专利名称：法倔唑在诱导罗非鱼已分化卵巢转变为功能型精巢中的应用及其诱导方法
技术领域：
本发明属于鱼类遗传育种技术领域，涉及芳香化酶抑制剂法倔唑(Fadrozole)在 诱导罗非鱼已分化卵巢转变为功能型精巢中的应用，以及利用法倔唑诱导罗非鱼已分化卵 巢转变为功能型精巢的方法。
背景技术：
罗非鱼又称非洲鲫鱼，具有食性杂、生长快、繁殖强、味道鲜美且肌间刺少等优良 特征，现已成为世界性主要养殖鱼类之一，主要养殖品种有莫桑比克罗非鱼、尼罗罗非鱼、 奥利亚罗非鱼和吉富罗非鱼等。近年来，全球罗非鱼养殖产量逐年递增，我国罗非鱼产量已 由1987年的不足3. 5万吨增长到2007年的113万吨，占世界产量的43. 5%，2010年还有望 达到120万吨。目前，我国已成为全球最大的罗非鱼生产国和出口国。在罗非鱼的养殖过程中，由于雌鱼3个月性腺已明显分化为卵巢，8个月左右达到 性成熟，每15-20天就要繁殖一次，将会在池塘里产生大量小罗非鱼，而小罗非鱼会竞争营 养物质、溶氧及空间，且在年终不能长成商品规格，从而会大大影响罗非鱼养殖的产量和效 益。因此，如果能够在养殖过程中人工控制罗非鱼的性别，对雌性罗非鱼进行性逆转，将大 大提高罗非鱼的养殖产量，降低养殖成本，提高经济效益。目前，对罗非鱼进行性逆转大多数是在罗非鱼性别决定与分化的敏感期进行激素 处理，以诱导完全的性逆转。但由于罗非鱼性别决定与分化的敏感期非常短(通常仅孵化后 3-5天)，不容易把握，且此时鱼体较小，抵抗力弱，激素处理会对鱼体产生一定损害甚至导 致鱼体死亡，从而使性逆转鱼的获得率大大降低。而如何通过人为因素在雌性罗非鱼性腺 已明显分化为卵巢后，再诱导其转变为功能型精巢，尚未见文献报道。芳香化酶是类固醇激素合成的末端限速酶，直接参与调控雌激素的合成。有文献 报道，在鱼类性腺分化前，注射芳香化酶抑制剂能够阻断鱼体内雌激素合成，将遗传性别为 雌性的个体逆转为表型性别为雄性的个体，使性腺发育为功能性精巢。但在雌鱼性腺已分 化为卵巢后，芳香化酶抑制剂还能否诱导其已分化卵巢转变为功能型精巢，迄今为止国内 外尚未见报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于考察芳香化酶抑制剂是否能够诱导罗非鱼已分化卵 巢转变为功能型精巢，从而建立一种诱导罗非鱼由雌性个体向雄性个体性逆转的新方法， 为研究罗非鱼性别决定与分化的分子机制提供可靠的实验模型，同时为罗非鱼性别控制和 单性育种研究开辟新的技术途径。为达到上述目的，本发明考察了芳香化酶抑制剂法倔唑(Fadrozole)对诱导尼罗 罗非鱼(flreocAroffiis niloticus)已分化卵巢向功能型精巢转化的影响，结果显示，向性腺 已明显分化为卵巢的3月龄雌性尼罗罗非鱼投喂含有法倔唑的饵料，法倔唑含量为400μβ/g，连续投喂90天，可以诱导尼罗罗非鱼已分化卵巢转变为功能型精巢。由此，本发明提供 如下技术方案
1、 法倔唑在诱导罗非鱼已分化卵巢转变为功能型精巢中的应用。进一步，所述罗非鱼为尼罗罗非鱼。2、利用法倔唑诱导罗非鱼已分化卵巢转变为功能型精巢的方法，是向性腺已分化 为卵巢的雌性罗非鱼连续投喂含有法倔唑的饵料，直至卵巢转变为功能型精巢。当所述罗非鱼为尼罗罗非鱼时，上述方法可以具体为向3月龄的雌性尼罗罗非 鱼投喂含有法倔唑的饵料，法倔唑含量为40(^g/g，连续投喂90天。3、用于诱导罗非鱼已分化卵巢转变为功能型精巢的饵料，其中含有法倔唑。当所述罗非鱼为尼罗罗非鱼时，上述饵料中法倔唑的含量为40(^g/g。