脂质胞二磷胆碱注射液的制作方法

专利名称：脂质胞二磷胆碱注射液的制作方法
技术领域：
本发明涉及亲脂性注射液的制备，包括用脂质体来包埋胞二磷胆碱，从而可以有利地提高脑的吸收率。本发明尤其涉及脂质注射液，包括用一种高药物与脂质比的硫酸铵脂质体来包埋胞二磷胆碱。所述的脂质体是利用一种使用跨膜离子梯度，优选是一种跨膜 PH梯度的活化机理，通过一种载入药物的方法制备而成的。
背景技术：
胞二磷胆碱是一种在大多数生命形式中的天然物质。它是一种在合成卵磷脂主要途径中的中间代谢产物。卵磷脂是一种细胞壁的主要磷脂成分。卵磷脂是细胞结构和功能的必须，也是维持生命的关键。在细胞中，胞二磷胆碱是通过核苷酸三磷酸胞苷或CTP与胆碱磷酸反应合成的。 催化反应的酶称为CTP 胆碱磷酸胞苷酰转移酶。这种合成磷脂胆碱的反应是限速步骤。磷脂胆碱是由胆碱合成而来，并用于合成卵磷脂，CITI-胆碱与二酰甘油通过胞磷胆碱酶1，2_甘油二酯转磷酸胆碱酶来催化反应。胞二磷胆碱可通过引起乙酰胆碱水平，来改善脑代谢和整体能源，以及增加神经递素，去甲肾上腺素和多巴胺的水平。胞二磷胆碱被认为是在神经元缺血性条件可保护神经细胞，并报道说其可加速中风及脑外伤的恢复。它有助于增强脑血液循环和清除因神经退行性疾病造成的兴奋性氨基酸。它还可对多种神经系统疾病如脑缺血，精神中风，阿尔茨海默氏病和不同原因的认知障碍进行加速功能重组。通过毒理学试验显示胞二磷胆碱是一种安全药物，没有明显的系统胆碱能效应并且耐受性良好。在啮齿类动物中，胞二磷胆碱口服给药可增加“胞苷”和“胆碱”的血浆水平，然而在人类中，外给药后用“尿苷”替代了 “胞苷”的血浆水平的增加，因为在通过肝脏和肠途径系统吸收前胞二磷胆碱的快速降解。这种快速降解对于胞二磷胆碱持续释放是一大挑战。胞二磷胆碱还是胆碱和胞苷的一种释放形式。胆碱是一种乙酰胆碱和甜菜碱的前体。乙酰胆碱是一种神经传递素，在某些脑区域缺少神经传递素被认为是某些痴呆症包括阿尔茨海默氏症的病理因素，甜菜碱参与同型半胱氨酸向必需氨基酸L-蛋氨酸的转换。 L-蛋氨酸是一种蛋白质氨基酸。胞苷，可转化为三磷酸胞苷，参与一些反应包括胞二磷胆碱和核酸的形成。胞二磷胆碱在治疗中风和脑损伤中是有效的。它可用于一些迟发性运动障碍，帕金森氏症，阿尔茨海默氏症和认知功能损害包括记忆力减退症状的其它疾病。还表明它对弱视者的视力有帮助。胞二磷胆碱比开发用于降低可导致缺血事件的梗塞量的其它制剂具有更加有效和更多优点。胞二磷胆碱作为一种内源性化合物，在本质上是安全的。胞二磷胆碱具有非常低的毒性和极其广泛的治疗指数。对胞二磷胆碱的大量研究中，对脑缺血和颅脑损伤已取得良好的效果。在这些研究中其疗效认为是由于其可在大脑中增加卵磷脂的合成。在动物实验中，显示其可增强细胞膜的形成和修复，可恢复胞内酶的功能，可限制神经损伤和减少水肿。
