专利名称：用于在对象中调节smn2剪接的组合物和方法
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新合成的真核mRNA分子，称为初级转录物或mRNA前体，在翻译前被加工。mRNA前体的加工包括添加5’甲基化帽和在转录物的3’末端加上约200-250个碱基的poly (A)尾。从mRNA前体到mRNA的加工经常还包括mRNA前体的剪接，其发生在90-95%哺乳动物mRNA的成熟过程中。内含子(或插入序列)是mRNA前体中的某些区域，其不包含在成熟mRNA的编码序列中。外显子是初级转录物的某些区域，其仍保留在成熟mRNA中。外显子被剪接在一起，以形成成熟的mRNA序列。剪接结点也被称作剪接点，其中结点的Y端通常称作“5'剪接位点”或“剪接供体位点”，而3,端则称作“3'剪接位点”或“剪接受体位点”。在剪接过程中，上游外显子的3’末端与下游外显子的5’末端连接。这样，未剪接的mRNA前体在内含子的5’末端具有一个外显子/内含子结点，且在内含子的3’末端具有一个内含子/外显子结点。将内含子除去后，在成熟mRNA的有时被称作外显子/外显子结点或边界的地方，外显子是连续的。隐蔽剪接位点在通常情况下很少使用，但当通常的剪接位点被阻断或无法利用时可以使用。可变剪接被定义为将不同组合的外显子剪接在一起，通常可以从单个基因得到多种mRNA转录物。点突变可导致mRNA前体加工异常，高达50 %的人类遗传病是由这样的点突变导致的。此类点突变可以破坏目前使用的剪接位点，或者可以创造出新的剪接位点，导致产生的mRNA转录物包含不同组合的外显子或出现外显子缺失。点突变还能导致隐蔽剪接位点的激活或破坏调控顺式元件(即剪接增强子或沉默子)(Cartegni et al. , Nat. Rev.Genet. ,2002,3,285-298 ；Drawczak et al. , Hum. Genet. , 1992,90,41-54)。将反义寡核苷酸已被用于靶向作用于那些在某些遗传病中导致异常剪接的突变，以重新剪接并获得所需的剪接产物(Kole, Acta Biochimica Polonica，1997，44，231-238)。反义化合物还可用于改变天然存在的可变剪接变体的比率，如Bcl-x mRNA前体的长型或短型(美国专利6，172，216 ;美国专利6，214，986 ；Taylor et al.，Nat.Biotechnol. 1999，17，1097-1100)，或用于强行跳过包含提前终止的密码子的特定外显子(Wilton et al.，Neuromuscul. Disord.，1999，9，330-338)。美国专利 5，627，274 和 WO94/26887公开了组合物和方法，其使用不激活RNAse H的反义寡核苷酸，来对抗包含突变的mRNA前体分子的异常剪接。近端型脊髓性肌萎缩症(SMA)是一种遗传性的、神经退行性病变，其特征为脊髓运动神经元的丧失。SMA是一种发病较早的常染色体隐性遗传病，是目前导致婴儿死亡的首要原因。SMA在不同患者中的严重性不同，因此将其分成三类。I型SMA是最严重的形式，患者在出生时或出生后6个月内发病，一般在2岁以内死亡。患有I型SMA的儿童无法坐下或行走。II型SMA是中间形式，患者能够坐下，但不能站立或行走。患者患有III型SMA的，即该疾病的慢性形式，一般在出生后18个月后发展成SMA(Lefebvre et al. ,Hum. Mol.Genet. ，1998，7，1531-1536)。导致SMA的分子机制是运动神经元存活基因I (SMNl)的两个拷贝均缺失，SMNl也称为SMN端粒，这种蛋白是一种多蛋白复合物的一部分，该多蛋白复合物被认为参与小核糖核酸蛋白snRNP生物合成和循环。在染色体5ql3的复制区存在一个基本相同的基因SMN2，也称为SMN着丝粒，其调节疾病的严重程度。正常SMNl基因的表达仅导致运动神经元存活基因(SMN)蛋白的表达。尽管SMNl和SMN2都能够编码相同的蛋白，但SMN2在其外显子7的+6位含有翻译沉默突变，会导致在SMN2转录物中外显子7的包含不足。这样，SMN2主要形成为被截短的版本，缺乏外显子7，其不稳定且无活性(Cartegni and Krainer7Nat.Genet.，2002，30，377-384)。SMN2 基因表达产生约 10-20% 的 SMN 蛋白和 80-90%不稳定 /非功能性的SMNA 7蛋白。SMN蛋白在剪接体装配过程中的作用已被验证，且其还可以介导mRNA在神经元的轴突和神经末梢间的转运。反义技术可有效调节一种或多种特定基因产物，包括可变剪接产物的表达，且其在多种治疗、诊断和研究应用上具有独特的作用。反义技术的原理为，反义化合物可与靶核酸杂交，通过多种反义机制之一调节基因表达的活性，例如转录、剪接或翻译。反义化合物的序列特异性使其成为一种极具吸引力的工具，用于靶点验证和基因功能化，以及作为治疗手段用于选择性调节疾病相关基因的表达。