保护和治疗神经损伤的方法和组合物的制作方法

专利名称：：保护和治疗神经损伤的方法和组合物的制作方法
技术领域：
：概括地讲，本申请涉及医疗预防和治疗领域，具体地，涉及神经损伤的预防和治疗。
背景技术：
：有机磷(organophosphorus)(OP)神经毒素结合乙酰胆碱酯酶(AChE)并使其失活。AChE的失活在周围和中枢神经系统的毒蕈碱和烟碱的突触内产生乙酰胆碱(ACh)的超生理性积聚。过量的ACh会引起正常受Ach调控的其他递质的释放。OP神经毒剂基本上同时刺激所有的胆碱能突触。因为ACh是在大脑中分布最广泛的神经递质，所以大量的神经毒剂攻击会引起快速地意识丧失、癫痫发作以及延髓呼吸中枢的抑制。因此，由OP中毒造成的死亡通常是因为呼吸衰竭(NewmarkJ(2004)ArchNeurol61:649-652)。最主要和最经常受影响的区域是大脑皮层、杏仁核、海马、基底神经节和各种丘脑核McDonoughetal.(1987)BrainRes435:123-137；PetrasJM(1994)JExpAnalBehav61:319-329。近来的体外研究表明，OP也能引起神经细胞凋亡。例如，Caughlan等报到了毒死蜱(chlorpyfifos)会导致由胚胎或新生大鼠培养的初级皮质神经元中的细胞凋亡(CaughlanA,etal.(2004)ToxicolSci78:125-134)他们进一步得出结论，毒死蜱导致的细胞凋亡独立于AChE抑制而发生。另一种OP杀虫剂(对氧磷)显示出会导致在培养的小脑粒细胞和人成神经细胞瘤细胞株中的细胞凋亡(CarlsonK，etal.(2000)ToxicolApplPharmacol168:102-113；WuX，etal.(2005)ToxicolApplPharmacol208:57-67)。对于OP暴露的经典处理方法包括(1)通过非选择性的毒蕈碱拮抗物阿托品来保护毒蕈碱ACh受体；(2)通过使用肟来使被抑制的AChE再活化；和(用苯(并)二氮卓类保护中枢神经系统防止癫痫发作。然而，传统的和许多新的药物治疗是基于施用本身具有神经毒性或者不足以保护PNS或CNS中的神经元的药物。例如，阿托品会在毒蕈碱突触内逆转胆碱能危象，但是因为阿托品在肌肉烟碱受体上是无活性的，所以不会显出如颤搐和共济失调的神经肌肉症状。已经证明肟在降低OP介导的死亡方面是有效的，但它们的保护作用是有限的。肟恢复AChE的时窗较窄。有时在OP结合AChE之后，加成化合物在称作“老化”的过程中通过使侧链松动而“老化”。老化使得OP-AChE加成化合物不受肟的影响。安定和其更有效的类似物咪达唑仑是有效地抵抗由OP导致的癫痫发作的抗惊厥齐U。暴露于OP神经毒剂导致胆碱能介导的癫痫发作，之后，由ACh积聚而释放的谷氨酸酯使得癫痫发作泛化。谷氨酸持续的癫痫发作是在由OP引发的癫痫发作介导的CNS损伤中的主要因素(SolbergY,etal(1997)TrendsPharmacolSci18:183-185)。NMDA拮抗物显示出对OP导致的癫痫发作和随后的神经病理具有神经保护作用。因此，NMDA受体拮抗物被看作是对OP导致的CNS毒性的可能治疗。然而，近期研究表明，NMDA受体拮抗物MK-801增强了对氧磷介导的神经毒性并在体外增加细胞凋亡，这表明NMDA受体的活性对于维持暴露于OP的神经元的存活是重要的(WuX，etal.(2005)ToxicolApplPharmacol20857-67)。另外，NMDA拮抗物在患者中引起严重的精神副作用。在有暴露于OP神经毒剂的风险情况下溴化吡斯的明被用作预防性处理。在第一次海湾战争中盟军就使用了这种化合物。大约半数的接受预处理的部队人员抱怨有症状，包括哮喘加重、血压过高、过敏反应和不能忍受的胃肠疼痛(DunnMA,etal.(1989)Jama262:649-652)。自从他们返回，许多部队人员也抱怨有神经症状。引起这些症状的原因是未知的，但是预防性吡斯的明处理和暴露于OP杀虫剂被认为是可能的原因(LeikinJB,etal.(2002)ACritCareMed30:2346-2354)。
发明内容本发明一方面涉及一种保护受治者免受OP导致的神经损伤的方法。该方法包括向受治者施用有效量的4R西松烷内酯(cembranoid)、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物。在一个相关的实施方式中，神经损伤是脑损伤。在另一个实施方式中，在暴露于含OP的毒剂之前或之后立即施用4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物。在优选的实施方式中，在暴露于含OP的毒剂之前或之后立即施用4R西松烷内酯。在另一个实施方式中，以0.002-10mg/kg体重的剂量范围施用4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物。在另一个实施方式中，经口服、肌内注射、静脉内或动脉内施用4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物。在另一个实施方式中，对于神经损害的长期治疗，以0.5_5mg/kg体重的剂量范围口服施用4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物。在另一个实施方式中，对于神经损害的紧急治疗，以0.1-0.5mg/kg体重的剂量范围肌内注射施用4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物。