专利名称：使用气体团簇离子束技术改变生物材料表面湿润性和/或其他生物相容性特征的方法以 ...的制作方法
技术领域：
本发明总体上涉及用于植入哺乳动物体内的生物材料，更具体地，涉及使用离子束技术，优选气体团簇离子束技术，用于改变湿润性和/或改善经改变的生物材料的性能的方法，使得所述经改变的生物材料1)作为用于细胞在其表面上附着的宿主；幻促进在其表面上或在材料内部的细胞增殖；；3)促进穿过此表面以及在该表面下的细胞渗透；和/或 4)促进随后的新组织形成。
背景技术：
气体团簇离子束(GCIB)照射已用于表面的纳米级改变。在同时待决、共同拥有的专利申请号为12/210，018、名称为“使用气体团簇离子束技术改变医疗装置表面湿润性特征的方法和系统以及由此制备的医疗装置”的美国专利中，已表明GCIB用于改变非生物材料表面的亲水性。GCIB处理在半导体装置和薄膜的制造中已经得到了充分的证明。然而，迄今为止未知的是其在大部分哺乳动物和鸟类器官系统内用于改变包括肌肉骨骼系统 (例如骨、韧带、肌腱、肌腱套、软骨等)的组织的生物材料表面，以及用于改变例如上皮组织和内皮组织的其他结缔组织的潜在应用。GCIB处理在韧带表面上产生的就其作为用于细胞附着的宿主结构的性能的物理改变迄今为止是未知的。通常已知，例如成纤维细胞和成骨细胞的贴壁依赖性细胞受益于亲水表面而附着、生长或充分分化，它们还偏好带电表面。 关于亲水性，液滴接触角(droplet contact angle)可用于测量湿润性，减小的接触角通常意味着较亲水的表面。先前已使用许多方法来增大非生物表面上的亲水性或改变电荷，例如喷砂、酸蚀刻、等离子喷涂涂层、CO2激光整平以及多种形式的清洗，包括机械、超声、等离子和化学清洗技术。其他方法包括加入表面活性剂或使用具有不同湿润性特征的膜或涂层。先前还未证明的是通过GCIB照射制备生物材料表面，用于通过增加表面的亲水性或通过改变表面电荷状态或表面化学性质，或者通过其他机制的增强的细胞附着。高能常规离子束，加速的带电原子或分子，广泛用于形成半导体装置结，通过溅射改变表面以及改变薄膜性质。不同于常规离子，气体团簇离子由在标准温度和压力下为气态的材料(例如通常地氧气、氮气或例如氩气的惰性气体，但任何可冷凝的气体都可用来产生气体团簇离子)的大量(具有几百到几千平均值为数千的典型分布)弱结合的原子或分子团形成，每个团簇离子共用一或多个电荷，并通过高压(依次从约3kV到约70kV或更高)共同加速以具有高的总能量。气体团簇离子形成并加速之后，它们的电荷状态会改变或变得不同(甚至被中和)，它们可破裂成较小的团簇离子和/或被中和的较小的团簇，但它们倾向于保持由于先前已通过高压加速而产生的相对高的总能量。气体团簇离子束已用于处理非生物材料的表面，以达到清洗、蚀刻、整平、膜生长等目的。它们以其在多数固体材料表面上的整平效果而著称，并且已用来整平例如钻石、硅和金属的材料。不同于常规(单体或分子的)离子的作用，由于每个气体团簇离子内大量的原子和分子，并且由于它们微弱地结合，它们撞击表面的作用非常浅。团簇经碰撞而分裂，相比加速的团簇的总能量，每个原子或分子仅携带相对少量eV的能量。气体团簇离子碰撞处的瞬间温度和压力会非常高，可出现多种表面化学、刻蚀和其他作用。(例如)通过将表面的键暴露(从而改变表面电荷状态)和/或通过将来自气体团簇离子的活性原子或分子结合入表面(通过使用包含例如氧、氮、碳等活性原子或分子的气体团簇离子)，表面化学可由GCIB照射改变。然而，这些作用非常浅，即在碰撞处以下至多延伸数十埃，因此对位于浅层碰撞处以下较深部位的任何材料，没有显著损害。在此应用的术语“GCIB”、“气体团簇离子束”和“气体团簇离子” 意为包括它们的电荷状态随其加速全部或部分改变(包括被中和)的加速的束和离子。术语“GCIB”和“气体团簇离子束”意为包括包含加速的气体团簇的所有束，尽管它们也可包含非团簇粒子。由于渗透非常浅，具有深于数十埃(数纳米)的可以忽略损害或改变的这一事实，GCIB是对于本发明而言优选的离子束。一方面，本发明提供通过使用气体团簇离子束技术用于生物材料表面增加湿润性和/或改变化学性质或电荷状态和/或改变其他物理特性的方法。另一方面，本发明提供通过使用气体团簇离子束技术用于制备针对新的细胞生长的附着、增殖、迁移等的生物材料表面的方法，可选地，用于刺激新的细胞分化成例如骨、纤维结缔组织、上皮、内皮等组织。再一方面，本发明提供通过使用气体团簇离子束技术，以可控方式用于增加生物材料表面的一部分的湿润性和/或用于制备针对新的细胞生长的附着、增殖、迁移等生物材料表面的方法。又一方面，本发明提供通过使用气体团簇离子束技术的手术可移植的生物材料， 其含有具有增加的亲水性的表面或表面部分和/或含有具有针对细胞渗透提高的性能的表面和/或作为用于新细胞附着、生长和分化的宿主的表面，可选地，所述生物材料用于刺激新细胞分化为组织，例如骨、纤维结缔组织、上皮、内皮等。另一方面，本发明提供用于手术植入和/或移植物的生物材料，以及用于包含移植物中特定细胞材料的生物材料的制备和手术植入的方法，可选地，所述方法用于刺激特定的细胞材料分化为组织，例如骨、纤维结缔组织、上皮、内皮等。