本领域已知某些与SMN2互补的反义化合物，参见例如，WO 2007/002390 ；US61/168, 885 ；Hua et al. ,American J. of Human Genetics(April 2008)82，1-15 ;Singhet al.，RNA Bio. 6 3,1-10 (2009) 0与本领域已知的此类化合物和方法相比，本文所公开的某些反义化合物和方法具有所需的特性。已有专利描述了被设计用于调节SMN2剪接的嵌合妝核酸分子(W0 02/38738 ；Cartegni and Krainer, Nat. Struct. Biol. , 2003,10,120-125)。发明概述在某些实施方式中，本发明提供了方法，其包括向对象给药包含反义寡核苷酸的反义化合物，该反义化合物互补于人SMN2 mRNA前体的编码核酸的内含子7，其中反义化合物给药至脑脊液(CSF)中。在某些实施方式中，所述给药是至鞘内空隙。在某些实施方式中，所述给药是至脑内的脑脊液。在某些实施方式中，所述给药包含推注注射。在某些实施方式中，所述给药包含利用递送泵输注。在某些实施方式中，所述反义化合物的给药剂量为O. 01至10毫克反义化合物每千克对象体重。在某些实施方式中，剂量为O. 01至10毫克反义化合物每千克对象体重。在某些实施方式中，剂量为O. 01至5毫克反义化合物每千克对象体重。在某些实施方式中，剂量为O. 05至I毫克反义化合物每千克对象体重。在某些实施方式中，剂量为O. 01至O. 5毫克反义化合物每千克对象体重。在某些实施方式中，剂量为O. 05至O. 5毫克反义化合物每千克对象体重。 在某些实施方式中，每日给药所述剂量。在某些实施方式中，每周给药所述剂量。在某些实施方式中，连续给药反义化合物，且所述剂量是每日给药的剂量。在某些实施方式中，该方法包含在诱导期给药至少一个诱导剂量以及在维持期给药至少一个维持剂量。在某些实施方式中，诱导剂量为O. 05至5. O毫克反义化合物每千克对象体重。在某些实施方式中，维持剂量为O. 01至I. O毫克反义化合物每千克对象体重。在某些实施方式中，诱导期的持续时间为至少I周。在某些实施方式中，维持期的持续时间为至少I周。在某些实施方式中，各个诱导剂量和各个维持剂量均包含单次注射。在某些实施方式中，各个诱导剂量和各个维持剂量均独立地包含两次或更多注射。在某些实施方式中，在至少I周的治疗期内，给药反义化合物至少两次。在某些实施方式中，治疗期为至少一个月。在某些实施方式中，治疗期为至少2个月。在某些实施方式中，治疗期为至少4个月。在某些实施方式中，通过一次或更多推注注射给药诱导剂量，以及通过输液泵给药维持剂量。在某些实施方式中，该方法包含评估反义化合物的耐受性和/或有效性。在某些实施方式中，当出现反义化合物给药不耐受的指征时，降低反义化合物的给药剂量或给药频率。在某些实施方式中，当出现反义化合物给药有效的指征后，维持或降低反义化合物的给药剂量或给药频率。在某些实施方式中，当出现反义化合物给药无效的指征后，增加反义化合物的给药剂量。在某些实施方式中，当出现反义化合物给药有效的指征后，降低反义化合物的给药频率。在某些实施方式中，当出现反义化合物给药无效的指征后，增加反义化合物的给药频率。在某些实施方式中，该方法包括将反义化合物与至少一种其他疗法联合给药。在某些实施方式中，反义化合物与至少一种其他疗法同时联合给药。在某些实施方式中，在至少一种其他疗法给药前，给药反义化合物。在某些实施方式中，在至少一种其他疗法给药之后，给药反义化合物。在某些实施方式中，所述至少一种其他疗法包括，给药丙戊酸、利鲁唑、羟基脲和丁酸盐中的一种或更多种。在某些实施方式中，所述至少一种其他疗法包括给药曲古霉素-A。在某些实施方式中，至少一种其他疗法包括给药干细胞。在某些实施方式中，至少一种其他疗法为基因治疗。在某些实施方式中，基因治疗给药至CSF以及反义化合物给药至全身。在某些实施方式中，基因治疗给药至CSF，以及反义化合物给药至全身和CSF0在某些实施方式中，本发明提供了治疗方案，其中初始时给药反义化合物至CSF和全身，随后给药基因治疗至CSF，并将反义化合物给药至全身。在某些此类实施方式中，在初始治疗时对象为婴儿。在某些此类实施方式中，对象为2岁以下。在某些实施方式中，在对象的年龄足以接受基因治疗以前，将反义化合物给药至对象的中枢神经系统。在某些此类实施方式中，反义化合物自始自终全身给药。在某些实施方式中，反义化合物的给药浓度为约O. 01mg/ml、约O. 05mg/ml、约O. lmg/ml、约 O. 5mg/ml、约 lmg/ml、约 5mg/ml、约 10mg/ml、约 50mg/ml 或约 100mg/ml。在某些实施方式中，在对象的运动神经元中，SMN2mRNA对外显子7的包含增力卩。在某些实施方式中，在对象的运动神经元中，SMN2多肽对外显子7氨基酸的包含增加。