在另一个实施方式中，对于神经损害的紧急治疗，以5-50μg/kg体重的剂量范围经脑动脉或者以0.1-0.5mg/kg体重的剂量范围肌内注射施用4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物。在另一个实施方式中，4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物与选自阿托品、解磷定和咪达唑仑中另一种神经保护剂一起施用。在另一个实施方式中，4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物与阿托品一起施用。在另一个实施方式中，4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物与l-10mg/kg体重的剂量范围的阿托品一起施用。本发明的另一方面涉及一种治疗受治者中OP导致的神经损害的方法。所述方法包括向受治者施用有效量的4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物。5在一个实施方式中，以0.5_5mg/kg体重的剂量范围口服施用4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物。本发明的另一方面涉及神经保护的药物组合物。该药物组合物包含4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物以及药学上可接受的载体。本发明的另一方面涉及一种用于保护受治者免受OP导致的神经损害的试剂盒。该试剂盒包括在容器中的4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物和如何使用4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物的说明。在一个实施方式中，以容易分配(ready-to-dispense)的方式配制4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物。在另一个实施方式中，以容易分配的单次剂量的方式配制4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物。在另一个实施方式中，所述试剂盒进一步包含另一种神经保护剂。在相关的实施方式中，所述神经保护剂为阿托品。在另一个实施方式中，所述试剂盒进一步包含用于施用4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物的分配器。图1显示(lS，2E，4R，6R，7E，llE)-西松烷-2，7，ll-三烯-4，6-二醇(4R西松烷内酯)和(lS，2E，4S，6R，7E，llE)-西松烷-2，7，ll-三烯-4，6-二醇(4S西松烷内酯)的化学式。图2为一组合图，其示出的是用于测定POX对群峰电位(PS)范围的影响的试验设计(图2A)以及POX对PS的抑制浓度曲线(图2B，每点7个或更多的切片)。缩写ACSF，人工脑脊液；PS，群峰电位；Ρ0Χ，对氧磷。图3为一组合图，其示出的是用2μπι4R西松烷内酯预处理或后处理保护PS对抗1μMPOX(图3Α，N=21个切片/每组)和200μMPOX(图3Β，N=14个切片/每组)。图4为显示阿托品既对切片无害也对200μMPOX无神经保护作用的图(N=14个切片/每组)。图5为一组合图，其示出了在阿托品存在的情况下，4R西松烷内酯的神经保护作用得以提高(图5Α，所有的试验组都彼此显著不同，N=21个切片/每组，ρ<0.0001)，以及保护作用有效至暴露于POX后一小时(图5Β，两个试验组与对照显著不同，N=7个切片/每组)。图6为一组合图，其示出了氟磷酸二异丙酯(DFP)以依赖浓度的方式减小群峰电位(PS)的范围。图片A是用于确定DFP对PS的影响的试验步骤。缩写ACSF，人工脑脊液；PS，群峰电位。图片B为DFP对PS的抑制浓度曲线。N=7或更多个切片/点。图7为一组合图，其示出了4R保护PS免受DFP施加的损害。图片A为试验设计。图片B示出了10μM4R加快了用100μMDFP处理后PS的恢复。图片C显示出对于促进用100μMDFP处理后PS的恢复，4R比解磷定Q-PAM)更有效。在每个试验条件下均为14个切片。图8是显示阿托品单独使用或与4R组合使用保护PS免受DFP施加的损害的图。在该图中显示出差异的显著性。在每个试验条件下均为14个切片。图9为吡斯的明-异丙托铵-DFP(PID)模型的试验设计。在试验组(PID组)中，大鼠被注射了0.lmg/kg(im)吡斯的明后20分钟又注射了2;3mg/kg(im)异丙托铵，再经过另外10分钟后再注射9mg/kg(ip)DFP。对照组(PIW组)接受吡斯的明、异丙托铵和水，而赋形剂对照组(SSW组)接受盐水、盐水和水。采用这种模式，用改良的拉辛得分(Racinescale)和疲劳转棒仪实验(Rotarodtest)来监测行为。最后，将大鼠麻醉、灌注并用组织学方法评价脑损害。在血液和脑样品中测量AChE。图10A-10C示出了4R西松烷内酯在体内保护大鼠的脑免受DFP损害。按照图9描述的PID模式用DFP注射十六只大鼠。在注射DFP前一小时，8只试验鼠注射6mg/kg(sc)4R西松烷内酯，而8只对照注射DMSO赋形剂。6对试验-对照在注射DFP后48小时被处死，两对在注射DFP后M小时被处死。