专利名称：具有延长的体内功效的生长激素的制作方法
技术领域：
本发明涉及经由亲水间隔基与白蛋白结合残基连接的生长激素化合物和制备及使用所述化合物的方法。这些化合物具有延长的作用特征并可用于治疗。
背景技术：
通过让基团与肽缀合来改变肽的性质和特点是众所周知的，所述缀合恰当改变肽的性质。所述缀合一般要求肽中的一些官能团与缀合基团中的另一官能团反应。通常将氨基(例如N-末端氨基或赖氨酸中的ε -氨基)与合适的酰化试剂联用，例如W02005/027978 中对GLP-I所述的。或者,可让聚乙二醇(PEG)或其衍生物与蛋白质连接。综述参见Exp. Opion. Ther. Patent.，14，859-894，(2004)。业已显示PEG与生长激素连接可对生长激素血浆半衰期有正面作用，见WO 03/044056。先前业已阐述利用羧肽酶来修饰肽的C-末端。WO 92/05271揭示了利用羧肽酶和亲核化合物来使C-末端羧基酰胺化，WO 98/38285揭示了特别合适该目的的羧肽酶Y的变体。EP 243 929揭示了利用羧肽酶将多肽、报告基团或细胞毒素剂掺入蛋白质或多肽的C-末端。WO 2005/035553阐述了通过在肽的C-末端酶法掺入官能团来选择性缀合肽的方法。先前业已使用转谷氨酰胺酶来改变肽的性质。在食品工业特别是在乳制品工业中，许多技术可用于例如使用转谷氨酰胺酶来交叉结合肽。其它文献揭示了用转谷氨酰胺酶来改变生理学活性肽的性质。EP950665、EP 785276和 Sato，Adv. Drug Delivery Rev. 54, 487-504(2002)揭示了在转谷氨酰胺酶存在时包含至少一个Gln的肽和胺-官能化PEG或类似配体之间的直接反应，Wada，Biotech. Lett. 23,1367-1372 (2001)揭示了通过转谷氨酰胺酶让β-乳球蛋白与脂肪酸直接缀合。作为WO 2005/070468公布的国际专利申请揭示了利用转谷氨酰胺酶掺入柄(handle)，所述柄可连接缀合基团。生长激素是不仅参与体细胞生长调控而且还参与蛋白质、碳水化合物和脂质新陈代谢调控的关键激素。生长激素的主要作用是促进生长。人类生长激素是具以下序列的 191 个氨基酸残基的蛋白质FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSL CFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLE DGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF(SEQ ID NO :1)。利用给予人生长激素及其密切相关变体来治疗各种生长激素缺乏相关疾病。，在胃肠外即借助针给予作为肽的生长激素。此外，生长激素特征为半衰期相对短，因此需要频繁给予，给患者带来相应的疼痛和不便。因此，仍然需要提供具有改进的药理学特性例如延长的半衰期的生长激素化合物。本发明提供具有改进的药理学性质的新型生长激素缀合物及其生产方法。发明简述皮下给予药物化合物的生物利用度可与吸收率相关。化合物通过皮下毛细血管紧密连接的能力可部分涉及其物理和化学性质以及化合物的分子大小或流体力学体积。蛋白质缀合物例如含40kDa PEG的聚乙二醇化hGH(PEG-hGH)具有150_250kDa的表观分子量。 含共价结合的白蛋白的hGH分子具有87kDa的分子量，而含非共价结合的白蛋白的hGH分子将因时间与白蛋白部分解离，因此具有22kDa的分子量。预期呈解离状态所花的时间至少部分视白蛋白结合部分的亲和力而定。因此，含非共价结合的白蛋白的hGH分子的吸收率可快于PEG-hGH。当用对白蛋白具有较低亲和力的白蛋白结合部分时可获得增加的吸收率。另外，为白蛋白结合部分与hGH提供连接的接头和/或间隔基的物理和化学性质将影响所述化合物的功能。