在某些实施方式中，本发明提供在对象的运动神经元中增加SMN2mRNA对外显子7的包含的方法，包括向对象给药含有反义寡核苷酸的反义化合物，所述反义寡核苷酸互补于人SMN2编码核酸的内含子7，进而在对象的运动神经元中增加SMN2mRNA对外显子7的包含。在某些实施方式中，本发明提供在对象的运动神经元中增加SMN2多肽对外显子7氨基酸的包含的方法，包括向对象给药含有反义寡核苷酸的反义化合物，所述反义寡核苷酸互补于人SMN2编码核酸的内含子7，进而在对象的运动神经元中增加SMN2多肽对外显子、7氨基酸的包含。在某些实施方式中，对象患有SMA。在某些实施方式中，对象患有I型SMA。在某些实施方式中，对象患有II型SMA。在某些实施方式中，对象患有III型SMA。在某些实施方式中，在子宫内进行第一次给药。在某些实施方式中，在血脑屏障完全形成前进行所述第一次给药。在某些实施方式中，在对象出生I周内进行第一次给药。在某些实施方式中，在对象出生I个月内进行第一次给药。在某些实施方式中，在对象出生3个月内进行第一次给药。在某些实施方式中，在对象出生6个月内进行第一次给药。在某些实施方式中，在对象I至2岁时进行第一次给药。在某些实施方式中，在对象I至15岁时进行第一次给药。在某些实施方式中，在对象15岁以上时进行第一次给药。 在某些实施方式中，对象为哺乳动物。在某些实施方式中，对象为人。在某些实施方式中，该方法包括识别患有SMA的对象。在某些实施方式中，通过测定对象一块或更多块肌肉的电活性来识别所述对象。在某些实施方式中，通过遗传检测以确定对象的SMNl基因中是否具有突变来识别所述对象。在某些实施方式中，通过肌肉组织活检来识别所述对象。在某些实施方式中，所述反义化合物的给药使得含有外显子7的SMN2mRNA的量增加至少10%。在某些实施方式中，含有外显子7的SMN2mRNA的量增加至少20%。在某些实施方式中，含有外显子7的SMN2mRNA的量增加至少50%。在某些实施方式中，含有外显子7的SMN2mRNA的量增加至少70%。在某些实施方式中，所述反义化合物的给药使得含有外显子7氨基酸的SMN2多肽的量增加至少10%。在某些实施方式中，含有外显子7氨基酸的SMN2多肽的量增加至少20%。在某些实施方式中，含有外显子7氨基酸的SMN2多肽的量增加至少50%。在某些实施方式中，含有外显子7氨基酸的SMN2多肽的量增加至少70%。在某些实施方式中，所述反义化合物的给药能在所述对象中减轻SMA的至少一种症状。在某些实施方式中，所述反义化合物的给药使得在所述对象中的运动功能改善。在某些实施方式中，所述反义化合物的给药使得在所述对象的运动功能丧失被推迟或减少。在某些实施方式中，所述反义化合物的给药使得呼吸功能改善。在某些实施方式中，所述反义化合物的给药使得生存率改善。在某些实施方式中，反义寡核苷酸的至少一个核苷包含修饰的糖配基。在某些实施方式中，至少一种修饰的糖配基包含2’ -甲氧乙基糖配基。在某些实施方式中，反义寡核苷酸的各核苷基本上均包含修饰的糖配基。在某些实施方式中，包含修饰糖配基的核苷均包含相同的糖修饰。在某些实施方式中，其中各修饰的糖配基均包含2’ -甲氧乙基糖配基。在某些实施方式中，反义寡核苷酸的各核苷均包含修饰的糖配基。在某些实施方式中，核苷均包含相同的糖配基。在某些实施方式中，各修饰的糖配基均包含2’ -甲氧乙基糖配基。在某些实施方式中，至少一个核苷间连接为硫代磷酸酯核苷间连接。在某些实施方式中，各核苷间连接均为硫代磷酸酯核苷间连接。在某些实施方式中，反义寡核苷酸由10至25个连接的核苷组成。在某些实施方式中，反义寡核苷酸由12至22个连接的核苷组成。在某些实施方式中，反义寡核苷酸由15至20个连接的核苷组成。在某些实施方式中，反义寡核苷酸由18个连接的核苷组成。在某些实施方式中，反义寡核苷酸与人SMN2的编码核酸具有至少90 %的互补性。在某些实施方式中，反义寡核苷酸与人SMN2的编码核酸完全互补。在某些实施方式中，寡核苷酸具有核碱基序列，所述核碱基序列包含SEQ ID NO: I的核碱基序列中至少10个连续核碱基。在某些实施方式中，寡核苷酸具有核碱基序列，所述核碱基序列包含SEQ ID ΝΟ1的核碱基序列中至少15个连续核碱基。在某些实施方式中，寡核苷酸具有核碱基序列，所述核碱基序列包含SEQ ID NO: I的核碱基序列。在某些实施方式中，寡核苷酸具有核碱基序列，所述核碱基序列由SEQ ID NO : I的核碱基序列组成。在某些实施方式中，反义化合物包含缀合基团或末端基团。 在某些实施方式中，反义化合物由反义寡核苷酸组成。在某些实施方式中，反义化合物也可以全身给药。在某些实施方式中，全身给药是通过静脉或腹腔注射。在某些实施方式中，全身给药和给药至中枢神经系统同时进行。在某些实施方式中，全身给药和给药至中枢神经系统在不同时间进行。在某些实施方式中，本发明提供了将反义化合物全身给药，可以单独进行，或者与递送至CSF联合进行。在某些实施方式中，将药物组合物全身给药。