用检测崩解变性的氨基铜银(aminocupricsilver)(ACS)染液和巢蛋白(nestinM对损伤响应而出现的活化的星形胶质细胞的标记)染色法对脑染色。图IOA各组的有代表性的脑切片。图IOB神经元变性的量化。该图表示了在五个脑部区域神经元变性的平均得分。图IOC星形胶质细胞活化的定量。在采用与图IOB中描述的相同的方法用巢蛋白抗体染色的切片中测量星形胶质细胞活化的程度。在这里示出的所有四个区域中，4R降低了星形胶质细胞的活化。具体实施例方式下述详细说明会使本领域的技术人员能够制造和使用本发明。为了解释的目的，设定了具体的命名以提供对本发明的充分理解。然而，对本领域技术人员来说显然这些具体细节对实施本发明来说并不是必须的。提供具体实施的描述仅是作为代表性的实例。本发明并不限于示出的实施方式，而是与在此处公开的原理和特征一致的可能最宽的范围相符。本发明的一个方面提供了用于保护或治疗遭受OP导致的神经损害和由谷氨酸酯激动剂(如在污染的贝类动物中发现的软骨藻酸)引起的神经损害或易受其影响或有此风险的受治者的预防性和治疗方法。一方面，本发明提供了一种保护受治者免受OP导致的神经损害的方法。该方法包括在暴露于OP之前或之后立即向受治者施用有效量的4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物。本发明的另一方面是关于治疗受治者的OP导致的神经损害的方法。该方法包括向有OP导致的神经损害的受治者施用有效量的4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物。西松烷内酯是以相对高的浓度在多种烟草物种(绿色烟草叶中大约0.2%)(ElSayedKA,etal.(2007)ExpertOpinInvestigDrugs16:877-887)以及软珊瑚和其他陆生植物中发现的环状二萜类化合物。图1示出了(lS，2E，4R，6R，7E，llE)-西松烷-2，7，11-三烯-4，6-二醇(4R西松烷内酯)和(1S，2E，4S，6R，7E，11E)-西松烷-2,7,11-三烯_4，6-二醇(4S西松烷内酯)的结构。西松烷内酯是烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)的非竞争性拮抗物。烟草中的4R西松烷内酯(图1)是对α4β2或α3β4亚型几乎不具有活性的α7神经元nAChR的亚型选择性拮抗物。4S西松烷内酯是4R西松烷内酯的立体异构体，并具有与4R西松烷内酯类似的性质。这里所用的术语“西松烷内酯类似物”是指具有与4R或4S西松烷内酯类似性质的4R或4S西松烷内酯的合成类似物。在一个实施方式中，4R西松烷内酯或4S西松烷内酯是天然生成的4R西松烷内酯或4S西松烷内酯。在另一个实施方式中，4R西松烷内酯或4S西松烷内酯是从烟草中分离出的4R西松烷内酯或4S西松烷内酯。4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物可通过多种途径施用。在一个实施方式中，4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物经静脉内施用。在另一个实施方式中，4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物经动脉内施用。在另一个实施方式中，4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物经鞘内施用。在另一个实施方式中，4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物经肌内注射施用。在又一个实施方式中，4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物经口服施用。也可以采用其他的施用途径，如皮下和腹膜内施用。对于紧急治疗，优选的途径是肌内注射。对于长期治疗，优选的途径是口服施用。在预防性处理中，在暴露前1-2小时以0.5-5mg/kg体重的剂量范围口服施用4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物。暴露后，最迟至暴露后数小时以0.1-0.5mg/kg体重的剂量范围肌内注射施用4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物。对于已有的神经损害，以0.5-5mg/kg体重的剂量范围口服施用4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物。在一个实施方式中，以0.5-5mg/kg体重的剂量范围口服施用4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物用于长期治疗神经损害。在另一个实施方式中，以0.1-0.5mg/kg体重的剂量范围肌内注射施用4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物用于紧急治疗神经损害。在另一个实施方式中，以5-50μg/kg体重的剂量范围经脑动脉施用4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物。在又一个实施方式中，以0.1-0.5mg/kg体重的剂量范围肌内注射施用4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物用于紧急治疗神经损害。