发明内容
本发明的前述方面以及另外和其他方面和优势通过以下描述的发明实现。本发明在生物材料表面或表面一部分上应用气体团簇离子束(GCIB)处理以改变其表面性质，例如表面亲水性或湿润性的程度和/或改善表面或表面一部分的适宜性，以作为新细胞生长和/或附着到生物材料的宿主，所述生物材料包括肌肉骨骼系统的组织， 例如骨、韧带、肌腱、肌腱套、软骨等。通过使用掩蔽技术或通过控制GCIB在表面上的射入或通过控制GCIB处理的空间广度的其他手段，可以可控的方式改变表面特性，改变期望的区域而不改变其他的区域。从而，在期望的区域促进细胞附着于生物材料(当手术植入时)，而在不适于成功的手术结果的区域不促进细胞附着。发明人已用GCIB技术处理了例如骨和韧带(在自然和脱细胞两种状态下)的肌肉骨骼系统组织的表面，并且已发现某些类型的GCIB处理引起生物材料表面的亲水性增加，用于细胞生长和附着的表面适宜性改善。此处提供的实例是结构性组织，但本发明并不限于结构性组织。
为了产生图形化的表面变化，可使用遮罩或束刻写(beam writing)技术或用于控制工件表面暴露于GCIB处理的多种其他方式，以此方式限制表面特定区域的处理或在工件不同区域内产生不同类型的GCIB处理。使用的遮罩可以是遮蔽工件一部分使其不受 GCIB处理的机械遮罩。实现图形化的表面变化不限于使用机械遮罩。本发明提供了用于制备移植用生物材料的方法。所述方法包含下述步骤提供减压室；在所述减压室内形成第一离子束；在所述减压室内提供用于支承生物材料的夹具； 将所述生物材料放置在所述减压室内的所述夹具中；以及用所述第一离子束照射所述生物材料表面的至少第一部分，其中所述生物材料经历性质上的变化。本发明还提供了用于外科植入的生物材料。该材料包含表面，其中所述表面的至少一部分具有改变的湿润性或改变的表面电荷状态。当植入哺乳动物内，表面经历改善的细胞附着。本发明还提供了用于外科植入的生物复合物。该生物复合物由下述过程形成，该过程包含提供减压室；在减压室内形成气体团簇离子束；在减压室内提供用于支承生物材料的夹具；将所述生物材料引到所述减压室中的夹具上；以及用所述气体团簇离子束照射所述生物材料表面的至少一部分。为了更好地理解本发明，及其另外的和进一步的目的，参考附图以及详细说明，将在权利要求中指定其范围。
图1是在GCIB领域已知类型并且适于实施本发明的气体团簇离子束处理系统的示意图；图2是显示工件夹具的气体团簇离子束处理系统的局部放大视图；图3是显示根据本发明实施例的韧带组织的GCIB照射从而测定的液滴接触角下降的图表；图4是显示根据本发明实施例的骨组织的GCIB照射从而测定的液滴接触角下降的图表；图5是显示在对照韧带样本上细胞生长的显微照片；图6是显示在根据本发明实施例处理的韧带样本上提高的细胞生长的显微照片； 以及图7是说明有益使用本发明改善的生物材料的示例性实施例的膝关节示意图。
具体实施例方式参考附图中图1，其显示了用于表面处理的现有技术中已知类型的典型的气体团簇离子束(GCIB)处理器100。尽管不限于在此说明的具体构件，处理器100由分成三个连通室的真空容器102、源室104、离子化/加速室106以及在其中包括工件夹具150的处理室108组成，所述工件夹具能够为了由气体团簇离子束处理而固定工件10。在使用过程中，三个室分别被真空抽气系统146a、146b和146c排空至合适的操作压力。保存于气缸111中的可冷凝源气112(例如氩气或队)在压力下通过气体计量阀113 和进气管114进入滞止室116，并通过适当成形的喷嘴110喷射入实质上较低压力的真空，生成超声气体射流118。射流中膨胀引起的冷却使得气体射流118的一部分冷凝成团簇，多数由从数百至数千(或者甚至数万)弱结合的原子或分子组成。气体分离开口 120部分地将还未冷凝成团簇射流的气体分子从团簇射流中分离，从而使下游区域中的压力最小化， 如此高压力将会有害的(例如电离器122、高压电极1 和处理室108)。合适的可冷凝的源气体112包括但不必限于惰性气体(例如氩气)、氮气、二氧化碳和氧气。含有气体团簇的超声气体射流118形成之后，团簇在电离器122中被离子化。电离器122可以是从一个或多个白热灯丝IM产生热电子，并加速和引导电子引起它们与气体射流118中的气体团簇碰撞的电子碰撞电离器，在气体射流118中，射流穿过电离器122。 电子碰撞从团簇中喷射出电子，引起部分团簇成为正电离子化的(positively ionized) 0 一组适当加偏压的高压电极126从电离器122中提取团簇离子，形成束，然后以加速势 (通常从IkV至多达数十kV)加速团簇离子并将它们集中形成具有初始轨迹(initial trajectory) 154的GCIB 128。