在某些实施方式中，将药物组合物皮下给药。在某些实施方式中，将药物组合物静脉给药。在某些实施方式中，将药物组合物肌内注射给药。在某些实施方式中，将药物组合物直接给药至CSF(例如，IT和/或ICV注射和/或输注)并且全身给药。在某些实施方式中，本发明提供了方法，包括向对象给药至少一剂量的反义化合物，所述对象具有与SMA相关的至少一种症状，所述反义化合物包含由15至20个连接的核苷组成的寡核苷酸，并且具有核碱基序列，所述核碱基序列的全长与SEQ ID NO. 7的核碱基序列具有100%互补性，且其中各核苷均为2’ -MOE修饰的核苷；且其中至少一剂量在O. lmg/kg至5mg/kg之间且给药至CSF。在某些此类实施方式中，所述剂量在O. 5mg/kg至2mg/kg之间。在某些实施方式中，至少一剂量通过推注注射给药。在某些此类实施方式中，所述剂量通过鞘内推注注射给药。在某些实施方式中，至少再给药一次。在某些此类实施方式中，在第一次给药至少2周后，进行第二次给药。在某些实施方式中，在第一次给药至少4周后，进行第二次给药。在某些实施方式中，在第一次给药至少8周后，进行第二次给药。在某些实施方式中，在第一次给药至少12周后，进行第二次给药。在某些实施方式中，在第一次给药至少16周后，进行第二次给药。在某些实施方式中，在第一次给药至少20周后，进行第二次给药。在某些实施方式中，在第一次给药时，对象在2岁以下。在某些实施方式中，对象在2至15岁之间。在某些实施方式中，对象在15至30岁之间。在某些实施方式中，对象为30岁以上。在某些实施方式中，与SMA相关的至少一种症状减轻，其进展减慢。在某些实施方式中，寡核苷酸为ISIS396443。在某些实施方式中，本发明提供了方法，包括向对象给药至少一剂量的反义化合物，所述对象具有与SMA相关的至少一种症状，所述反义化合物包含由15至20个连接的核 苷组成的寡核苷酸，并且具有核碱基序列，所述核碱基序列的全长与SEQ ID NO. 7的核碱基序列具有100%互补性，且其中各核苷均为2’ -MOE修饰的核苷；且其中至少一剂量为全身给药。在某些此类实施方式中，所述至少一剂量通过推注注射给药。在某些此类实施方式中，所述剂量通过皮下推注注射给药。在某些实施方式中，给药剂量为O. 5mg/kg至50mg/kg之间。在某些实施方式中，给药剂量为lmg/kg至10mg/kg之间。在某些实施方式中,给药剂量为lmg/kg至5mg/kg之间。在某些实施方式中，给药剂量为0. 5mg/kg至lmg/kg之间。在某些实施方式中，至少再给药一次。在某些此类实施方式中，在第一次给药至少2周后，进行第二次给药。在某些实施方式中，在第一次给药至少4周后，进行第二次给药。在某些实施方式中，在第一次给药至少8周后，进行第二次给药。在某些实施方式中，在第一次给药至少12周后，进行第二次给药。在某些实施方式中，在第一次给药至少16周后，进行第二次给药。在某些实施方式中，在第一次给药至少20周后，进行第二次给药。在某些实施方式中，第一次给药时对象在2岁以下。在某些实施方式中，对象在2至15岁之间。在某些实施方式中，对象在15至30岁之间。在某些实施方式中，对象为30岁以上。在某些实施方式中，与SMA相关的至少一种症状减轻，其进展减慢。在某些实施方式中，寡核苷酸为ISIS396443。 在某些实施方式中，本发明提供了方法，包括将至少一剂量的反义化合物向对象给药至CSF以及至少一剂量全身给药，所述对象具有与SMA相关的至少一种症状，所述反义化合物包含由15至20个连接的核苷组成的寡核苷酸，并且具有核碱基序列，所述核碱基序列的全长与SEQ ID NO. 7的核碱基序列具有100%互补性，且其中各核苷均为2’_M0E修饰的核苷。在某些此类实施方式中，CSF给药的剂量为0. lmg/kg至5mg/kg之间。在某些实施方式中，全身给药的剂量为0. 5mg/kg至50mg/kg之间。在某些实施方式中，至少一次CSF给药通过推注注射给药。在某些此类实施方式中，至少一次CSF给药通过鞘内推注注射给药。在某些实施方式中，至少一次全身给药通过推注注射给药。在某些此类实施方式中，至少一次全身给药通过皮下注射给药。在某些实施方式中，CSF给药和全身给药同时进行。在某些实施方式中，CSF给药和全身给药在不同的时间进行。在某些实施方式中，第一次给药时对象在2岁以下。在某些实施方式中，对象在2至15岁之间。在某些实施方式中，对象在15至30岁之间。在某些实施方式中，对象为30岁以上。在某些实施方式中，与SMA相关的至少一种症状减轻，其进展减慢。在某些实施方式中，寡核苷酸为ISIS396443。在某些实施方式中，本发明提供了方法，包括向对象给药至少一全身给药剂量的反义化合物，所述对象具有与SMA相关的至少一种症状，所述反义化合物包含由15至20个连接的核苷组成的寡核苷酸，并且具有核碱基序列，所述核碱基序列的全长与SEQ ID NO. 7的核碱基序列具有100%互补性，且其中各核苷均为2’ -MOE修饰的核苷；以及至少一剂量的基因治疗剂。