本发明人令人惊讶地发现，生长激素化合物(GH)可经由亲水间隔基选择性地与白蛋白结合残基连接，以获得具有改进的药理学性质的GH缀合物，所述亲水间隔基用化学部分隔开GH和白蛋白结合残基，所述化学部分具有mLogP < O-或cLogP < O. 5。此外，本发明以可选择性进行将白蛋白结合残基经由亲水间隔基引入人生长激素 (hGH)(其中可保留大部分生物活性)的观察为基础。优选在对应于具有SEQ ID No. I序列的hGH的I位苯丙氨酸、40位谷氨酰胺和/或141位谷氨酰胺的位置，经由亲水间隔基引入白蛋白结合残基。转谷氨酰胺酶(TG酶)尤其是来自茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraenae)或利迪链霉菌(Streptomyces Iydicus)的TG酶的使用，允许经由亲水间隔基在40和/或141位选择性引入白蛋白结合残基，其余的11个谷氨酰胺残基保持不动，尽管谷氨酰胺是转谷氨酰胺酶的底物这一事实。因此，在本发明一个实施方案中，生长激素化合物(GH)经由亲水间隔基与一个白蛋白结合残基连接。通常白蛋白结合残基经由亲水间隔基连接到hGH的N-末端、40位或 141位。在另一实施方案中，两个或三个白蛋白结合残基经由亲水间隔基连接到hGH的N-末端、40位和/或141位。在本发明另一实施方案中，亲水间隔基具有下式-X1-X2-X3-X4-其中X1 为-W1- [ (CHR1) n-ff2] ffll- {[ (CH2) nlEI] ffl2- [ (CHR2) I2-ff3] ffl3} n2-；X2 为-[(CHR3) I3-W4] m4_ {[ (CH2) n3E2] m5_ [ (CHR4) I4-ff5] J n4_ ；X3 为-[(CHR5) I5-ff6] m7-；X4 为-F-Dl-(CH2) I6-D2_ ;II、12、13、14、15 和 16 独立选自 0-16 ；ml、m3、m4、m6 和 m7 独立选自 0-10 ;m2和m5独立选自0-25 ；nl、n2、n3 和 n4 独立选自 0-16 ;F为芳基、杂芳基(hetaryl)、吡咯烷-2，5-二酮或价键，其中芳基和杂芳基任选被以下基团取代卤素、-CN、-OH、-C (O) OH、-C (O) NH2、-S (O) 20H 或 C1^6-烷基；R1、R2、R3、R4 和 R5 独立选自氢、-C (O) OH、-C (O) NH2、-S (O) OH、-S (O) 20H、-NH-C (= NH)-NH2, CV6-烷基、芳基或杂芳基；其中烷基、芳基和杂芳基任选被以下基团取代卤素、-C (O) OH、-C (O) NH2、-S (O) OH、-S (O) 20H、-CN 或-OH ；
D1、D2、E1和E2独立选自-0_、-NR6-、-N(C0R7)-或价键；其中R6和R7独立表示氢或C^6-烷基；W1-W6 独立选自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2-、-CH2NHC(O)-、-C(O) NHS(O)2-, -S (O)2NHC (O)-、-OC(O) NH-, -NHC(O)O-, -C(O) CH2-, -CH2C (O)-、-C(O)CH = CH-, -CH = CHC(O)-、-(CH2)sl-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或价键；其中 si 为 O 或 I。本发明又一目的是提供用于通过按照本发明方法缀合所述蛋白质来改进GH性质的方法。定义在本发明上下文中，本文所用术语“生长激素化合物”意指哺乳动物来源的生长激素(例如人、牛或猪生长激素)和重组生长激素(例如重组人、牛或猪生长激素)和所述生长激素的变体。