Beagle犬皮下传代，6_8周后取CTVT荷瘤犬1只，消毒，铺巾，在全麻条件下取出肿瘤组织，剔除周围包膜、肌肉、腱膜及血管，并置入Hank’ s液中。
7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述接种是在全麻条件下取出肿瘤组 织后2小时内进行的。
8.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述待接种犬的平均体重为 10. 56 士 1. 86kg。
全文摘要
本发明提供一种肺肿瘤实验动物模型的构建方法，包括步骤一，在接种前4天开始予待接种犬口饲环孢霉素10mg/kg；步骤二，制备CTVT组织块；步骤三，以16G导引穿刺针穿刺至预定靶部位，将CTVT组织块2-3枚置入穿刺针内，并在CTVT组织块后放置无菌明胶海绵条，针芯将其推入肺组织后拔针。本发明以CTVT细胞为瘤株，利用其可移植性及遗传稳定的特性，通过肿瘤皮下细胞传代，制作肿瘤组织块，并以微创介入的方法进行肺内种植，建立了犬移植性肺癌模型，可以应用在大型动物肺部肿瘤的生长、侵犯和转移等相关实验研究。
文档编号A61B17/34GK102048757SQ20101059352
公开日2011年5月11日 申请日期2010年12月17日 优先权日2010年12月17日
发明者刘士远, 刘洪超, 孙志超, 安潇, 王智, 肖湘生, 董伟华, 高守红 申请人:中国人民解放军第二军医大学