在另一个实施方式中，以0.002-0.02mg/kg体重/天的剂量范围施用4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物。在一个实施方式中，以0.02-0.5mg/kg体重/天的剂量范围施用4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物。在另一个实施方式中，以0.5-1.Omg/kg体重/天的剂量范围施用4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物。在又一个实施方式中，以1.O-lOmg/kg体重/天的剂量范围施用4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物。在一个实施方式中，神经损伤为脑损伤。在另一个实施方式中，神经损伤为OP导致的脑损伤。与其他的神经保护剂一起施用在某些实施方式中，4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物与另外的神经保护剂一起施用。这种神经保护剂的实例包括，但不限于，阿托品、解磷定和咪达唑仑。在一个实施方式中，4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物与阿托品一起施用。在另一个实施方式中，4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物与I-IOmg阿托品/kg体重剂量范围的阿托品一起施用。毒性测定可以用标准的药学方法在细胞培养或试验动物中测定4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物的毒性和治疗效果，例如，测定LD50(总数50%的致死剂量)和ED50(总数50%的治疗有效剂量)。致死剂量和治疗有效剂量之间的剂量比为治疗指数，其可以表示为LD50/ED50。优选具有大的治疗指数的化合物。尽管可以使用具有毒副作用的化合物，但应该注意设计这样的递药系统，该递药系统使这种化合物靶向于受累部位以便将对未受影响的细胞的潜在损害最小化，从而降低副作用。由细胞培养试验和动物研究得到的数据可用于制定用于人类的剂量范围。剂量优选在包括ED50的有很小或没有毒性的循环浓度范围中。剂量可以根据使用的剂型和采用的施用途径而在所述范围中变化。对于在本发明方法中使用的任何化合物，可以由细胞培养试验初步评价治疗有效剂量。可以在动物模型中制定剂量以获得循环血浆浓度的范围，该范围包括在细胞培养中测定的IC50(即，达到症状的半数最大抑制的测试化合物的浓度)。这种信息可被用于更准确地确定在人类中有用的剂量。例如通过高效液相色谱法可以测量血浆中化合物的水平。药物基因组学基于由药物基因组学领域中获得的知识，对于预防性和治疗性的处理方法，这样的处理会被具体地调整或修改。这里使用的“药物基因组学”包括对临床研究和市场中的药物应用，例如基因测序、统计遗传学和基因表达分析的基因组学技术。更具体地，该术语是指对受治者的基因如何确定他或她对药物的反应(例如，受治者的“药物反应表型”或“药物反应基因型”)的研究。这样，本发明的另一方面提供了根据个体的药物反应调整个体的用4R西松烷内酯的预防性地或治疗处理的方法。药物基因组学使得临床医师或内科医师有针对地对受治者进行预防性或治疗性处理(受治者将从以上处理中最大程度地受益)并且避免对受治者处理时使其经历毒性的与药物有关的副作用。总之，两种类型的遗传药理学条件(pharmacogeneticcondition)会是不同的。作为单因素传代的遗传条件改变药物作用于身体的方式(改变药效)或者作为单因素传代的遗传条件改变身体作用于药物的方式(改变药物代谢作用。)这些遗传药理学条件可能作为稀有的遗传缺陷出现或者作为自然发生的多态现象出现。例如，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症(G6PD)是一种常见的遗传性酶不全病，其主要的临床并发症是摄取氧化剂药物(抗疟药、磺胺类药物、镇痛药、硝基呋喃类药物)和食用蚕豆后的溶血。一种识别预测药物反应的基因的药物基因组学研究方法，称作“全基因组关联(genome-wideassociation)”主要依赖于由已知的基因相关位点组成的人类基因组的高分辨基因图谱(例如，“双等位”基因标记图谱，其由在人类基因组上的60，000-100，000多态或可变位点组成，其中每个有两个变体)。这样的高分辨基因图谱相当于有统计学意义数量的受治者的每个基因组图谱，所述受治者参加第Π/ΙΙΙ阶段药物试验以识别与具体观察的药物反应或副作用相关的基因。或者，这样的高分辨图谱可以由人类基因组中的大约一千万已知的单核苷酸多态性(SNPs)的组合来产生。这里所用的“SNP”为在DNA的延展中在单核苷酸碱基中发生的通常的变化。例如，每1，000个DNA碱基可发生一次SNP。SNP可能与疾病病变有关。然而，绝大多数SNP与疾病不相关。如果基于这种SNP的发生给出基因图谱，可以将个体根据他们个体基因组中具体的SNP图型分组编入基因类。以这样的方式，考虑到在那些遗传上类似的个体中可能是共同的特性，可以专为遗传上类似的个体调整治疗方案。因此，在精神分裂症患者的SNP图谱上绘制本发明的SRG基因图谱可以根据这里描述的基因方法来更容易地识别这些基因。或者，称作“候选基因途径(candidategeneapproach)”的方法可以用于识别预测药物反应的基因。根据这种方法，如果编码药物靶点的基因是已知的，则那个基因的所有通常的变体是非常容易在种群中识别的，并且如果这个基因具有与具体药物反应相关的另一种变体的变化形式就能够被确定。