同样的机制，据报道，普遍认为其在治疗帕金森氏症，阿尔茨海默氏病和各种认知障碍，包括因老化而记忆减退中有效。脂质体是含有夹带的水容积的完全封闭的脂质双层膜。脂质体可以是单层囊泡 (具有单膜双分子层)或多层囊泡(多膜双分子层具有洋葱状特征，每层通过水层分离)。 双分子层由两个具有疏水性的“尾巴”区域和亲水性的“头”区域单层脂质组成。这种膜层结构是这样的一种以单层脂质的疏水性(非极性)“尾巴”朝双分子层中间而亲水性“头” 朝水相的结构。班厄姆等人的原脂质体的制备(研究分子生物学，1965，13 =238-252)涉及在有机溶剂中悬浮磷脂，然后蒸发干燥在反应容器中得到膦脂膜。接下来，加入适量的水相，混合物开始“膨胀”，通过机械方法分散，其结果是得到多层囊泡(MLVs)脂质体。这种制备方法为发展小的超声波降解的由帕帕哈乔泡洛斯等人发现的单层囊泡(生物化学与生物物理， 文献，1967，135 =624-638)和大的单层囊泡提供了基础。在伦克等人的美国专利号4，522，803中这种脂质体被命名为稳定多薄层囊泡 (SPLV)，以及在方丹等人的美国专利号4，588，578中描述的单相囊泡以及冷冻和解冻多层囊泡(FATMLV)。在脂质体给药释放系统中，一种生物活性剂如一种药物被包埋在脂质体中，然后，给病人给药进行治疗。例如，拉赫曼等人的美国专利号3，993，754;西尔斯的美国专利号4，145，410 ；帕帕哈乔泡洛斯等人的美国专利号4，235,871 ；施耐德的美国专利号 4，224，179 ；伦克等人的美国专利号4，522，803 ；和方丹青等人的美国专利号4，588，578。另外，如果生物活性剂是亲脂性，它可与脂质双层关联。在一般的做法，微量填充物可用来填充弱酸性和碱性的药物(哈兰G等人，1993)。 该方法的基本思路是在不同的PH下，脂质膜的内部和外面呈现不同的填充性能和中性的配合作用以及极小量的分子变化。因此，在这些变化(基于在脂质体中不同的PH)后，药物分子可被截留在脂质体内部，并显示在脂质体双层内扩散速率降低。在一些研究中已证明，胞二磷胆碱包埋在脂质体内以防止其在肝脏中降解，可提高其治疗效果。胞二磷胆碱在其结构是带有+1电荷和具有“氨基酸”簇时可通过跨膜PH梯度法来提高其包埋到脂质体中。在本发明中，术语“包埋”表示包括药物在脂质体水容积中和药物与脂质层相联。可利用除卵磷脂(PC)和胆固醇外的具有不同数量正电荷和负电荷脂质的大多层囊泡(MLVs)(加比卓等，1982年，苏普拉)，大单层囊泡(LUVs)和小单层囊泡(超声波降解)(SUVs) (Gabizon等，1983年，苏普拉，筱泽等，1981年，医学文献。冈山，35 :395)的脂质成分。空间稳定的隐形脂质体对脂质膜具有一个优点，由于其高度亲水性可绕过肝脏代谢，从而证实其是高效的长期循环脂质体。胞二磷胆碱具有强极性和高亲水的特性。因此，它不能容易跨过血脑屏障(BBB)。 根据动物实验研究发现，通过口服和静脉注射注射途径，胞二磷胆碱的脑吸收分别只有 0.5%和2%的胞二磷胆碱。因此，在微球和脂质体包埋的药物有望改善药物跨过BBB给大脑释放。胞二磷胆碱或其盐作为有效成分，一般采用以肠外注射剂的形式或口服片剂，胶囊剂的形式给药。在现有的文献中还没有关于脂质体胞二磷胆碱注射液具有较高的脑吸收的报道。