本文所用“GH”和“生长激素化合物”可互换使用。当GH为哺乳动物来源的生长激素变体例如hGH和重组hGH时，所述变体应理解为通过以下步骤获得的化合物用另一天然或非天然氨基酸取代生长激素例如hGH序列中的一个或多个氨基酸残基；和/或将一个或多个天然或非天然氨基酸添加到生长激素例如hGH序列中；和/或从生长激素例如hGH序列中缺失一个或多个氨基酸残基，其中这些步骤中的任何一个可任选后接一个或多个氨基酸残基的进一步衍生。具体而言，在一个氨基酸残基被来自相同组的另一氨基酸残基取代(即被另一具有相似特性的氨基酸残基取代)的情况下，这类取代为保守的。可基于其特性将氨基酸适宜地分为以下组别碱性氨基酸(例如精氨酸、赖氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸(例如谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(例如谷氨酰胺、半胱氨酸和天冬酰胺)、 疏水氨基酸(例如亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(例如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)和小氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸)。通常GH与 hGH具有至少80%同一性，具有hGH的至少20%的生长激素活性，如本文测定I所测定。在本发明上下文中，本文所用术语"白蛋白结合残基"意指与人血清白蛋白非共价结合的残基。连接生长激素化合物(GH)的白蛋白结合残基通常对于人血清白蛋白具有低于约ΙΟμΜ或甚至低于约ΙμΜ的结合亲和力。已知一系列白蛋白结合残基属于含有12-40个碳原子的线性及分支的亲脂部分、含环戊烷并菲骨架的化合物和/或具有 10-45个氨基酸残基的肽等。可通过表面等离子共振测量白蛋白结合特性，如J. Biol. Chem. 277(38) ,35035-35042，(2002)中所述。本文所用术语"亲水间隔基"意指用化学部分隔开生长激素化合物和白蛋白结合残基的间隔基，所述化学部分包含至少5个非氢原子，其中非氢原子的30-50%为N或O。在本发明上下文中，术语“转氨基作用”和相关术语意欲表示其中谷氨酰胺侧链的酰胺氮与另一化合物的氮(具体而言为来自另一含氮亲核体的氮)交换的反应。转谷氨酰胺酶(E. C. 2. 3. 2. 13)亦称为蛋白-谷氨酰胺-Y -谷氨酰转移酶，其催化以下一般反应
O O Q J-NH2 + Q1-NH2 -- Q-^N-Q' + NH3
OQ-C(O)-NH2(胺受体)可代表含有谷氨酰胺残基的肽或蛋白质，Q’ -NH2(胺供体)代表含有胺的亲核体。或者，Q-C (O)-NH2和Q’-NH2可分别代表胺受体和含有赖氨酸的肽或蛋白质。然而，在本发明中，Q-C(O) -NH2代表含有谷氨酰胺残基的生长激素，Q’ -NH2代表如上所述的含有胺的亲核体。有用的转谷氨酰胺酶实例包括微生物转谷氨酰胺酶，例如来自以下的转谷氨酰胺酶茂原链轮丝菌、肉桂链霉菌(Streptomyces cinnamoneum)和灰肉链霉菌 (Streptomyces griseocarneum)(全部揭不于US 5，156，956中，其通过引用并入本文中) 和淡紫灰链霉菌(Streptomyces Iavendulae)(揭示于US 5，252，469中，其通过引用并入本文中)和拉达卡链霉菌(Streptomyces ladakanum) (JP 2003/199569,其通过引用并入本文中)。应该注意，从前的链轮丝菌属(Streptoverticillium)的成员现在包括在链霉菌属(Streptomyces)中(Kaempfer, T. Gen. Microbiol. 