作为一个示例性的实施方式，药物代谢酶的活性是药物作用的强度和持续时间的主要决定因素。药物代谢酶(例如，N-乙酰转移酶2(NAT2)以及细胞色素P450酶CYP2D6和CYPZC19)的遗传多态性的发现已经解释了为什么一些受治者在服用标准和安全剂量的药物后并没有获得期望的药物疗效或显示出过度的药物反应和严重的毒性。这些多态性在种群中以两种表型表达，快代谢型和慢代谢型。慢代谢型表型的发生在不同的种群中是不同的。例如，CYP2D6的编码基因是高度多态性的并且在慢代谢型中已经识别了几种突变，这都引起功能性CYP2D6的缺乏。当慢代谢型CYP2D6和CYP2C19接受标准剂量时，他们非常频繁地经历过度的药物反应和副作用。如通过其CYP2D6形成的代谢产物吗啡介导的可待因的止痛效果所证实的，如果代谢产物是活性的治疗部分，则慢代谢型不显示治疗反应。另一个极端是所谓的“超快速代谢型”，其对标准剂量不响应。近来，由于CYP2D6基因扩增，已经识别了超快速代谢的分子基础。或者，称作“基因表达谱”的方法能被用于识别预测药物反应的基因。例如，服用药物的动物的基因表达能够提示是否已经开启与毒性相关的基因途径。由多于一个的上述药物基因组学途径得到的信息可用于确定预防性或治疗性处理个体的合适剂量和治疗方案。当用于剂量或药物选择时，这种知识能避免不利反应或治疗失败，从而用4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物处理受治者时提高治疗或预防效果。药物组合物本发明的另一方面进一步涉及包含4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物和药学上可接受的载体的药物组合物。这里使用的语言“药学上可接受的载体”是要包括与药物施用相容的任何和所有的溶剂、助溶剂、填料、稳定剂、粘合剂、吸收剂、碱(base)、缓冲剂、润滑齐IJ、控制释放的赋形齐、稀释齐、乳化齐、湿润齐、润滑齐、分散媒介、涂层、抗细菌或抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。这些媒介和试剂作为药学活性物质的用途在本领域中是公知的。除非任何传统的媒介或试剂与活性化合物不相容，否则就可以考虑将其用在所述组合物。也可以将佐剂(supplementaryagent)掺入所述组合物中。将本发明的药物组合物配制成与其要施用的途径相容。施用途径的实例包括例如静脉内、动脉内、鞘内、皮内、皮下的胃肠外的施用以及口腔、经皮(局部的)和经粘膜的施用。用于胃肠外的、皮内的或皮下的应用的溶液或混悬液可包括下列组分无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、非挥发性油、聚乙二醇、甘油；丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四醋酸；缓冲液，如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐以及用于调整渗透压的试剂，如氯化钠或右旋糖。可用如盐酸或氢氧化钠的酸或碱来调节PH值。胃肠外制剂可为封入由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量管型瓶。适用于注射用的药物组合物包括无菌水溶液或分散液和用于即时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、克列莫佛EL(CremophorEL)(BASF,Parsippany,NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有的情况下，注射组合物都应该是无菌的且应该是达到易注射能力的液体。其在制备和贮存条件下必须是稳定的且必须防止如细菌和真菌的微生物的污染作用而保藏。载体可为包括例如水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇和液态的聚乙二醇等)的溶剂或分散介质及其合适的混合物。例如，通过使用如卵磷脂的涂层，为分散剂时通过维持需要的颗粒尺寸以及通过使用表面活性剂可以维持适当的流动性。用各种抗细菌和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等，可以实现防止微生物的作用。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、如甘露醇、山梨醇等的多元醇和氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以延长注射组合物的吸收。按照需要，通过将需要量的4R西松烷内酯和上面列举的成分中的一种或组合混入适当的溶剂中，之后进行过滤灭菌可以制备无菌注射液。通常，通过将活性化合物混入无菌载体中来制备分散液，所述无菌载体包含基础的分散介质和上面列举的那些成分中的其他所需试剂。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其生成活性成分的粉末加上来自之前经过滤灭菌的其溶液中的任何其他需要的成分。口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用的载体。他们可以被封入胶囊中或压制成片剂。对于用于口服治疗施用的目的，活性化合物可以与辅料混合并以片剂、含片或胶囊的形式使用。