图1 脂质体在透射电子显微镜下的图像。图2 胞二磷胆碱脂质体和注射液的血液比较图。发明目的因此，本发明的主要目的是提供一种稳定的含有胞二磷胆碱的脂质体注射液，它能跨过血脑屏障使药物更均勻地扩散到大脑中，从而可以有利地提高脑的吸收率，并提供了该注射液的制备方法。本发明的另一个目的是制备硫酸铵脂质体，包括先用PH梯度法将胞二磷胆碱载入到所述的脂质体中，然后进行薄膜水合(TFH)。发明_既述如上述目的所述，本发明提供了一种稳定的脂质体注射液，其含有被硫酸铵脂质体包埋的胞二磷胆碱，可以有利地提高脑的吸收率。另一方面，本发明提供了利用薄膜水合(TFH)技术来制备硫酸铵的多层囊。所述的脂质体含有摩尔比为7 1 2的氢化大豆磷脂(HSPC)，带负电荷的脂质二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)和胆固醇(CHOL)。选择性地，DSPE-mPEG 2000也可以以脂质总量的3摩尔％ (0. 0015mM)加入，将隐藏的特性传递给脂质体。另一方面制备过程中的参数，如溶剂系统、旋转速度、真空度、溶剂的蒸发温度、 成膜时间、水合时间、超声循环、退火时间、保温时间、水合介质的浓度和一些形成变量，如 HSPC、DSPG和CHOL等脂质的比率，可以通过控制硫酸铵来优化初始优化实验中使总脂率和水合量为常数。优选条件可以用于进一步的研究。为了将MLV转化为SUV，使用探头超声波破碎仪进行5个循环，60% A，0. 6秒，2分钟，温度为55士3°C或者选择性地用一系列聚碳酸酯过滤器挤出。利用透析囊来使外部(未包埋)硫酸铵和10%的蔗糖溶液发生交换，于是硫酸铵的内外之间形成PH梯度。透析过程需要18+小时才能完成。这项新技术可以通过改进具有不同内外pH(pH 梯度)的脂质体，从而促进胞二磷胆碱的包埋。最后通过在IOOmM体积摩尔浓度的硫酸铵中保温脂质体悬浮液，优化时间(55士3°C下1小时)来实现胞二磷胆碱的载入。从游离型药物中分离出来，然后包埋到硫酸铵脂质体中的胞二磷胆碱会悬浮在缓冲液中，并在额外增加如甘露醇等保护剂后被冻干。这样就获得了干燥粉末，它可以在使用前用注射用水溶解。
具体实施例方式下面将结合一些优选实施例来详细说明本发明，从而可以从各种方面进一步充分理解和实现本发明。本发明公开了一种稳定的脂质注射液，其含有被脂质体包埋的胞二磷胆碱，可以有利地提高脑的吸收率。所述的脂质体注射液可以利用PH梯度法来制备，达到高效的载药
在一个优选的实施例中，本发明公开了稳定的缓释脂质注射液，其含有包埋在硫酸铵脂质体中的胞二磷胆碱。所述的硫酸铵脂质体是先利用PH梯度法在所述的脂质体中载入胞二磷胆碱，然后利用薄膜水合(TFH)技术即可制成。本发明所述的硫酸铵脂质体是由多种脂质组成，如氢化大豆磷脂(HSPC)，带负电荷的脂质二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)和胆固醇(CHOL)来形成MLV。所述的脂质的摩尔比为 7 1 2。在另一个实施例中，本发明所述的硫酸铵脂质体是由多种脂质组成，如氢化大豆磷脂(HSPC)，带负电荷的脂质二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)和胆固醇(CHOL)和DSPE_mPEG 2000来形成MLV。所述的脂质的摩尔比为7 1 2 0.0015。使用探头超声波破碎仪对脂质体悬浮液进行超声破碎，5个循环，60% A，0. 6秒，2 分钟，温度为55士3°C或者使用挤压机(MOC :SS-316)在纯氮气的高压(50_800psi)下将所得到的脂质体挤压经过一系列的聚碳酸酯过滤器，从而将所形成的MLV转化为SUV。先用跨膜pH梯度成功载入胞二磷胆碱后再利用薄膜水合技术就可以制备出硫酸铵脂质体的MLV。