灯丝电源136提供电压Vf以加热电离器灯丝124。阳极电源134提供电压Va以加速从灯丝IM发射出的热电子，使其攻击含有气体射流118的团簇以产生离子。提取电源138提供电压Ve以加偏压于高压电极，从电离器122的电离区域提取离子并形成GCIB 128。加速电源140提供电压VA。。以相对于电离器122加偏压于高压电极，从而产生等同于Va。。伏特(V)的总GCIB加速势。可提供一个或多个透镜电源(例如 142和144)以电势(例如Vu和ν 2)加偏压于高压电极来集中GCIB 128。要被GCIB处理器100处理的工件10由工件夹具150支承，布置在GCIB 128的路径中。可使用可选固定器12用于在工件夹具150的附着位置上固定工件10，该固定器可以是夹子或夹钳或其他固定设备(retaining item)。为了均勻处理工件10，工件夹具150设计为以下述方式适当地操纵工件10，以符合均勻处理的要求。还参照图2，任何非平面的，可以是球形或杯形、圆形、不规则、或其他非平面形态 (可在生物材料中遇到)的工件表面，可关于束的入射在一系列角度范围内取向以获得工件表面的最佳GCIB处理。这用到工件夹具150，其具有充分铰接(articulated)以使所有要被处理的非平面的表面以与GCIB适当对齐而取向，以提供处理最佳化和均勻化的能力。 更具体地，当正被处理的工件10是非平面时，工件夹具150可由位于GCIB处理器100末端的机构152旋转和铰接。铰接/旋转机构152优选地允许参照长轴155 (其可与GCIB 128 的初始轨迹154同轴)的360度的设备旋转，以及参照垂直于轴155的轴157的充分铰接， 以使工件表面保持在期望的束入射范围内。在某些情况下，取决于工件10的尺寸，需要扫描系统以产生大号工件的均勻照射。尽管对于GCIB处理是不必要的，可利用两对正交取向的静电扫描板130和132在广大的处理区域上产生光栅或其他扫描图样。当实施这样的束扫描时，扫描发生器156分别通过一对导线158和160向一对扫描板130和132提供X-轴和Y-轴扫描信号电压。所述扫描信号电压是引起GCIB 1 转化成扫描的GCIB 148的不同频率的普通三角形波，GCIB 148扫描工件10的整个表面。当不需要广大区域上的束扫描时，处理通常局限在由束的直径定义的区域。在工件表面的束的直径可以通过选择一或多个透镜电源(例如显示的142和144)的电压(Vu 和/或U设置，以在工件处提供期望的束直径。尽管没有具体显示，在图1和图2中，这样的现有技术的GCIB处理系统典型地使用传感器和电路用于测量和控制对于处理重要的
8GCIB参数(例如加速势、束流、束斑(beam focus)、气体流、施加到工件上的束剂量、工件操纵等)，还使用额外的控制与自动控制用于自动处理和处理配方管理、选择和控制。尽管图1和2显示了适于支持和操纵某些类型的平面的和简单成形的非平面的工件的工件夹具以及操纵器，对于那些熟悉现有技术的来说会理解的是其他类型的简单的和更加复杂的夹具和操纵器是已知的。例如，授予柯克帕特里克(Kirkpatrick)等的美国专利US6，676，989教导了优化用于处理例如血管支架的管状或圆柱状工件的夹具和操纵器。 用于将生物材料的多个表面暴露给GCIB照射的操纵器对于那些本领域技术人员会是已知的和/或使用普通技术可容易构造的。实施试验以确定对于生物材料的GCIB照射对液滴接触角(作为亲水性量度)的作用。使用小猪膝盖获取内侧副韧带(MCL)和外侧副韧带(LCL)以及股骨干。仔细地将韧带从其他疏松组织中解剖出来，在磷酸盐缓冲液(PBS)中漂洗，切成约Icm长乘它们约5mm 自然宽的块。骨干切成约2cm长的圆筒，并进一步沿轴向下纵切成半圆形块。通过使用镊子脱下骨膜从所述块除去骨膜，然后在PBS中漂洗。骨和韧带组织样本(包括对照)的随后处理是一样的。将组织在PBS中保存过夜。然后从PBS中移走组织样本(骨和韧带两者)， 单独地引入GCIB处理系统的处理室。处理室被排空至约100毫托(为了达到粗真空的排空时间对于骨样本为约30分钟，对于韧带样本约2分钟)的粗真空。达到粗真空后，样本随后被引入高真空，以及暴露于高真空(约6X10_5托)。然后在高真空中用GCIB照射处理骨和韧带组织的试验样本。对照样本没有被照射但经受同样的真空条件和持续时间。GCIB 照射由在30kV加速势下对照射的表面实施每cm25X IO14氩气团簇的表面剂量构成。照射时间和相应的高真空暴露持续时间对于骨和韧带组织样本两者是约3分钟和20秒。GCIB照射和/或真空暴露之后，在生物安全柜中过夜风干组织样本。通过使用液滴形状分析系统(德国汉堡Krilss GmbH,型号DSA-10，具有Krilss DSA11.8版分析软件)检查样本的湿润性，所述系统用于确定水滴在组织样本上的表面接触角。