137,1831-1892 (1991))。其它有用的微生物转谷氨酰胺酶已分离自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(揭示于US 5，731，183,其通过引用并入本文中)和各种黏菌(Myxomycetes)。有用的微生物转谷氨酰胺酶其它实例为揭示于WO 96/06931(例如来自Bacilus Iydicus的转谷氨酰胺酶)和 WO 96/22366中的转谷氨酰胺酶，二者都通过引用并入本文中。有用的非微生物转谷氨酰胺酶包括豚鼠肝转谷氨酰胺酶和来自各种海产来源如扁鱼真鲷(Pagrus major)(揭示于 EP-0555649,其通过引用并入本文中)和日本牡贩长牡贩(Crassostrea gigas)(揭示于 US5, 736，356，其通过引用并入本文中)的转谷氨酰胺酶。在本发明上下文中，术语“不可接近的”意欲表示某物不存在或从其不能被触及的意义而言实际上不存在。当表明待缀合的蛋白质的官能团不可接近的时，意欲表示该蛋白质中不存在所述官能团，或若存在的话在某种程度上其被阻止参与反应。举例而言，所述官能团可埋在蛋白质结构深处，因而被屏蔽而不能参与反应。要认识到的是，官能团是否可接近视反应条件而定。可设想的是，例如在变性剂存在下或在高温下，蛋白质可展开而暴露出本来不可接近的官能团。应该理解，“不可接近的”意指“在选择用于特定目的反应的反应条件下不可接近的”。术语“烷烃”或“烷基”意欲表示饱和、线性、分支和/或环状烃。除非用另一碳原子数目规定，否则术语意欲表示具1-30(包括端值)个碳原子的烃，例如1-20(包括端值) 个、例如1-10(包括端值)个、例如1_5(包括端值)个。术语烷基和亚烷基分别是指相应的自由基和_■价自由基。术语"Cu烧基"是指具有1-6个碳原子的直链或分支饱和烃。所述基团实例包括但不限于甲基、2-丙基、I-丁基、2- 丁基、2-甲基-2-丙基、2-甲基-I-丁基和正己基。术语"C3,环烷基"通常是指环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、 环壬基和环癸基。术语“烯烃”意欲表示包含至少一个碳碳双键的线性、分支和/或环状烃。除非用另一碳原子数目规定，否则术语意欲表示具2-30 (包括端值)个碳原子的烃，例如2-20 (包括端值)个、例如2-10 (包括端值)个、例如2-5 (包括端值)个。术语烯基和亚烯基分别是指相应的自由基和~■价自由基。术语“炔烃”意欲表示包含至少一个碳碳三键的线性、分支和/或环状烃，其可任选包含一个或多个碳碳双键。除非用另一碳原子数目规定，否则术语意欲表示具2-30(包括端值)个碳原子的烃，例如2-20(包括端值)个、例如2-10(包括端值)、例如2-5 (包括端值)个。术语炔基和亚炔基分别是指相应的自由基和二价自由基。术语“同素环状芳族化合物”意欲表示芳族烃，例如苯和萘。术语“杂环化合物”意欲表示包含5、6或7个环原子的环状化合物，所述环原子中的1、2、3或4个为选自N、0和/或S的杂原子。实例包括杂环芳族化合物，例如噻吩、呋喃、 吡喃、吡咯、咪唑、吡唑、异噻唑、异_唑、吡唆、吡嗪、嘧唆、哒嗪以及其部分或完全氢化的等同物，例如哌唳、卩比唑烧(pirazolidine)、卩比咯烧、卩比咯啉(pyroline)、咪唑烧、咪唑啉、哌嗪和吗啉。术语“杂烷烃”、“杂烯烃”和“杂炔烃”意欲表示其中一个或多个杂原子或基团已插入到所述部分的结构中的如上所定义的烷烃、烯烃和炔烃。杂基团和原子的实例包括-0-、-S-、-S (O) -、_S (O) 2-、_C(0) —C(S)-和-N (R*)-，其中 R* 表不氧或 C1-C6-烧基。杂烧经实例包括
权利要求