使用pH梯度法可以在胞二磷胆碱载入硫酸铵脂质体中实现增加40%的载入量。所制备的胞二磷胆碱脂质体是球形的，其颗粒尺寸为115. 5nm-124nm0发现较之传统的载入法，使用PH梯度法可以提高所述的包埋率。本发明所述的稳定的脂质体注射液含有包埋在硫酸铵脂质体的胞二磷胆碱，其显示了药物的缓释性。其中药物和脂质的比为1 3-1 10。从游离型药物中分离出来，然后包埋到硫酸铵脂质体中的胞二磷胆碱会悬浮在缓冲液中，并在额外增加如甘露醇等保护剂后被冻干。在另一个实施例中，本发明公开了制备胞二磷胆碱脂质体注射注的方法，其包括如下步骤1)将脂质如HSPC、DSPG和CH0L，选择性地包括DSPE_mPEG 2000溶解到氯仿和甲醇的混合物中；2)在旋转烧瓶蒸发器中真空蒸发掉溶剂，获得干燥薄膜；3)使用水合硫酸铵来水合步骤2中的干燥薄膜，获得一种MLV脂质体悬浮液，其含有包埋在脂质体中的硫酸铵；4)超声波破碎MLV或者选择性地挤压MLV穿过一系列聚碳酸酯过滤器，从而将步骤3的MLV转化为SUV ；5)将步骤4的悬浮液静置60分钟使之退火；6)与10%的蔗糖溶液透析交换，形成跨膜硫酸铵梯度；7)将含有胞二磷胆碱的硫酸铵SUV在0. 01M[4-(2-羟乙基)_1_哌嗪乙烷磺酸] (HEPES)中，pH 7. 5、预定温度下保温预定时间；8)使用0. 15M氯化钠预平衡的交联葡聚糖G_50柱来分离游离型药物和脂质体；9)用PES过滤器过滤消毒脂质体，获得脂质体悬浮液，其含有包埋在脂质体中的胞二磷胆碱；和10)使用甘露醇作为一种冻干保护剂来冻干步骤9的脂质体悬浮液，或者直接对患者进行静脉注射。
透析过程需要18+小时才能实现外部未包埋的硫酸铵与10%的蔗糖溶液之间的交换，然后形成一个跨膜PH梯度。上述方法中使用的氯仿和甲醇的混合物中氯仿和甲醇的体积比为3 1。脂质体的特件对包埋在脂质体中的胞二磷胆碱进行形态、粒径、ζ-电位、脂质体的内部pH值和药物包埋百分率的检测。光学显微镜和透射电子显微镜(TEM)下的显微照片证实未被超声波处理的脂质体的多层特性以及每个脂质体都是球形。所述的TEM照片显示了一个颗粒的大小为100-150nm(图-1)。并发现在胞二磷胆碱载入前后最优组的平均颗粒大小分别为 115.5nm和124nm。最优组的ζ -电位记录为-25. 8mV。药物载入前后脂质体的内部pH值分别为5. 52和7. 33。最优组的药物包埋百分率为39. 88%。体外药物扩散研究使用透析囊来实现体内药物扩散研究，其中在pH 7. 4的磷酸缓冲液(PBS)中实测药物的释放。外部媒介的温度控制在37士2°C，从而模仿人体条件。外部媒介的体积为 IOOml。将普通药物和脂质体成分直接导入到扩散细胞中，然后放置到含有扩散媒介的烧杯中。普通药物在8小时内的药物释放率约为93. 25%,但是脂质体成分的药物24小时后仅有89. 54%被释放。所述的释放动力学通过在不同的药物释放动力学模型中完成研究。 所获得的数据表明胞二磷胆碱普通药物是根据“第一顺序释放”(R2 = 0. 978)，而胞二磷胆碱的脂质体成分是根据“樋口的扩散控制”模型来实现药物释放(R2 = 0. 993)。利用放射性标记进行的体内生物学分布研究核医学和相关学科协会，新德里(INMAS)利用放射性标记技术完成了体内生物学分布的研究。