口服组合物也可以使用用作漱口剂的流动载体来制备，其中流动载体中的化合物被经口施用、含漱然后吐出或吞咽。药学相容的粘合剂和/或辅助材料可以作为组合物中部分而包含其中。片剂、丸剂、胶囊、含片(troche)等可以包含任何下列成分或类似性质的化合物粘合剂，如微晶纤维素、黄芪胶或明胶；辅料，如淀粉或乳糖；崩解剂，如褐藻酸、羟基乙酸淀粉钠(Primogel)或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或斯泰特斯(Stertes)；助流剂，如胶状二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；或调味剂，如薄荷、水杨酸甲酯或香橙调味剂。对于吸入施用，以气溶胶喷雾剂的形式从雾化器或者包含合适的推进剂(如二氧化碳的气体)的压力容器或分配器中输送化合物。系统施用也可以通过经粘膜的或经皮的方式。对于经粘膜的或经皮施用，在制剂中使用对要穿过的屏障适用的渗透剂。这些渗透剂通常在本领域中是已知的，并且包括例如用于经粘膜施用的除污剂、胆盐和夫西地酸衍生物。经粘膜施用可以通过使用鼻喷雾剂或栓剂来实现。对于经皮施用，将生物活性化合物配制成本领域公知的软膏、油膏、凝胶剂或乳膏剂中。化合物也可以按用于直肠给药的栓剂(例如含有常规的栓剂基质，如可可脂和其他的甘油酯)或保留灌肠的方式来制备。在一个实施方式中，可包含生物活性化合物的治疗部分与保护该化合物避免其从体内快速清除的载体一起制备，如控释制剂，包括植入物和微囊给药系统。可以使用可生物降解的、生物相容性的聚合物，如乙烯基乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原11酸酯和聚乳酸。对那些本领域的技术人员来说，制备这些制剂的方法是很明显的。材料也可以从商业途径获得，例如从阿尔扎公司(AlzaCorporation)和诺华制药公司(NovaPharmaceuticals,Inc.)购得。脂质体混悬液(包括靶向受感染细胞的脂质体，该脂质体带有病毒抗原的单克隆抗体)也可用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法来制备。为了施用容易和剂量的均勻性，以剂量单元形式配制口服的或肠胃外组合物是特别有利的。这里所用的剂量单元形式包括对要被治疗的对象来说适合作为单一剂量的物理上独立的单元；每个单元包含经计算能产生所需治疗效果的预定量的活性化合物和需要的药物载体。对于个体处理来说，本发明的剂量单元形式的规格通过并直接依赖于活性化合物的独特特性和要得到的具体治疗效果、以及本领域中混合这种活性化合物的固有限制来确定。在另一种实施方式中，所述药物组合物进一步包含另一种神经保护剂。这种神经保护剂包括，但不限于，阿托品、解磷定和咪达唑仑。在一个实施方式中，所述实施方式进一步包含阿托品。试剂盒本发明也包括用于处理遭受OP导致的神经损害或易受其影响或有此风险的受治者的试剂盒。所述试剂盒包括装入合适容器中的4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物以及使用该试剂盒的说明。在一个实施方式中，以容易分配的方式配制4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物。在一个实施方式中，以单次剂量的方式封装4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物。在另一个实施方式中，所述试剂盒包含另一种神经保护剂，如阿托品。在另一个实施方式中，所述试剂盒进一步包含用于施用4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物的分配器，如注射器或吸入器。在一个实施方式中，神经损伤为脑损伤。通过下面的实施例进一步示例性地说明本发明，这些实施例不应解释为对本发明的限制。在本申请各处引用的参考文献、专利和公开的专利申请，以及附图和表格的内容均以参考的方式并入本申请中。^mmιM^m^i^mmm^mmmmmmm^im急性海马切片是研究早期突触兴奋性中毒事件和神经保护性事件的可选择的标本。在急性切片中，保留了原始组织的大部分回路，中间神经元与锥体细胞的比例是不变的，并且没有受体活性较大改变的证据。传入神经的刺激能够测量由30至60个椎体细胞产生的突触引发群峰电位(PS)。使用PS评价损害程度的优点在于，PS的尺寸直接与功能性活性锥体细胞的数量成比例(AndersenP，etal.，ExpBrainRes13:208-221)。另外，这种标本非常适于研究细胞死亡开始之前的早期功能性神经损害。可以容易地施用药物，并且能够监测电活动。然而，超过8-10小时之后，急性切片显示出相当程度的衰退。基于这种原因，仅几项研究是针对急性切片中的延迟细胞死亡(ffallisRA,etal.(1995)BrainRes674:75-81；WangT,etal.(1999)Stroke30:24004407)。试验性局部缺血对急性切片中的电活动的早期影响与培养切片中的延迟神经元死亡的比较与这样的观念是一致的，即电活动和死亡两者在不同时标中都表示相同的事件(SmallDL,etal.(1997)BrainRes753:209-218)。121-1A.切片制备和电生理记录解剖海马和制备切片的方法已经在先前的文献中描述过(FerchminPA,etal.(2003)JPharmacolExpTher305:1071-1078)。简言之，在冰上解剖海马；用手动切片机切割400μπι厚的横断切片并立即转移至培养室中。