对于骨和韧带组织，照射过的样本和未照射的对照样本两者进行同样的测量。对于每次测量，将3微升去离子水液滴放置在每个表面(韧带和骨，照射过的和未照射的对照) 上之后5秒获取数据。所有测量在环境条件下实施，每次分析重复三次(每单个样本上三次试验)实施。相比未照射的对照样本，结果显示如由降低的接触角所测量的对于GCIB照射过的韧带和骨样本亲水性的增加。图3是显示对于GCIB照射过的和未照射过的对照样本两者，在韧带组织样本上三次测量中每次的液滴表面接触角试验结果的图表300。在韧带组织上使用去离子水的液滴接触角测量表明对应GCIB处理在韧带组织上增加的亲水表面。液滴接触角从未照射的对照韧带中的平均值55. 59+/-9. 03下降到GCIB照射过的样本中的36. 09+/-10. 93 (变化的统计显著性，ρ < 0. 004)。图4是显示对于GCIB照射过的和未照射过的对照样本在骨组织样本上三次测量中每次的液滴表面接触角试验结果的图表400。在韧带组织上使用去离子水的液滴接触角测量表明对应GCIB处理在韧带组织上增加的亲水表面。液滴接触角从未照射的对照韧带中的平均值72. 86+/-1. 47下降到GCIB照射过的样本中的61. 42+/-1. 06 (变化的统计显著性，ρ < 0. 015)。
由于生物表面的GCIB处理导致更加亲水的表面，做了额外的试验以表明脱细胞韧带的GCIB处理导致能被(例如)成纤维细胞更好地重新细胞化(re-cellularized) 的表面。使用猪的前交叉韧带(ACL)块，应用公开的体外培养方法(罗斯《SMOtoss SM)，乔什· R(Joshi R)和弗兰克· CB(Frank CB) ；"Establishment and comparison of fibroblast cell lines from the medial collateral and anterior cruciate ligaments of the rabbit” In Vitro Cell Dev Biol 1990 ；26 :579-84.)获取成纤维细胞。然后使用已建立方法的技术(伍德· T(WoodS T)，格拉泽· PF(Gratzer PF) ；"Effectiveness of three extraction techniques in the development of a decellularized bone-anterior cruciate ligament-bone graft", Biomaterials 2005, 26 :7339-7349.)将从小猪膝盖新鲜分离的LCL和MCL脱细胞。除了 GCIB照射，韧带组织样本(试验样本和对照两者)随后的处理是一样的。脱细胞的组织在PBS中保存过夜。从PBS中移走脱细胞的组织样本，单独地引入GCIB处理系统的处理室。处理室被排空至约100毫托(为了达到粗真空的排空时间对于韧带样本为约 2分钟)的粗真空。达到粗真空后，样本随后被引入高真空，以及暴露于高真空(约6X10—5 托)。然后在高真空中用GCIB照射处理脱细胞韧带组织的试验样本。对照样本没有被照射但经受同样的真空条件和持续时间。GCIB照射由在30kV加速电下对照射的表面实施每 cm25X1014氩气团簇的表面剂量构成。照射时间和相应的高真空暴露持续时间对于脱细胞韧带组织样本两者(被照射的和对照)是约3分钟和20秒。将悬浮于Sigma E1270细胞外基质(ECM)中的约2 X IO5成纤维细胞放置在韧带样本的任何一面(用新细胞种植脱细胞和照射过的组织)，置于含有适当的细胞生长培养基(Dulbecco，s Modified Eagle Medium+10%胎牛血清+1 %青霉素/链霉素抗生素(由 ^witrogen提供))的管内，允许生长18天，每3天定期换液。然后在福尔马林中固定韧带样本，组织学处理，用苏木精和曙红染色。韧带的显微检验显示了，相比那些没有GCIB处理的对照，在接受GCIB处理的韧带样本上的高度提高的细胞附着和增殖。图5显示表明如上述处理的脱细胞猪韧带组织504的未照射的对照样本的表面区域502的显微照片500，上述处理包括真空暴露，但没有GCIB照射。可见新生长的成纤维细胞的1-至2-细胞层506附着于下面的韧带组织504。图6显示表明如上述处理的脱细胞猪韧带组织604GCIB照射过的样本的表面区域 602的显微照片600，上述处理包括真空暴露和GCIB照射。图6中的放大倍率与图5中的相同。在图6中，可见新生长的成纤维细胞的3-至7-细胞层606在照射表面附着于下面的韧带组织604。此外，可见大量新的成纤维细胞(例如608A、608B和608C)更深地嵌入脱细胞韧带组织。新生长的成纤维细胞，除了已在GCIB照射表面上增殖，已开始迁移进入韧