在某些实施方式中，全身给药剂量为0. 5mg/kg至50mg/kg之间。在某些实施方式中，至少一次全身给药通过推注注射给药。在某些此类实施方式中，至少一次全身给药通过皮下注射给药。在某些实施方式中，全身给药和基因治疗剂给药在同时进行。在某些实施方式中，全身给药和基因治疗剂给药在不同的时间进行。在某些实施方式中，基因治疗剂给药至CSF。在某些此类实施方式中，基因治疗剂通过鞘内注射和/或输注给药。在某些此类实施方式中，基因治疗剂通过脑室内注射和/或输注给药。在某些实施方式中，第一次给药时对象在2岁以下。在某些实施方式中，对象在2至15岁之间。在某些实施方式中，对象在15至30岁之间。在某些实施方式中，对象为30岁以上。在某些实施方式中，与SMA相关的至少一种症状减轻，其进展减慢。在某些实施方式中，寡核苷酸为ISIS396443。在某些实施方式中，本发明提供方法，包括选择具有至少一种与SMA相关的症状的对象，并按照上文所述的任意方法给药反义化合物。在某些此类实施方式中，在给药后评估SMA的至少一种症状。在某些此类实施方式中，SMA的至少一种症状被改善。在某些此类实施方式中，与未给药反义化合物的对象相比，SMA的至少一种症状未出现进展或进展更为缓慢。在某些此类实施方式中，本发明提供包含反义寡核苷酸的反义化合物，所述反义寡核苷酸互补于人SMN2编码核酸的内含子7，所述反义化合物用于上文所述的任意方法。在某些实施方式中，本发明提供一种此类化合物，用于治疗与存活运动神经元I(SMNl)相关的疾病或病症。 在某些实施方式中，本发明提供包含反义寡核苷酸的反义化合物用于在药物生产中的用途，所述反义寡核苷酸互补于人SMN2编码核酸的内含子7，所述药物用于上文所述的任意方法。在某些实施方式中，该药物用于治疗与存活运动神经元I(SMNl)相关的疾病或病症。附图的简要说明图I显示了实施例4所述研究中作用持续时间的结果，其中评估了在7天治疗结束后0、2、4、6和8周时(X-轴)SMN2中外显子7的百分率(y-轴)。第“0”周样品收集自治疗结束后I天。CON表示生理盐水治疗组小鼠。在0至6个月的不同时间点接受生理盐水治疗的对照小鼠之间的百分率不存在差异。图2显示了实施例4所述研究中作用持续时间的结果，其中评估了在7天治疗结束后0、0. 5、1、2、5和6个月时SMN2中外显子7的百分率。第“0”周样品收集自治疗结束后I天。CON表示生理盐水治疗组小鼠。在0至6个月的不同时间点接受生理盐水治疗的对照小鼠之间的百分率不存在差异。图3显示了实施例6所述实验的结果，检测ISIS396443胚胎给药对台湾品系SMA小鼠尾长的影响。图3A为首次实验和图3B为重复实验，对不同浓度的反义化合物进行检测，其中还包括正常小鼠的数据作为对照。图4显示了实施例7所述Western印迹的结果。Y轴为包含外显子7的不同样品的SMN百分率。图5和6显示了实施例7所述实验的结果。向SMA小鼠(台湾品系)给药反义化合物或对照寡核苷酸后对其进行的若干项评估。图7显示了实施例7所述实验的生存曲线。图8显示了如实施例7所述，用反义化合物或对照寡核苷酸处理后，对脊髓不同部分运动神经元数量进行评估的结果。图9显示了如实施例7所述,经反义处理的动物中，对全长SMN RNA(包括外显子7)进行评估的结果。
图10显示了实施例7所述实验的生存曲线，其中动物为(I)未治疗；(2)在出生时(第PO天)给药单剂量反义化合物；或(3)在PO时第一次给药和在第21天(P21)时第
二次给药。图11显示了实施例7所述实验的生存曲线，对接受第二次给药的动物与仅接受第一次给药的动物进行比较。图12显示了实施例9所述实验的结果，对猴鞘内输注给药反义化合物，并评估96小时后不同组织中化合物的浓度。图13显示了实施例12所述实验的生存曲线，向患有严重SMA的小鼠皮下注射给药不同剂量的反义化合物。发明详述应当理解，前述一般性说明和下文的详细说明仅为示例和解释性的，并非限制本发明所要求的权利。除非另外特别指明，本发明中单数的使用包括复数。如本发明中使用的，除非另有指明，使用的“或”是指“和/或”。另外，术语“包括”以及诸如“包含”和“含有”的使用为非限制性的。另外，除非另外特别指明，诸如“元件”或“组分”等术语涵盖包括一个单元的元件和组分以及包括超过一个亚单元的元件和组分。本发明使用的章节标题仅为了组织性目的，不应解释为限制所描述的主题。本申请中引用的所有文件或部分文件，包括但不限于专利、专利申请、论文、书籍以及专题论文 等，在此明确地通过参考全文并入，用于任何目的。I.定义除非提供特殊定义，本发明所使用的术语与分析化学、合成有机化学以及医用化学和药物化学相关的术语及程序和技术均为本领域熟知和通用。标准的技术可用于化学合成和化学分析。