该培养室由围绕覆盖尼龙栅网的丙烯酸类板的控温浴槽组成；所述板被分成三个具有独立灌流的巷道。对于解剖和培养，使用95%O2,5%CO2饱和的标准人工脑脊液(ACSF)，其包含(以mM计):125NaCl、3.3KC1、1.25NaH2P04、2MgS04、2CaCl2、25NaHC03和10葡萄糖。在；34士1°C下，将切片放置在巷道内的，其位于栅网上在ACSF和加温加湿的95%O2,5%CO2的界面处。用置于辐射层中的双极电极以恒定电流刺激谢弗并行传入纤维(Shaffercollateralincomingfiber)0.ans。用填充有2MNaCl的阻抗为1至5ΜΩ的玻璃电极在椎体细胞层中记录得到的群峰电位(PS)。将两个大鼠的海马的二十七个切片均分在培养室的三个巷道中并在ACSF中培养一小时以使切片从解剖的创伤中恢复。解剖后一小时，确定需要引出阈值PS的最小刺激。然后用引出阈值PS所需强度的两倍的刺激来刺激各切片。最初的反应被计作PS范围(msXmv)并与试验处理完成并且用标准ACSF洗涤切片1小时以除去滞留药物作用后从相同位置记录的由相同刺激强度引出的最终反应作比较。在试验的末尾剩余的最初反应的百分率被用作电生理恢复的量度。1-2A最小神经毒性测试用标准的疲劳转棒仪实验在小鼠中检测由各化合物引起的最小神经毒性(DunhamNW,etal.(1957)JAmPharmAssocAmPharmAssoc(Baltim)46:208-209)。当被放在6转/分(r.p.m.)的旋转棒上时，未处理的对照小鼠能够长时间地维持它们的平衡。在三个连续试验中，每次小鼠都不能维持其平衡一分钟就能够证明存在神经损伤(tablesJP,etal.(1997)Co.LtdEurotext,Ch16，pp191-198.ISBN086196554)0。以30、100和300mg/kg的剂量(腹膜内注射，i.p.)注射各化合物并在注射后0.5和4小时检测。通过位置感觉测试以及步态和姿态测试(在上方观察(Supra))检查大鼠的行为毒性。以30mg/Kg口服施用4R，并在施用后0.25,0.5,1.0,2.0和4.0小时进行观察。实施例2在急性海马切片中对氧磷减少PSS范围图2A示例性地说明了用于确定POX对PS(在大鼠海马切片的CAl区域记录)的影响的试验设计。在1μM浓度下，POX将PS范围减少至对照值的60%。追加的试验表明损害的严重性没有随暴露时间的延长(从15分钟至20分钟和30分钟)而增大(未显示数据)。在图2Β中显示了POX浓度曲线。按照图2Α中的设计，用0μM(对照)至200μM的POX培养切片15分钟。PS的最大抑制接近50%;剩余50%的PS范围耐受POX直至200μM的最大浓度。POX的IC50接近1μΜ。实施例3:4R西松烷内酯减轻POX的神经毒性作用图3A示例说明了1μMPOX对PS的影响以及用2μM4R西松烷内酯将其逆转。在POX之前或之后立即将4R西松烷内酯应用到切片上一小时。在这个试验中，单独使用ΙμΜPOX将PS恰好降低到对照值的60%以下。当在POX之前应用2μM的4R西松烷内酯时，得到将近100%的恢复；而在POX之后立即应用4R西松烷内酯，则得到超过80%的恢复。图;3Β示出了用200μMPOX进行的类似的试验，200μM的POX将PS减少至将近对照值的40%。当在POX之前应用2μM的4R西松烷内酯时，得到90%的恢复；而在POX之后立即应用4R西松烷内酯得到80%的恢复。这些结果表明无论是在大量POX之前还是之后立即施用2μM的4R西松烷内酯，其提供了对POX的几乎完全的保护。^mm4阿托品是最常用的OP中毒的体内解毒剂。设计下面的试验用来测试阿托品是否对切片有毒以及它是否能减轻POX施加的损害。在图4中显示的结果表明用ΙμΜ阿托品培养切片1小时不影响PS范围。另外，在POX之前用阿托品预孵育1小时未提高PS的恢复。因此，在测试条件下，阿托品既对切片无害也对200μMPOX无神经保护作用。接着，测试了4R西松烷内酯和阿托品的组合的作用。图5Α示出了在200μMPOX之后15分钟应用10μM4R西松烷内酯将PS范围从对照的40%提高到对照的70%。然而，当将10μM4R西松烷内酯与ΙμΜ阿托品一起应用时，实现了100%的保护。因此，4R西松烷内酯和阿托品的组合在保护切片免受POX侵害时比单独的4R更有效。在洗去POX30分钟或60分钟之后也应用了同样的4R西松烷内酯和阿托品的组合。图5Β示出了有希望的结果，这种组合在30分钟后(90%)以及甚至在1小时延迟后(70%)提供了显著的保护。種·5:4R碰舶酉雜*斷丨、剛·iTM/丨、白■潮牛在神经障碍和中风国家研究所(NationalInstituteofNeurologicalDisordersandStroke(NINDS))通过抗惊厥剂蹄选禾呈序(AnticonvulsantScreeningProgram(ASP))测试4R西松烷内酯及其异构体4S西松烷内酯的神经毒性。测试结果在表1中示出。所有结果均报告为在给定时间点和剂量下未通过试验的动物数量与通过试验的数量的比值。仅在腹膜内(i.P.)注射300mg/kg的大剂量4R西松烷内酯后0.5小时发现可疑毒性。4个小鼠中有1个由杆上掉下来反应出可疑的毒性。4S显示出更大的毒性，其中，注射后0.5小时，当剂量为100mg/kg时，8个小鼠中有1个未通过试验，当剂量为300mg/kg时，4个小鼠中有3个未通过试验。对大鼠口服施用30mg/kg的4R西松烷内酯15分钟到4小时后没有毒性。在口服施用30mg/kg的4R最迟至4小时后，4个大鼠中没有一个未通过位置感觉测试或步态和姿态测试。