市ο这些结果表明脱细胞韧带表面的GCIB照射已产生对于成纤维细胞在外表面上附着、生长或增殖较有利的环境，由此存在更加旺盛的表面生长和增强的进入韧带的迁移。进入韧带的细胞迁移在用于手术移植的韧带组织工程领域是重要的进步。生物材料的GCIB 处理可引起对于手术操作(例如ACL重建)显著改善的临床结果。迄今，ACL重建手术(例如)随时间推移具有有限的成功，部分由于移植的韧带或肌腱组织相当糟糕地整合入身体。GCIB处理的韧带或肌腱会更加快速地整合，形成更加紧密结合的整合，其扩大由传统的ACL重建手术技术实现的益处。通常已知的是原代细胞在体外生长时脱分化。在培养中可加入多种生长和有丝分裂因子以保持细胞的初始基因型和形态。除了在anvitrogerODulbecco’ s Modified Eagle Medium+10%胎牛血清+1 %青霉素/链霉素抗生素中所发现的，原代人成骨细胞在没有额外生长或有丝分裂因子的情况下在组织培养板中生长两至四代。在对照状态下或已被GCIB以每cm25X IO14氩气团簇照射的状态下，将二至四代成骨细胞种植在钛上，使得成骨细胞附着并增殖1、7或10天。随后，使用TRIzol方法(Invitrogen)从细胞中提取RNA。 采用UV-分光光度法分析定量RNA之后，使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad)将同等量的RNA(1微克)逆转录为cDNA。为了已知参与骨发生的多种基因的表达分析，用IOOpg 生成的cDNA执行实时聚合链反应(实时PCR)，所述基因包括已知在骨形成和矿化过程中参与的碱性磷酸酶-肝、骨、肾(ALPL)，以及已知产生叫做钙素(Osteocalcin)的骨蛋白的骨 Y-羧基谷氨酸(gla)蛋白(BGLAP)，针对管家基因GAPDH进行校正。所述分析在M^One 系统上，由TaqMan基因表达预混液和基因特异引物(所有的来自Applied Biosystems)实施，每种条件和时间点η = 3。使用Ct方法获得相对于对照结果的倍数变化。我们已经表明在第10天相比非GCIB-处理的钛，生长在氩气GCIB-处理的钛上的成骨细胞引起ALPL 中3. 41倍数的增加以及BGLAP中2. 66倍数的增加(变化的统计显著性，ρ < 0. 05)，表明成骨细胞正在经历会引向骨发生的分化。从而单独的表面的GCIB处理引起在GCIB处理的表面上增殖的细胞的分化。就生物材料来说，经常需要由GCIB照射处理材料材料仅预先选择的部分，然而最好不照射其他部分。在这样的情形下，控制GCIB横截面面积以及控制GCIB的扫描和/或偏斜以限制其照射范围至仅期望的面积可控制生物材料选择的部分暴露于GCIB。可选地， 可使用传统的遮蔽技术控制生物材料的不需要照射的遮罩表面面积，以及暴露需要照射的表面面积。随后，用散射或扫描GCIB照射遮罩以及通过遮罩暴露的生物材料。限制GCIB 照射至生物材料的选择区域的多种其他方法对于那些本领域技术人员将是已知的，并且意为包括在本发明中。生物材料的某些第一选择的部分可通过在那些选择的部分上实施第一 GCIB照射而被处理。生物材料的额外选择的部分可通过实施一或多次额外的GCIB照射过程而被处理。额外的GCIB照射处理可使用不同的GCIB和真空处理条件，例如不同的GCIB剂量、或在气体团簇离子中不同的组成气体、或不同的束加速势(引起不同的离子束能量和速度)。 额外选择的部分可以是与第一选择的部分不同的部分，或可以部分或完全对应第一选择的部分，或可以包括所有的第一选择的部分加上额外的部分。可使用这样的选择性处理在细胞化和在手术移植(implant或grafting)之后随后的整合入体内方面引起不同期望的反应。此外，任何提供的生物材料块还可通过单独的GCIB照射处理被均勻处理，随后根据手术位置、其他药剂或其他局部因子的使用以不同的积极方式响应手术移植过程。例如， 用于ACL替代的肌腱可由单独的GCIB照射处理被均勻处理。当被手术移植，由于局部影响， 接触骨的某些部分促进成骨细胞提高的迁移、附着和分化，引起骨形成，其促进肌腱整合入锚定的骨，然而其他类型的细胞优先吸引到不接触骨的移植肌腱的其他部分。最重要的是， 包括发现于滑膜囊部分(在此移植物用作替代韧带)的韧带成纤维细胞的成纤维细胞优先吸引到、附着并且进入移植物。通过直接使用适当的生长和分化因子，或通过使用含有TGFii或该家族成员的去除矿物质的骨粉，细胞再生长可有利于期望的组织类型而分化，所述生长和分化因子例如富血小板血浆(PRP)；反义导向分子(RGMa、RGMb和/或RGMc)；包括巨噬细胞集落刺激因子 (M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，白细胞介素_1和_9(IL1、IL6)或肿瘤坏死因子α (TNFa)的细胞因子；包括TGFi^ _1、TGFi^ _2、TGFi^ _3和所有的骨形态发生蛋白(BMPs)、激活素Α、生长分化因子(GDF)和Nodal的转化生长因子(TGFi3超家族)成员；血小板衍生生长因子(PDGF-AA、-AB&-BB)；成纤维细胞生长因子(FGFs)；类胰岛素生长因子(IGFs)；表皮生长因子(EGFs)；或血管内皮生长因子(VEGFs)。