胞二磷胆碱注射液和胞二磷胆碱脂质体的放射性标记是利用各种报道的直接标记法和如氯化亚锡浓度和孵育时间等能达到最大标记效率的优选参数使用99mTc实现的。对于胞二磷胆碱脂质体而言，优选能达到最大标记效率的氯化亚锡浓度为IOOyg;对于胞二磷胆碱注射液而言，优选能达到最大标记效率的氯化亚锡浓度为150yg。对于胞二磷胆碱脂质体和注射液而言，达到高标记效率的孵育时间均为15分钟，而其它参数保持不变。也可以使用现有技术中所述的方法来实现质量控制测试来检测标记的强度和标记效率 (西奥博尔德Α. E.，1990)。在生物学分布研究中，分别将0. Iml标记后的胞二磷胆碱注射液和胞二磷胆碱脂质体经尾静脉注射到健康的balb/c小鼠中，间隔1小时、2小时、4小时、6小时和24小时后研究组织分布。杀死这些动物后采集血液样本，用伽玛射线分光光度计记录下不同组织，如脑、肝脏脾、肺、胃和肾的无线电活性，表达作为％组织的注射剂量/组织的g。药物代谢动力学参数，如AUC，Cmax，Tmax，t1/2均通过Kinetica 4. 4PK/PD分析软件计算获得。结果显示注射24小时后，胞二磷胆碱和胞二磷胆碱脂质体的整个血液中的放射性分别为0. 85%和2. 01%。脑中胞二磷胆碱脂质体成分的Cmax为0. 3% ID/g，而胞二磷胆碱注射液仅为0.11% ID/g，说明较之普通的药物，脂质体成分在脑中的穿透性更强。胞二磷胆碱和胞二磷胆碱脂质体的AUCch24分别为38. 38h*% ID/g和56. 35h*% ID/g。胞二磷胆碱和胞二磷胆碱脂质体的t1/2分别为静脉注射后29. 53小时和114. 34小时。

如图-2所示，体内生物学研究的结论是，胞二磷胆碱脂质体成分在曲线下的面积更大，因此较之胞二磷胆碱注射液，其体内持续的时间更长。 稳定性数据证实了当用低温防护剂将脂质体制备为低温冻干成分储存时，其稳定性。所述的水合低温冻干脂质体成分在不同温度和湿度下储存两个月以上，其药物保留百分率(> 99% )还是比室温下冷冻储存的药物保留百分率(> 98% )更高，证明脂质体成分经低温冻干后能使之稳定性在冷冻条件下保持更长的时间。实施例实施例1 先用pH梯度法载入胞二磷胆碱，然后用TFH制备硫酸铵脂质体。多层囊包括HSPC、DSPG和CH0L，并带有经薄膜水合(TFH)技术制备而成的包埋的硫酸铵(New R. R. C.，1990)。简而言之，在一个250ml的圆底烧瓶中，将这些脂质溶解于氯仿和甲醇(比例为3 lv/v)的一种混合物中，下面是不同的摩尔比硫酸铵所有脂质(mM) 水合物体积(mL)1 0. 11. 51 0. 22.01 0. 32. 51 0. 12. 01 0. 22. 51 0. 31. 51 0. 12. 51 0. 21. 51 0. 32. 0所述的溶剂在旋转烧瓶蒸发器中真空蒸发。然后用不同摩尔浓度(如80mM、100mM 和120mM)的水合硫酸铵作为水合媒介，在60士3°C下，如高于脂质的相转化温度(Tg)下来水合所得到的干燥脂质薄膜。所得到的脂质体分散在探头超声波破碎仪中进行超声破碎(5 个循环，60% Amp，0. 6秒，2分钟，温度55士3°C )。然后将超声破碎后的脂质体静置60分钟使之退火。