1.一种生长激素缀合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，所述缀合物包含经 由亲水间隔基与白蛋白结合残基连接的生长激素化合物(GH)。
2.权利要求I的缀合物及其药学上可接受的盐、溶剂化物和前药，其中所述生长激素 缀合物具有式(I)A-W-B-GH (I)其中GH表示生长激素化合物；B表不未水间隔基；W为连接A和B的化学基团；和 A表不白蛋白结合残基。
3.权利要求1-2中任一项的缀合物，其中GH为hGH(SEQID NO :1)。
4.权利要求2-3中任一项的缀合物，其中B具有下式-X1-X2-X3-X4-,其中X1 为-'^-[(CHROn-Wi-IKCH^ElL-KCHRtHU-；X2 为-[(CHR3) I3-W4] m4_ {[ (CH2) n3E2] m5- [ (CHR4) I4-ff5] J n4_ ；X3 为-[(CHR5) I5-ff6] m7-；X4 为 F-Dl-(CH2)I6-D2-;II、12、13、14、15 和 16 独立选自 0-16 ； ml、m3、m4、m6 和 m7 独立选自 0-10 ； m2和m5独立选自0-25 ； nl、n2、n3和n4独立选自0-16 ；F为芳基、杂芳基、吡咯烷_2，5-二酮或价键，其中所述芳基和杂芳基任选被以下基团 取代卤素、-CN、-OH、-C (O) OH、-C (O) NH2、-S (O) 20H 或(^6-烷基；R1、R2、R3、R4 和 R5 独立选自氢、-C(0)0H、-C(O)NH2, -S(O)OH、-S(0)20H、-NH-C(= NH)-NH2, CV6-烷基、芳基或杂芳基；其中所述烷基、芳基和杂芳基任选被以下基团取代卤 素、-C (O) OH、-C (O) NH2、-S (O) OH、-S (O) 20H、-CN 或-OH ；DU D2、El和E2独立选自_0_、-NR6-, -N(CORt)-或价键；其中R6和R7独立表示氢或 C1^6-烷基；W1-W6 独立选自-C (O) NH-、-NHC (O)-、-C (O) NHCH2-、-CH2NHC (O)-、-C(O) NHS(O)2-, -S (O)2NHC (O)-、-OC(O) NH-, -NHC(O)O-, -C(O) CH2-, -CH2C (O)-、-C(O)CH = CH-、-CH = CHC (O) -、- (CH2) s2-、-C (O) -、-C (O) 0_、-OC (O)-或价键；其中 s2 为 O 或 I。
5.权利要求2-4中任一项的缀合物，其中W具有下式-W7-Y-,其中Y为-(CH2) I7-C3_10-环烷基-W8-或价键；17 为 0-6 ；W7 选 自-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2-、-CH2NHC(O)-、-C (O) NHS(O)2-, -S (O)2NHC (O)-、-OC (O) NH-、-NHC(O)O-, -C(O) CH2-, -CH2C (O)-、-C(O)CH =CH-、-CH = CHC (O) -、- (CH2) s3-、-C (O) -、-C (O) 0_、-OC (O)-或价键；其中 s3 为 O 或 I ;W8 选自-C(O)NH-、-NHC (O)-、-C(O)NHCH2-、-CH2NHC(O)-、-C (O) NHS(O)2-, -S (O)2NHC (O)-、-OC (O) NH-、-NHC(O)O-, -C(O) CH2-, -CH2C (O)-、-C(O)CH = CH-、-CH = CHC (O) -、- (CH2) s4-、-C (0) -、-C (0) 0-、-OC (0)-或价键；其中 s4 为 O 或 I。