可选地，例如通过在原位使用来自脂垫的间质干细胞的浓缩物，所述脂垫在关节滑膜腔(joint synovial space) 中或在从受体的股骨或其他位置抽取的骨髓的白细胞层(buffy coat layer)中发现，促进自然地分化为局部合适组织的细胞的再生长。图7是说明有益使用本发明改善的生物材料用于在损伤关节中韧带替代的示例性实施例的膝关节示意图700。为说明目的显示所述示意图，其没有必然地按照比例绘制。 膝关节的前交叉韧带(ACL)断裂是经常需要替代损伤的ACL的手术移植的损伤。韧带或肌腱或其一部分可作为替代移植物。移植物可以来于自体、同种异体或异种组织。存在多种传统的手术修复技术。一种改善的方法使用脱细胞的、冻干的、GCIB照射过的图7中标示作为移植物718的肌腱或韧带组织。示意图700显示了在膝关节中ACL替代移植物的截面图。股骨702的下端具有股骨软骨706。胫骨704的上端具有胫骨软骨708。软骨706和软骨708形成膝关节的铰接接触表面。股骨702和胫骨704的断面线区域分别表示股骨702 和胫骨704的切断面(仅为说明目的，非手术切断)。为了方便，所述断面显示穿过替代移植物718所在的平面。通道710和712分别在股骨702和胫骨704中钻出，还穿透骨之间的胫骨软骨708和股骨软骨706。可以使用多种通道形态，通道710和712显示的形态仅意为示例。为了简要没有显示膝盖骨，并且二者都不是围绕关节以及保留沐浴关节的所有内部表面的滑液的滑膜囊。本发明的替代移植物718被放置进通道710和712，分别由紧固件 714和716固定在股骨端和胫骨端。可以使用多种紧固件和固定技术(包括金属和生物可降解聚合物紧固件)的任何一个，紧固件714和716仅意为示例性的。移植物718具有插入和保留在股骨通道710中的股骨插入部分722以及具有插入和保留在胫骨通道中的胫骨插入部分720。在一实施例中，在手术放置和在关节中固定之前没有重建脱细胞的、冻干的、GCIB 照射过的移植物718的组织。沐浴关节的滑液(未显示)接触包括股骨插入部分722和胫骨插入部分720的移植物718。滑液中的成纤维细胞(或存在于损伤和破坏的ACL的残余纤维内)接触移植物718，附着于移植物718，并在移植物718内增殖。这些成纤维细胞生长，分化成适当的韧带成纤维细胞，并最终重建健康的组织。在移植物718的股骨插入部分 722和胫骨插入部分720，移植物在此接触胫骨中通道712和股骨中通道710的骨，所述插入部分720和722接触含有血和骨的成骨细胞前体的骨组织。成骨细胞在移植物718的插入部分720和722的表面上扩展、附着、增殖，并分化成最终完全重塑和替代在移植物718 的插入部分720和722中的移植物结构的骨组织。在另一实施例中，在手术放置移植物718之前，将成为插入部分720和722的移
12植物的部分和/或不和骨一起插入的移植物部分可由添加适当的生长和分化因子处理，所述生长和分化因子例如富血小板血浆(PRP)；反义导向分子(RGMa、RGMb和/或RGMc)；包括巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，白细胞介素-1和-9(IL1、IL6)或肿瘤坏死因子α (TNFa)的细胞因子；包括TGF0-1、TGF3 _2、 TGFii-3和所有的骨形态发生蛋白(BMPs)、激活素Α、生长分化因子(⑶F)和Nodal的转化生长因子(TGF β超家族)成员；血小板衍生生长因子(PDGF-AA、-ΑΒ&-ΒΒ)；成纤维细胞生长因子(FGFs)；类胰岛素生长因子(IGFs)；表皮生长因子(EGFs)；或血管内皮生长因子 (VEGFs)。可选地，例如通过在原位使用来自脂垫的间质干细胞的浓缩物，所述脂垫在关节滑膜腔(joint synovial space)中或在从受体的股骨或其他位置抽取的骨髓的白细胞层 (buffy coat layer)中发现，促进自然地分化为局部合适组织的细胞的再生长，例如促进在插入部分720和722中附着和增殖的细胞趋向产生健康骨而分化。在另一实施例中，去除矿物质的骨插入到通道710和712中，并与移植物718的插入部分722和720接触以促进在插入部分720和722中附着和增殖的细胞趋向产生健康骨而分化，所述去除矿物质的骨包含骨胶原和骨的其他非矿物成分，并可选择地包括TGF-β 或其家族成员。