所得的脂质体在雷米离心机中经3，000rpm、4°C下离心10分钟，以去除未水合的脂质。与10%的蔗糖溶液进行透析交换，形成一种跨膜硫酸铵梯度(哈伦等.1993)。简而言之，在一个透析囊中用线状物将所述的透析管折叠并堵住，于是在透析管中形成一段4cm 长的部分，小心地确认囊中的内含物没有泄漏。然后立即将所述的囊浸泡在蒸馏水制成的 10%的蔗糖溶液中。所述的湿囊缓慢地打开，并用10%的蔗糖溶液充分冲洗。然后向所述的囊中充入硫酸铵脂质体预制剂(2-4ml)。再次检查囊有没有泄漏，然后将囊悬浮在一个玻璃烧杯中， 该烧杯中含有IOOml作为一种受体隔层的的10%的蔗糖溶液。使用Teflon涂层磁棒(长度=2. 5cm, d = 0. 5cm)搅拌所述烧杯中的这些内含物，然后用铝箔将该烧杯密封，以防止实验进行时产生蒸发损失。透析进行18+小时使外部的(未包埋的)硫酸铵能充分地与 10%的蔗糖溶液发生交换，形成一个跨膜pH梯度。梯度形成后，脂质体在含有0. OlM HEPES (pH-7. 5)缓冲液的药物溶液(15mg/ml) 中，55士3°C、如高于Tg的温度下保温一定时间。然后根据文献(New R. R. C.，1990)所报道地，使游离型药物和脂质体“凝胶”色谱分离。简而言之，将交联葡聚糖G-50浸泡到0. 15M 氯化钠中一整夜，于是分离获得交联葡聚糖G-50柱。优选用0. 15M氯化钠来交换游离型的胞二磷胆碱。于是将交联葡聚糖G-50悬浮液倒入2ml注射器中，获得2cm柱。将该注射器放入IOml离心管中，在雷米冷却离心机中，IOOOrpm下离心10分钟以去除多余的溶剂。所述的柱用0. 15M氯化钠预平衡，即连续三次过柱，并且每次均离心以去除0. 15M氯化钠中的多余部分。接着在柱顶使用Iml脂质体 悬浮液，并IOOOrpm下离心10分钟。收集洗提液， 当游离型药物被包埋到柱中后，洗提液中含有胞二磷胆碱脂质体。于是所获得的脂质体悬浮液具有特征性的粒径、电位和药物包埋百分率 (PDE)。实施例2 多层囊包括HSPC、DSPG和CH0L，并带有经薄膜水合(TFH)技术制备而成的包埋的硫酸铵(New R. R. C.，1990)。简而言之，在一个250ml的圆底烧瓶中，将这些脂质以不同的摩尔比溶解于氯仿和甲醇(比例为3 lv/v)的一种混合物中。所述的溶剂在旋转烧瓶蒸发器中真空蒸发。然后用不同摩尔浓度(如80mM、100mM和120mM)的水合硫酸铵作为水合媒介，在60士3°C下，如高于脂质的相转化温度(Tg)下来水合所得到的干燥脂质薄膜。使用挤压机(MOC :SS-316)在纯氮气的高压(50_800psi)下将所得到的脂质体挤压经过一系列的聚碳酸酯过滤器(pall公司)。当高于脂质体的玻璃转化温度，如60士3°C 时可以实现挤出。使脂质体可以穿过上下旋转的两个过滤器支持物(双堆叠系统)。颗粒大小小于lOOnm，粒度分布指数小于0. 1的的脂质体可以被挤出。将所述的脂质体悬浮液冷却至室温，进行下面步骤的处理。与10%的蔗糖溶液进行透析交换，形成一种跨膜硫酸铵梯度(哈伦等.1993)。简而言之，在一个透析囊中用线状物将所述的透析管折叠并堵住，于是在透析管中形成一段 4cm长的部分，小心地确认囊中的内含物没有泄漏。然后立即将所述的囊浸泡在蒸馏水制成的10%的蔗糖溶液中。