6.权利要求4-5中任一项的缀合物，其中II、12、13、14、15 和 16 独立为 0-6 ；ml、m3、m4、m6 和 m7 独立为 0-6 ； m2和m5独立为0-10 ;和 nl、n2、n3 和 n4 独立为 O-IO0
7.权利要求4-6中任一项的缀合物，其中Dl和D2独立选自-O-或-NR6-或价键。
8.权利要求4-7中任一项的缀合物，其中El和E2独立选自-O-或-NR6-或价键。
9.权利要求4-8中任一项的缀合物，其中W1-W8独立选自-C(0)NH-、-NHC(O)-,-C(O) NHCH2-、-CH2NHC (O) -、-C (O) NHS (O) 2_、-S (O) 2NHC (O)-或价键。
10.权利要求4-9中任一项的缀合物，其中R1、R2、R3>R4和R5独立选自氢、-C(O) OH、-C (O) NH2、-S (O) 20H 或 Cp6-烷基；其中所述烷基任选被-C (O) OH、-C (O) NH2、-S (O) 20H 取代。
11.权利要求2-10中任一项的缀合物，其中A选自
12.权利要求1-11中任一项的缀合物，其中所述白蛋白结合残基经由亲水间隔基与所述生长激素化合物的对应于SEQ ID No. I的40位的位置的谷氨酰胺残基或对应于SEQ ID No. I的141位的位置的谷氨酰胺残基或N-末端残基连接。
13.前述权利要求中任一项的缀合物，其中所述化合物选自
14.一种药物组合物，所述组合物包含任选与药学上可接受的赋形剂组合的权利要求 1-13中任一项的缀合物。
15.权利要求1-13中任一项的缀合物在制备以下药物中的用途，所述药物用于治疗特纳综合征；普-韦综合征(PWS);努南综合征；唐氏综合征；慢性肾脏疾病、幼年型类风湿关节炎、囊性纤维化、接受HAART治疗的儿童HIV感染(HIV/HALS儿童)；小于胎龄(SGA)出生的矮小儿童；非SGA的以极低出生体重(VLBW)出生的儿童的身材矮小症；骨骼发育不良； 软骨发育不良；软骨发育不全；特发性身材矮小症(ISS);成人GHD ;长骨骨折，所述长骨为例如胫骨、腓骨、股骨、肱骨、桡骨、尺骨、锁骨、掌骨、跖骨和指骨；海绵骨例如头骨、手腕骨和脚底骨的骨折；例如手、膝或肩中的腱或韧带手术后的患者；进行或经历牵拉骨生成技术的患者；髋关节置换或关节盘置换、关节盘修复、脊柱融合或例如在膝、髋、肩、肘、腕或颚中的假体固定后的患者；其中已固定骨接合材料例如钉、螺钉和板的患者；骨折不愈合或畸形愈合的患者；例如胫骨或第一脚趾的骨解剖后的患者；移植物植入后的患者；创伤或关节炎引起的膝关节软骨退化；特纳综合征患者中的骨质疏松症；男性骨质疏松症；长期透析的成年患者(AP⑶)；AP⑶中营养不良相关的心血管疾病；AP⑶中的恶病质逆转；AP⑶ 中的癌症；AP⑶中的慢性抽象性肺病；AP⑶中的HIV ;AP⑶老年人；AP⑶中的慢性肝病、 APCD中的疲劳综合征；克罗恩病；肝功能受损；具有HIV感染的男性；短肠综合征；向心性肥胖；HIV相关脂肪营养不良综合征(HALS);男性不育症；大选择性手术、酒精/药物解毒或神经创伤后的患者；老化；虚弱的老年人；骨关节炎；创伤性损伤的软骨；勃起功能障碍； 纤维肌痛；记忆障碍；抑郁；外伤性脑损伤；蛛网膜下腔出血；极低出生体重；代谢综合征； 糖皮质激素性肌病；糖皮质激素治疗导致的儿童身材矮小症，加速肌肉组织、神经组织或伤口愈合；加速或改善流到损伤组织的血流；或降低损伤组织的感染率。
全文摘要
本发明涉及针对皮下给药优化的多肽化合物，所述化合物由具有提供与白蛋白的非共价结合的接头的生长激素缀合物例示。
文档编号A61K47/48GK102612376SQ201080035764
公开日2012年7月25日 申请日期2010年8月6日 优先权日2009年8月6日
发明者C·贝伦斯, H·S·安德森, J·布夏特, J·苏, L·诺斯科夫-劳里特森, N·L·约翰森 申请人:诺沃-诺迪斯克保健股份有限公司