本发明的有益效果在于本发明利用芳香化酶抑制剂法倔唑诱导罗非鱼已分化 卵巢转变为功能性精巢，这是在整个脊椎动物除了天然性逆转种类外，首次通过人为因素 实现已分化卵巢再分化为功能型精巢，建立了诱导罗非鱼由雌性个体向雄性个体性逆转的 新方法，不仅为研究罗非鱼性别决定与分化的分子机制提供了可靠的实验模型，而且为罗 非鱼性别控制和单性育种开辟了新的技术途径，适宜在罗非鱼以及其他养殖鱼类上推广应 用，对养殖鱼类性别控制和单性育种具有重要意义和应用价值。
图1为投喂含有法倔唑的饵料诱导3月龄雌性尼罗罗非鱼性逆转过程中不同阶 段的性腺组织学观察(H. E染色)，其中图A为3月龄正常雌鱼卵巢结构；图B为3月龄正常 雄鱼精巢结构；图C为3月龄正常雌鱼经法倔唑诱导70天后的性腺结构；图D为3月龄正 常雌鱼经法倔唑诱导90天后的性腺结构；图A和图B的标尺为20Mm，图C和图D的标尺为 IOMm0
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的优 选实施例进行详细的描述。1、含有法倔唑的饵料的配制
称取法倔唑0. 5g，用无水乙醇50ml溶解制成浓度为10mg/ml的母液，再吸取上述母液 8ml，用无水乙醇稀释至100ml，再加至尼罗罗非鱼养殖饵料200g中，搅拌混勻，自然晾干或 37°C烘干，即得含有法倔唑的饵料，法倔唑含量为40(^g/g。同时配制空白对照饵料，向尼罗 罗非鱼养殖饵料200g中加入无水乙醇100ml，搅拌混勻，自然晾干或37°C烘干，即得。2、投喂诱导尼罗罗非鱼已分化卵巢转变为功能性精巢
将尼罗罗非鱼假雄鱼(XX 与正常尼罗罗非鱼雌性(XX早)繁殖，获得全雌尼罗罗非 鱼种群，投喂正常饵料在水温27°c的循环水养殖系统中将其养至3月龄，随机分为空白对 照组和实验组，空白对照组投喂上述制备的空白对照饵料，实验组投喂上述制备的含有法 倔唑的饵料，连续投喂90天。3、尼罗罗非鱼已分化卵巢转变为精巢的检测 (1)显微镜下镜检精液取经法倔唑诱导性逆转90天后的实验组尼罗罗非鱼，轻压其腹部，收集精液，采用平 板载片法，滴1滴实验液于平板载片上，用解剖针针尖蘸取少许精液与实验液调勻，在低倍 镜下观察。结果显示，实验组尼罗罗非鱼精液中含有大量精子，说明雌性尼罗罗非鱼的卵巢 已转变为精巢。
(2)组织学观察性腺结构
分别在法倔唑诱导性逆转前以及诱导性逆转70天和90天后，解剖取出空白对照组和 实验组尼罗罗非鱼的性腺，Bouin's液固定，石蜡切片，经各级乙醇脱水、二甲苯透明和石蜡 包埋，作连续横切5Mm切片，H. E染色，光学显微镜下观察其性腺结构。结果如图1所示，3 月龄正常雌性尼罗罗非鱼的性腺中含有大量的卵原细胞和各级卵母细胞，说明性腺已明显 分化为卵巢(图1A)；对比3月龄正常雄性尼罗罗非鱼的性腺，可见其性腺中含有大量的精 原细胞、各级精母细胞、精子细胞和精子性腺，说明性腺已明显分化为精巢(图1B);3月龄正 常雌性尼罗罗非鱼经法倔唑诱导性逆转70天后，其性腺大部分转变为精巢结构，含精原细 胞、各级精母细胞和精子细胞，仅在性腺的背部与身体连接处存在正在退化的卵母细胞(图 1C);经法倔唑诱导性逆转90天后，其性腺完全转变为精巢结构，含精原细胞、各级精母细胞 和精子细胞(图1D)。4、性逆转雄鱼的精巢功能性验证 (1)人工授精验证性逆转雄鱼的精巢功能