所述的湿囊缓慢地打开，并用10%的蔗糖溶液充分冲洗。然后向所述的囊中充入硫酸铵脂质体预制剂(2-4ml)。再次检查囊有没有泄漏，然后将囊悬浮在一个玻璃烧杯中， 该烧杯中含有IOOml作为一种受体隔层的的10%的蔗糖溶液。使用聚四氟乙烯涂层磁棒 (长度=2. 5cm, d = 0. 5cm)搅拌所述烧杯中的这些内含物，然后用铝箔将该烧杯密封，以防止实验进行时产生蒸发损失。透析进行18+小时使外部的(未包埋的)硫酸铵能充分地与10%的蔗糖溶液发生交换，形成一个跨膜pH梯度。梯度形成后，脂质体在含有0. OlM HEPES (pH-7. 5)缓冲液的药物溶液(15mg/ml)中，55士3°C、如高于Tg的温度下保温一定时间。最后用过滤法对制备出的脂质体悬浮液进行灭菌。脂质体穿过0. 2/0. 45 μ m聚醚砜(PES)膜。过滤出的脂质体可以静脉注射给患者。实施例3 将摩尔比为7 1 2的饱和卵磷脂，磷脂酰甘油和胆固醇溶解在氯仿甲醇 (3 ν/ν)中，60°C下蒸发形成一个酯质薄膜。接着用IOOmM水合硫酸铵溶液在60°C下水合所述的薄膜，形成完全水合的脂质薄膜。制得的脂质体用高压氮气挤压穿过一系列聚碳酸酯膜。然后与10%的蔗糖溶液进行透析，去除掉多余的脂质体硫酸铵。尺寸减小的脂质体在药物溶液中60°C下保温1.5小时，其中药物脂质为1 5(初步实验)。使用离子交换层析技术将游离型药物从制得的脂质体中去除。实施例4:将摩尔比为7 1 0.0015 2的饱和卵磷脂，磷脂酰甘油，DSPE-mPEG 2000和胆固醇溶解在氯仿甲醇(3 1% ν/ν)中，60°C下蒸发形成一个酯质薄膜。接着用IOOmM 水合硫酸铵溶液在60°C下水合所述的薄膜，形成完全水合的脂质薄膜。制得的脂质体用高压氮气挤压穿过一系列聚碳酸酯膜。然后与10%的蔗糖溶液进行透析，去除掉多余的脂质体硫酸铵。尺寸减小的脂质体在药物溶液中60°C下保温1. 5小时，其中药物脂质为 1 3.33-1 10。使用离子交换层析技术将游离型药物从制得的脂质体中去除。实施例5 将摩尔比为5. 25 1.75 3的饱和卵磷脂，磷脂酰甘油和胆固醇溶解在氯仿 甲醇(3 ν/ν)中，60°C下蒸发形成一个酯质薄膜。接着用IOOmM水合硫酸铵溶液在 60°C下水合所述的薄膜，形成完全水合的脂质薄膜。制得的脂质体用高压氮气挤压穿过一系列聚碳酸酯膜。然后与10%的蔗糖溶液进行透析，去除掉多余的脂质体硫酸铵。尺寸减小的脂质体在药物溶液中60°C下保温1. 5小时，其中药物脂质为5。使用离子交换层析技术将游离型药物从制得的脂质体中去除。实施例6 将摩尔比为7 1 0.0015 2的饱和卵磷脂，磷脂酰甘油，DSPE-mPEG 2000和胆固醇溶解在氯仿甲醇(3 1%ν/ν)中，60°C下蒸发形成一个酯质薄膜。接着用80-120mM 水合硫酸铵溶液在60°C下水合所述的薄膜，形成完全水合的脂质薄膜。制得的脂质体用高压氮气挤压穿过一系列聚碳酸酯膜。然后与10%的蔗糖溶液进行透析，去除掉多余的脂质体硫酸铵。尺寸减小的脂质体在药物溶液中60°C下保温1. 5小时，其中药物脂质为5。使用离子交换层析技术将游离型药物从制得的脂质体中去除。实施例7 实施例1中制得的载入了药物的脂质体经过具有0. 45 μ m预滤器的0. 2 μ m孔径聚碳酸酯膜过滤。过滤后的脂质体含有必需的剂量，使用甘露醇作为一种冷冻保护剂将所述的脂质体进行冷冻干燥。所使用的冷冻保护剂与磷脂的浓度比为1. 0-3. 0% w/w。