结果表明(1)4R西松烷内酯在至少最高至100mg/kg(可能最高至300mg/kg)的腹膜内注射(i.P.)剂量下在小鼠中无毒性；(2)在30mg/kg(口服)的剂量下4R西松烷内酯在大鼠中无毒性；(3)在小鼠中4S西松烷内酯比4R西松烷内酯有稍微高些的毒性。表1:4R西松烷内酯和4S西松烷内酯在小鼠中的毒性权利要求1.一种保护受治者免受有机磷酸酯(OP)导致的神经损伤的方法，包括向所述受治者施用有效量的4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物。2.权利要求1所述的方法，其中所述神经损伤是脑损伤。3.权利要求1所述的方法，其中，在暴露于含OP的毒剂之前或之后立即施用所述4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物。4.权利要求1所述的方法，其中，以0.002-10mg/kg体重的剂量范围施用所述4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物。5.权利要求1所述的方法，其中，以0.5-5mg/kg体重的剂量范围口服施用所述4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物。6.权利要求1所述的方法，其中，以0.1-0.5mg/kg体重的剂量范围肌内注射施用所述4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物。7.权利要求1所述的方法，其中，以5-50μg/kg体重的剂量范围经脑动脉施用所述4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物。8.权利要求1所述的方法，其中，所述4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物与选自阿托品、解磷定和咪达唑仑中的另一种神经保护剂一起施用。9.权利要求1所述的方法，其中，所述4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物与l-10mg/kg体重的阿托品一起施用。10.一种治疗受治者中OP导致的神经损害的方法，包括向所述受治者施用有效量的4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物。11.权利要求10所述的方法，其中，以0.5-5mg/kg体重的剂量口服施用所述4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物。12.—种神经保护的药物组合物，包含4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物；以及药学上可接受的载体。13.权利要求12所述的药物组合物，进一步包含另一种神经保护剂。14.权利要求13所述的药物组合物，其中，所述另一种神经保护剂选自阿托品、解磷定和咪达唑仑中。15.权利要求14所述的药物组合物，其中，所述另一种神经保护剂为阿托品。16.一种试剂盒，用于保护受治者免受OP导致的神经损害或治疗具有OP导致的神经损害的受治者，该试剂盒包含4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物；和关于如何使用所述4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物的说明。17.权利要求16所述的试剂盒，其中，以容易分配的单次剂量的方式配制所述4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物。18.权利要求16所述的试剂盒，其进一步包含另一种神经保护剂。19.权利要求18所述的试剂盒，其中，所述神经保护剂为阿托品。20.权利要求16所述的试剂盒，其进一步包含用于施用4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物的分配器。21.一种保护受治者免受有机磷酸酯(OP)导致的神经损伤的方法，包括向所述受治者施用有效量的4R西松烷内酯。22.权利要求21所述的方法，其中所述神经损伤是脑损伤。23.一种治疗受治者中OP导致的神经损害的方法，包括向所述受治者施用有效量的4R西松烷内酯。24.权利要求23所述的方法，其中，以0.5-5mg/kg体重的剂量口服施用4R西松烷内酯。25.一种神经保护的药物组合物，包含4R西松烷内酯；和药学上可接受的载体。26.—种试剂盒，用于保护受治者免受OP导致的神经损害或治疗具有OP导致的神经损害的受治者，该试剂盒包含4R西松烷内酯；和关于如何使用所述4R西松烷内酯的说明。全文摘要本发明公开了一种保护和/或治疗神经损伤的方法和组合物。一方面，本申请公开了一种保护和/或治疗受治者免受有机磷酸酯导致的神经损伤的方法。该方法包括向受治者施用有效量的4R西松烷内酯、4S西松烷内酯或西松烷内酯类似物。另一方面，本申请公开了用于保护和/或治疗受治者免受有机磷酸酯导致的神经损伤的神经保护药物组合物。还公开了用于保护和治疗受治者免受有机磷酸酯导致的神经损害的试剂盒。文档编号A61K31/335GK102481265SQ201080032113公开日2012年5月30日申请日期2010年7月2日优先权日2009年7月14日发明者佩德罗·A·费尔什米恩,拜伦·D·福特,韦斯娜·A·埃泰罗维奇申请人:莫尔豪斯医学院