某些此类的技术和程序可以在下列文献中找到，例如“CarbohydrateModifications in Antisense ResearchEdited by Sangvi and Cook,American ChemicalSociety, Washington D. C. , 1994 ;“Remington ' s Pharmaceutical Sciences”，MackPublishing Co. , Easton, Pa. ,18th edition,1990 ；和“Antisense Drug Technology,Principles, Strategies, and Applications，，Edited by Stanley T. Crooke, CRC Press,Boca Raton, Florida ；以及 Sambrook et al. , “Molecular Cloning, A laboratoryManual,” 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989,其出于任何目的通过引用全文并入。在允许的情况下，本文通篇公开内容中所引用的所有专利、申请、公开的申请和其他出版物以及其他数据均通过引用全文并入本文。除非另有说明，下列术语具有以下含义“核苷”指包含杂环碱基配基和糖配基的化合物。核苷包括，但不限于，天然存在的核苷、修饰核苷，以及具有模拟碱基和/或糖基的核苷。核苷可以被任意种类的取代基所修饰。“糖配基”指天然或修饰的糖或糖替代物。“天然的糖”指DNA (2’ -H)或RNA (2’ -0H)的呋喃核糖配基。“修饰的糖”指呋喃核糖配基，其包含天然糖取代基以外的至少一个取代基。“糖替代物”指除呋喃核糖以外、能够替代核苷中的糖的结构。糖替代物的例子包括，但不限于，开环系统、6元环、氧被取代的糖，例如氧被硫或氮取代。例如，糖替代物包括，但不限于吗啉基取代和含4’ -硫的糖。“核碱基”指核苷的杂环碱基部分。核碱基可以是天然存在的也可以是被修饰的。在某些实施方式中，核碱基可以包含能够与另一个核酸的核碱基形成氢键的任意原子或基团。“核苷酸”指包含磷酸酯连接基团的核苷。在本申请中，核苷包括核苷酸。“修饰的核苷”指一种核苷，与天然存在的RNA或DNA核苷相比，其含有至少一种修饰。此类修饰可以位于糖配基中和/或位于核碱基中。“双环核苷”或“BNA”指一种核苷，其中所述核苷的糖配基包含一种桥，连接糖环中的两个碳原子，以形成双环糖配基。“4’ -2’双环核苷”指包含呋喃环的双环核苷，所述呋喃环含有一种桥，连接呋喃环上的两个碳原子，将糖环的2’位碳原子和4’位碳原子连接。“2’ -修饰”或“2’ -取代”指包含糖的核苷，所述糖在2’位含有除H或OH以外的
取代基。“2’ -OMe”或“2’ _0CH3”或“2’ _0_甲基”均指包含糖的核苷，所述糖在糖环的2’位具有-OCH3基团。“MOE ”或“ 2 ’ -MOE ”或“ 2 ’ -OCH2CH2OCH3 ”或“ 2 ’ _0_甲氧乙基”均指包含糖的核
苷，所述糖在糖环的2’位具有-OCH2CH2OCH3基团。“寡核苷酸”指包含多个连接的核苷的化合物。在某些实施方式中，多个核苷中的一个或更多个被修饰。在某些实施方式中，寡核苷酸包含一个或更多个核糖核苷酸(RNA)和/或脱氧核糖核苷酸(DNA)。“寡核苷”指核苷间连接均不含磷原子的寡核苷酸。在本申请中，寡核苷酸包括寡核苷。“修饰的寡核苷酸”指一种寡核苷酸，其包含至少一个修饰的核苷和/或至少一个修饰的核苷间连接。“核苷间连接”指寡核苷酸的相邻核苷之间的共价连接。“天然存在的核苷间连接”指3'至5'的磷酸二酯键。“修饰的核苷间连接”指除天然存在的核苷间连接以外的任意核苷间连接。“寡聚化合物”指包含寡核苷酸的化合物。在某些实施方式中，寡聚化合物由寡核苷酸组成。在某些实施方式中，寡聚化合物进一步包含一个或多个缀合和/或末端基团。“反义化合物”指一种寡聚化合物，其至少有一部分是至少部分互补于其所杂交的靶核酸，其中此类杂交产生至少一种反义活性。“反义寡核苷酸”指一种反义化合物，其中所述寡聚化合物由寡核苷酸组成。“反义活性”指因反义化合物与其靶核酸杂交所获得的任何可检测和/或可测定的效应。在某些实施方式中，这样的反义活性是核酸或蛋白的量增加或减少。在某些实施方式中，这样的反义活性是核酸或蛋白的剪接变体比率的改变。在某些实施方式中，这样的反义活性是细胞和/或对象的表型改变。反义活性的“检测”或“测定”可以是直接的或间接的。例如，在某些实施方式中，通过检测和/或测定靶核酸或蛋白的量，或靶核酸或蛋白的剪接变体的相对量对反义活性进行评估。在某些实施方式中，通过观察细胞或动物的表型改变情况对反义活性进行检测。术语“检测”和“测定”与任何活性、应答或效应相关时，是指为检测或测定进行了实验。此类检测和/或测定可以包括零值。因此，即使为检测或测定而进行的试验得到的结果为无活性(零活性)，然而检测或测定活性的步骤已经进行。“靶核酸”指任意核酸分子，其表达、量或活性能够被反义化合物所调节。“靶mRNA”指预先选定的编码某蛋白的RNA分子。“靶mRNA前体”指预先选定的未被完全加工、成mRNA的RNA转录物。值得注意的是，mRNA前体包括一个或多个内含子。“靶蛋白”指由靶核酸编码的蛋白。