权利要求
1.一种稳定的缓释脂质体注射液，其特征在于含有包埋在硫酸铵脂质体中的胞二磷胆碱，有利地提高脑的吸收率。
2.如权利要求1所述的脂质体注射液，其特征在于药物与脂质的比为1 3-1 10。
3.如权利要求1所述的脂质体注射液，其特征在于所述的包埋在硫酸铵脂质体中的胞二磷胆碱的粒径为115. 5nm-124nm。
4.如权利要求1所述的脂质体注射液，其特征在于所述的硫酸铵脂质体含有氢化大豆磷脂(HSPC)，二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)和胆固醇(CHOL)三种脂质。
5.如权利要求4所述的脂质体注射液，其特征在于所述的三种脂质的摩尔比为 7:1:2。
6.如权利要求4所述的脂质体注射液，其特征在于所述的硫酸铵脂质体还含有 DSPE-mPEG2000，其在所有脂质中占3摩尔％。
7.如权利要求6所述的脂质体注射液，其特征在于所述的四种脂质的摩尔比为 7:1:2: 0.0015。
8.如权利要求1所述的脂质体注射液，其特征在于所述的注射液是用PH梯度法制备而成，所述的PH梯度法使其实现了高效的载药量。
9.如权利要求1所述的脂质体注射液，其特征在于所述的硫酸铵脂质体是先用跨膜PH 梯度法载入胞二磷胆碱，然后用薄膜水合技术制备而成。
10.一种制备含有胞二磷胆碱的脂质体注射液的方法，其特征在于包括以下步骤a.将脂质如HSPC、DSPG和CH0L，选择性地包括DSPE_mPEG2000溶解到氯仿和甲醇的混合物中；b.在旋转烧瓶蒸发器中真空蒸发掉溶剂，获得干燥薄膜；c.使用水合硫酸铵来水合步骤2中的干燥薄膜，获得一种MLV脂质体悬浮液；d.超声波破碎MLV或者选择性地挤压MLV使其穿过一系列聚碳酸酯过滤器，从而将步骤3的MLV转化为SUV ；e.将步骤4的悬浮液静置60分钟使之退火；f.与10%的蔗糖溶液透析交换，形成跨膜硫酸铵梯度；g.将含有胞二磷胆碱的硫酸铵SUV在0.OlM HEPES中，pH 7. 5、预定温度下保温预定时间；h.使用经过0.15M氯化钠预平衡的交联葡聚糖G-50柱来分离游离型药物和脂质体；i.用PES过滤器过滤消毒脂质体，获得脂质体悬浮液，其含有包埋在脂质体中的胞二磷胆碱；和j.使用甘露醇作为一种冻干保护剂来冻干步骤11的脂质体悬浮液，或者使用步骤11 的脂质体悬浮液直接对患者进行静脉注射。
11.如权利要求8所述的方法，其特征在于MLV是使用挤压机(M0C:SS-316)在纯氮气的高压(50-800psi)下挤压MLV使其经过一系列的聚碳酸酯过滤器，从而转化为SUV。
全文摘要
本发明公开了一种稳定的缓释脂质体注射液，其含有包埋在硫酸铵脂质体中的胞二磷胆碱，它有利地提高脑的吸收率。
文档编号A61K31/7068GK102316852SQ201080007338
公开日2012年1月11日 申请日期2010年2月10日 优先权日2009年2月11日
发明者A·R·米斯拉, A·S·P·加米尔, B·B·沙阿, M·R·巴加捷, N·I·刚德海, R·S·萨满特 申请人:A·R·米斯拉, 丽卡实验有限公司