在另一实施例中，将来自脂垫的干细胞原位施加到移植物718的插入部分720和 722以促进在插入部分720和722中附着和增殖的细胞趋向产生健康骨而分化，所述脂垫在关节滑膜腔(joint synovial space)中或在从受体的股骨或其他位置抽取的骨髓的白细胞层(buffy coat layer)中发现。尽管本发明为示例的目的已在此就包括骨、韧带和肌腱的某些材料进行了说明， 可理解的是其他生物材料包括在本发明范围内。尽管示例性实施例已就ACL关节修复进行了说明，可理解的是多种其他的关节和软组织移植物受益于本发明，并意为包括在本发明内。尽管本发明实施例已就新鲜的猪组织进行了教导，对于那些本领域技术人员来说容易理解的是所使用的技术还可以常规变化其他组织进行使用，所述其他组织包括来自鸟类和包括人的其他哺乳动物的组织，并且发明人已通过实验证实可用冰冻的和/或冻干的外植体组织以及新鲜的组织有益地使用本发明方法，具有相当的结果。使用对那些本领域技术人员熟知的传统方法容易地冻干肌腱和韧带组织。冻干的组织具有数个优点，因此在本发明技术的诸多潜在应用中是优选的。由于这样冻干的组织比新鲜或冰冻的组织释放更少的水汽，在制备方面和在处理的离子照射阶段过程中，冻干的组织在离子束照射工具上呈现较小的装载量。此外，冻干的组织可以针对照射之后的重要时期没有降解地保存，能够以低成本传统的运输方法容易地运送或运输至远的地点用于手术移植。冻干的、照射过的组织可稍后在手术移植之前不久在手术操作地点被重建(例如用生理盐水或用受体的体液或其他合适的液体)。同样地，冻干的、照射过的组织可在手术移植之前不久在手术操作地点用细胞进行种植。甚至可以用来自受体身体的含有细胞的体液进行重建和细胞种植以增加移植物的相容性。可选地，冻干的、照射过的组织能够在冻干状态下手术移植进受体，然后它们与受体的体液和细胞进行接触，引起移植组织在移植位置的原位重建和细胞种植。通常，冻干的、照射过的组织的长保存期为移植组织的制备和成功移植的总体过程提供了相当程度的灵活性和实用性。用于以本发明方法使用的体外培养的移植材料可取自多种鸟和哺乳动物种类(包括人)，通过本发明方法制备的移植材料的手术移植可以在多种哺乳动物种类(包括人)内进行，这样的移植物可以是根据移植组织各自的供体和受体的同种异体移植物、自体移植物或异种移植物。根据对于本领域技术人员已知的技术，用于获取、培养和在组织 (包括脱细胞组织和/或冻干的组织)上或内种植新细胞的技术可使用来自预期移植受体或来自其他合适的供体源的细胞。在制备示例性猪的韧带中使用的体外培养和脱细胞技术还可在肌腱组织上使用。因此，根据对于那些本领域技术人员来说已知的技术，本发明方法可用于从供体(包括自体供体)或尸体移除肌腱、韧带或其他组织，以脱细胞(当需要时)、 冻干(当需要时)、用特定的新细胞种植组织或为组织脱细胞用于细胞附着和增殖。通过使用照射技术，显著提高了进入移植材料的新细胞附着和增殖成功，有助于提高移植物成功整合进受体的可能性，以及提高成功的整体医学结果的可能性。 如在此使用，术语“生物材料”意为包括脱细胞的或自然细胞化状态 (ce 1 lularized state)下的、活的或死的、新鲜的、冰冻的、冻融的、冻干的、冻干后重建的 (lyophilized and reconstituted)、离子照射或没有照射过的所有生物来源的组织材料， 包括但不限于包含肌腱、韧带、骨、软骨、软组织和其他组织的材料。尽管本发明已就使用由特定加速势形成和在特定剂量下实施的GCIBs进行了说明，对于那些本领域技术人员来说可理解的是可使用其他的剂量和加速势，这样的变化可在GCIB照射的作用程度上产生变化。尽管本发明已就使用具有由氩气组成的气体团簇离子的GCIBs进行了说明，对于那些本领域技术人员来说可理解的是还可有益地使用其他组分气体和气体混合物。这些包括惰性气体、Ne、Ar、Xe和其他气体，包括但不限于气体氧气、氮气、二氧化碳、其他有机和无机的含碳气体，进一步包括包含与其他气体相混合的任何这些气体的气体混合物，这些变化可引起GCIB照射作用程度和类型上的变化。应该理解的是本发明在前述说明和权利要求的精神和范围内还可纳入多种更多和其他实施例。
权利要求
1.一种用于制备植入用生物材料的方法，其特征在于，所述方法包含 提供减压室；在所述减压室内形成第一离子束；在所述减压室内提供用于支承生物材料的夹具；将所述生物组织放置在所述减压室内的所述夹具中；以及用所述第一离子束照射所述生物材料表面的至少第一部分，其中所述生物材料经历性质上的改变。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述性质上的改变包含从下述组成的组中所选的改变所述表面的所述至少第一部分的增加的可湿润性； 所述表面的所述至少第一部分的增加的亲水性； 所述表面的所述至少第一部分的改变的化学性质；以及所述表面的所述至少第一部分的改变的电荷状态。