“调节”指对功能或活性的干扰。在某些实施方式中，调节指增加基因表达。在某些实施方式中，调节指降低基因表达。“表达”指任意功能和步骤，通过这样的功能和步骤将基因编码的信息转化成细胞内存在或操控的结构。 “核碱基序列”指连续核碱基从5’至3’方向的顺序，其与任意糖、连接和/或核碱基修饰无关。“连续核碱基”指在核酸中彼此直接相邻的核碱基。“核碱基的互补性”指两个核碱基通过氢键形成非共价配对的能力。“互补的”是指第一核酸在严格的杂交条件下能够与第二核酸杂交。例如，如果在严格的杂交条件下，反义化合物能够与靶核酸杂交，则反义化合物与其靶核酸是互补的。“完全互补的”是指第一核酸的各个核碱基均能够与第二核酸中各个相应连续位点的核碱基配对。反义化合物的“互补性百分率”是指，反义化合物中与靶核酸的等长部分互补的核碱基的百分率。互补性百分率的计算方法为，将反义寡核苷酸中与靶核酸相应连续位点的核碱基互补的核碱基的数目除以反义化合物的总长。“同一性百分率”是指第一核酸中与第二核酸相应位点具有相同核碱基的核碱基数目除以第一核酸中的核碱基总数。“杂交”指通过核碱基互补性进行的互补核酸的退火。“错配”指第一核酸的核碱基无法与第二核酸相应位点的核碱基进行配对。“同一的核碱基序列”指具有相同的核碱基序列，其与核苷的任何化学修饰无关。
“不同修饰”或“不同的修饰”指核苷或核苷间连接之间具有不同的核苷修饰或核苷间连接，包括无修饰。因此，例如，MOE核苷和未修饰的DNA核苷之间为“不同的修饰”，虽然DNA核苷是未修饰的。同样的，DNA与RNA之间为“不同的修饰”，即使它们均为天然存在的未修饰核苷。除包含不同的核碱基以外其他都相同的核苷不属于不同的修饰，除非另有说明。例如，包含2’ -OMe修饰糖和腺嘌呤核碱基的核苷与包含2’ -OMe修饰糖和胸腺嘧啶碱基的核苷之间不属于不同的修饰。“相同修饰”指相互之间相同的核苷和核苷间连接(包括未修饰的核苷和核苷间连接)。因此，例如，两个未修饰的DNA核苷具有“相同修饰”，即使DNA核苷是未修饰的。“修饰类型”或核苷的“类型”是指核苷的修饰，包括修饰的和未修饰的核苷。相应地，除另有说明外，“具有第一修饰类型的核苷”可以是未修饰核苷。寡核苷酸的“分离区域”是指寡核苷酸的一部分，其中该区域内的核苷和核苷间连接均包含相同的修饰；并且与其相邻的任意部分的核苷和/或核苷间连接包含至少一种不同的修饰。“基序”指寡核苷酸中修饰和/或未修饰核碱基、糖和/或核苷间连接的样式。“完全修饰的寡核苷酸”指各核碱基、各糖、和/或各核苷间连接均被修饰。“均一修饰的寡核苷酸”指在修饰的寡核苷酸中各核碱基、各糖、和/或各核苷间连接均具有相同修饰。“交替的基序”指寡核苷酸或其一部分，具有至少四个修饰核苷的分离区域，其样式为(AB)nAm，其中A表示具有第一种修饰类型的核苷区域出表示具有不同修饰类型的核苷区域；11为2-15 ;且111为O或I。因此，在某些实施方式中，交替的基序包括4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20或更多的交替区域。在某些实施方式中，各A区域和各B区域均独立地包含1-4个核苷。“对象”指入选进行处理或治疗的人或非人动物。“需求对象”指经鉴定需要治疗或处理的对象。在某些此类实施方式中，对象具有一种或多种指征，表明患有SMA或正处于SMA发展过程中。“给药”指向对象提供药物或组合物，包括，但不限于，由专业医师给药和自我给药。“肠道外给药”指通过注射或输注给药。肠道外给药包括，但不限于，皮下给药、静脉给药或肌内给药。
“全身给药”指对除目标活性部位以外的区域给药。全身给药的例子为皮下给药和静脉给药，以及腹腔给药。“皮下给药”指在皮肤之下给药。“静脉给药”指给药至静脉。“脑脊液”或“CSF”指充满脑和脊髓内空间的液体。“给药至脑脊液”指将物质直接递送至CSF的任意给药方法。“脑室内”或“ICV”指给药至大脑的脑室系统(ventricular)。“鞘内”或“IT”指给药至蛛网膜下腔的CSF，蛛网膜覆盖于脑和脊髓之上。通过脊髓的鞘进入蛛网膜下腔进行IT注射，将药物试剂注射入脊髓周围的鞘。“诱导期”指一段给药期，在此期间开始给药，并且活性药物在靶组织中达到稳态浓度。例如，诱导期是指反义寡核苷酸在肝脏中达到稳态浓度前的给药期。“维持期”指药物在靶组织中达到稳态浓度以后的给药期。“持续时间”指活性或事件持续的时间。例如，诱导期的持续时间是指采用诱导剂量给药的时间。“维持剂量”是指在维持期内进行单次给药的剂量。在本申请中，“诱导剂量”指在诱导期内进行单次给药的剂量。“联合给药”指向对象给药两种或更多种药物。两种或更多种药物可以在一个药物组合物中，或可以在不同的药物组合物中。所述两种或多种药物的每一种可以通过相同或不同的途径给药。联合给药包括平行或顺序给药。“处理”指疾病的治疗方法。在某些实施方式中，处理包括，但不限于手术处理、化学处理、和物理干预，如辅助呼吸、插导管、以及出于增强体质目的的物理处理。“治疗”指使用一种或多种特定的程序，用于治愈或改善疾病。在某些实施方式中，特定的程序为给药一种或多种药物。“改善”指减轻疾病或状态的至少一种指征的严重性。在某些实施方式中，改善包括延迟或减缓疾病或状态的一种或更多种指征的进程。指征的严重性可以通过本领域技术人员公认的主观或客观检测方法确定。“阻止发病”指阻止处于疾病或状态的发生风险中的对象发展出疾病或状态。在某些实施方式中，处于疾病或状态风险中的对象接受的治疗与已经患有疾病或状态的对象接受的治疗类似。