取上述法倔唑诱导的性逆转雄鱼，轻压其腹部，收集精液；另外，收集正常发育即将产 卵的雌性尼罗罗非鱼卵子；将收集的精液和卵子混合，采用干法授精技术进行人工授精，将 受精卵在水温27°C的循环水养殖系统中进行孵化。结果发现，上述受精卵可以孵化出正常 发育的子代尼罗罗非鱼，表明经法倔唑诱导的由卵巢转变而来的精巢具有正常功能，产生 的精子能够正常受精。(2)与正常雌鱼混养杂交验证精巢功能
将上述法倔唑诱导的性逆转雄鱼与已性成熟且性腺发育正常的雌性尼罗罗非鱼混合 饲养，投喂正常饵料，水温26-27°C，自然光周期。结果发现，上述混养的雌、雄鱼可以繁殖出 正常发育的子代尼罗罗非鱼，表明经法倔唑诱导的由卵巢转变而来的精巢所产生的精子能 够正常受精，繁育后代。综合上述实验结果，可以得出如下结论芳香化酶抑制剂法倔唑能够用于诱导尼 罗罗非鱼已分化卵巢转变为功能性精巢，鉴于不同品种罗非鱼之间性质相似，因此，本领域 技术人员根据本发明的记载，可以推知本发明也适用于其它品种的罗非鱼，即法倔唑能够 用于诱导罗非鱼已分化卵巢转变为功能性精巢，其诱导方法是向性腺已分化为卵巢的雌性 罗非鱼连续投喂含有法倔唑的饵料，直至卵巢转变为功能型精巢。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参 照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可 以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明 的精神和范围。
权利要求
1.法倔唑在诱导罗非鱼已分化卵巢转变为功能型精巢中的应用。
2.根据权利要求1所述的法倔唑的应用，其特征在于所述罗非鱼为尼罗罗非鱼。
3.利用法倔唑诱导罗非鱼已分化卵巢转变为功能型精巢的方法，其特征在于向性腺 已分化为卵巢的雌性罗非鱼连续投喂含有法倔唑的饵料，直至卵巢转变为功能型精巢。
4.根据权利要求3所述的利用法倔唑诱导罗非鱼已分化卵巢转变为功能型精巢的方 法，其特征在于所述罗非鱼为尼罗罗非鱼。
5.根据权利要求4所述的利用法倔唑诱导罗非鱼已分化卵巢转变为功能型精巢的方 法，其特征在于向3月龄的雌性尼罗罗非鱼投喂含有法倔唑的饵料，法倔唑含量为400μβ/ g，连续投喂90天。
6.用于诱导罗非鱼已分化卵巢转变为功能型精巢的饵料，其特征在于含有法倔唑。
7.根据权利要求6所述的用于诱导罗非鱼已分化卵巢转变为功能型精巢的饵料，其 特征在于所述罗非鱼为尼罗罗非鱼。
8.根据权利要求7所述的用于诱导罗非鱼已分化卵巢转变为功能型精巢的饵料，其 特征在于所述饵料中法倔唑的含量为40(^g/g。
全文摘要
本发明属于鱼类遗传育种技术领域，涉及法倔唑(Fadrozole)在诱导罗非鱼已分化卵巢转变为功能型精巢中的应用，还涉及利用法倔唑诱导罗非鱼已分化卵巢转变为功能型精巢的方法，即向性腺已分化为卵巢的雌性罗非鱼连续投喂含有法倔唑的饵料，直至卵巢转变为功能型精巢；本发明利用芳香化酶抑制剂法倔唑诱导罗非鱼已分化卵巢转变为功能性精巢，这是在整个脊椎动物除了天然性逆转种类外，首次通过人为因素实现已分化卵巢再分化为功能型精巢，建立了诱导罗非鱼由雌性个体向雄性个体性逆转的新方法，不仅为研究罗非鱼性别决定与分化的分子机制提供了可靠的实验模型，而且为罗非鱼性别控制和单性育种开辟了新的技术途径。
文档编号A61P5/32GK102068429SQ20101060941
公开日2011年5月25日 申请日期2010年12月28日 优先权日2010年12月28日
发明者刘智皓, 孙运侣, 杨世杰, 王德寿, 黄宝锋 申请人:西南大学