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包含将所述生物组织暴露于活细胞，其中所述活细胞表现从下述组成的组中所选的行为对所述表面的所述至少第一部分的增强的附着；在所述表面的所述至少第一部分上增强的增殖； 穿过所述表面的所述至少第一部分或在其之下增强的渗透；以及在所述表面的所述至少第一部分之上或之下增强的形成。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物组织包含从下述组成的组中所选的组织肌肉骨骼系统组织； 结缔组织； 骨组织； 肌腱组织； 韧带组织； 软骨组织； 上皮组织；以及内皮组织。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物材料包含细胞组织或脱细胞组
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物材料包含哺乳动物组织或鸟类组织。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一离子束是第一气体团簇离子束。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，还包含 在减压室内形成第二气体团簇离子束；以及用所述第二气体团簇离子束照射所述生物组织的所述表面的至少第二部分。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于第一气体团簇离子束具有第一气体团簇离子复合物和第一气体团簇离子束加速势，第二气体团簇离子束具有第二体团簇离子复合物和第二气体团簇离子束加速势；以及照射所述表面的所述至少第一部分包含用第一气体团簇离子束剂量照射，以及照射所述表面的所述至少第二部分包含用第二气体团簇离子束剂量照射。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述第一气体团簇离子复合物和所述第二气体团簇离子复合物实质上是相同的。
11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述第一气体团簇离子束加速势与所述第二气体团簇离子势实质上是相同的。
12.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述第一气体团簇离子束剂量与所述第二气体团簇离子束剂量实质上是相同的。
13.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述第一气体团簇离子束包含气体团簇离子，所述气体团簇离子包含从下述组成的组中所选的原子氩； 氖； 氙； 氮；碳；以及氧。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包含将所述生物组织暴露于活细胞， 其中所述表面的至少第三部分没有被照射，以及其中所述暴露于所述至少第一部分的活细胞，相比暴露于所述至少第三部分的所述活细胞，表现不同的行为，所述行为包含从下述组成的组中所选的性质表面附着； 细胞增殖； 细胞表面渗透；以及组织形成。
15.一种用于外科植入的生物材料，其特征在于，包含表面，其中所述表面的至少第一部分具有改变的湿润性或改变的表面电荷状态；以及当植入哺乳动物时，所述表面经历改善的细胞附着。
16.根据权利要求14所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料包含从下述组成的组中所选的组织肌肉骨骼系统组织； 结缔组织； 骨组织； 肌腱组织； 韧带组织； 软骨组织； 上皮组织；以及内皮组织。
17.根据权利要求14所述的生物材料，其特征在于，所述表面的所述至少第一部分在所述表面上图样化，并且促进改善的细胞附着，所述细胞附着是外科植入优选的结果。
18.一种用于外科植入的生物复合物，其特征在于，由下述过程形成，包含 提供减压室；在所述减压室内形成第一气体团簇离子束；在所述减压室内提供用于支承生物材料的夹具；将生物材料引到所述减压室中的所述夹具；以及用所述气体团簇离子束照射所述生物材料表面的至少一部分。
19.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，还包含使所述活细胞分化以形成分化的组织类型。
全文摘要
本发明提供了用于制备移植用生物材料的方法。本发明还提供了用于外科植入的生物材料。本发明还提供了用于外科植入的生物复合物。
文档编号A61K9/00GK102348453SQ201080011644
公开日2012年2月8日 申请日期2010年3月11日 优先权日2009年3月11日
发明者劳伦斯·B·泰伦特, 理查德·C·什夫卢加, 约瑟夫·库利, 肖恩·R·柯克帕特里克 申请人:艾克索乔纳斯公司