“延迟发病”指延迟处于疾病或状态的发生风险中的对象发展出疾病或状态。“减慢进展”指与疾病或状态相关的至少一种症状的严重性的恶化速度减慢。“外显子7氨基酸”指与SMN RNA的外显子7对应的SMN蛋白部分。在剪接过程中外显子7未被排除时，SMN RNA表达的SMN蛋白中存在有外显子7氨基酸。“SMN蛋白”指正常全长的运动神经元 存活蛋白。SMN可以由SMNl基因或SMN2基因表达，前提是成熟mRNA中存在外显子7，且SMN蛋白中存在外显子7氨基酸。“剂量”指在单次给药中或在一段特定时间内提供的药物的特定量。在某些实施方式中，可以通过两次或更多推注注射、片剂或注射给药剂量。例如，在某些实施方式中，在希望皮下或鞘内或ICV给药时，希望的剂量所需要的体积难以通过单次注射来调节。在此类实施方式中，可以使用两次或更多注射以达到希望的剂量。在连续输注装置中，可以将剂量表示为在单位时间内递送的药物的量。“剂量单位”指提供药物的形式。在某些实施方式中，剂量单位为含有冻干寡核苷酸的小管。在某些实施方式中，剂量单位指含有复溶寡核苷酸的小管。“治疗有效量”指向动物提供治疗效果的药物的量。“药物组合物”指适合给药于个体的包含药物的物质混合物。例如，药物组合物可以包含修饰寡核苷酸和无菌水溶液。“可接受的安全性”指副作用的样式在临床可以接受的限度内。“副作用”指治疗导致的除所需效应以外的生理应答。I.某些修饰的寡核苷酸在某些实施方式中，本发明提供了包括包含反义寡核苷酸的方法和组合物，与由天然存在的寡聚体形成的寡核苷酸相比，如DNA或RNA，所述反义寡核苷酸具有一种或多种修饰。此类修饰的反义寡核苷酸可以具有一种或多种优选的性质。某些此类修饰改变反义寡核苷酸的反义活性，例如增加反义寡核苷酸与其靶核酸的亲和性、增强其对一种或多种核酸酶的抗性、和/或改变寡核苷酸的药代动力学或组织分布性质。在某些实施方式中，此类修饰的反义寡核苷酸包含一种或多种修饰的核苷和/或一种或多种修饰的核苷连接和/或一种或多种缀合基团。 a.某#修饰的核苷在某些实施方式中，反义寡核苷酸包含一种或多种修饰的核苷。此类修饰的核苷可以包括修饰的糖和/或修饰的核碱基。在某些实施方式中，在寡核苷酸中掺入此类修饰核苷可以使得修饰的寡核苷酸对靶核酸具有更高的亲和性和/或更强的稳定性，包括但不限于，对核酸酶降解具有更高的抗性、和/或具有改进的毒性和/或摄取特性。i.某@核碱基核苷中天然存在的碱基部分为杂环碱基，一般为嘌呤和嘧啶。除“未修饰”的或“天然”的核碱基如嘌呤核碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶核碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶⑶以外，在本发明所述的化合物中还可以掺入本领域技术人员公知的多种修饰的核碱基或核碱基模拟物。在某些实施方式中，修饰的核碱基为结构与母体核碱基非常类似的核碱基，例如7-脱氮杂嘌呤、5-甲基胞嘧啶、或G-夹钳。在某些实施方式中，核碱基模拟物包括更加复杂的结构，例如三环吩噁嗪核碱基模拟物。上文所述的修饰核碱基的制备方法为本领域技术人员所熟知。
ii.某些修饰的糖和糖替代物本发明的反义寡核苷酸可以任选地含有一种或更多种核苷，其与天然糖相比，其中的糖配基被修饰。包含此类糖修饰核苷的寡核苷酸可以具有增强的核酸酶稳定性、具有增强的结合亲和性或某些其他有益的生物学性质。此类修饰包括但不限于，添加其他取代基团、将非成对环原子桥接以形成双环核酸(BNA)、将核糖环中的氧原子用S、N(R)或C(R1)(R) 2(R = H、C1-C12烷基或保护基团)以及这些组合取代，例如2' -F-5/ -甲基取代核苷(其他公开的5'，2'-双取代核苷参见公开于8/21/08的PCT国际申请WO 2008/101157)，或者将核糖环中的氧原子用S取代并进一步在2'-位进行取代(参见公开的美国专利申请US2005-0130923，
公开日2005年6月16日)，或者在BNA的Y -取代(参见PCT国际申请W02007/134181，
公开日11/22/07，其中LNA被例如5'-甲基或5'-乙烯基基团取代)。具有修饰糖配基的核苷的例子包括但不限于包含5'-乙烯基、5'-甲基(R或S)、4' -S、2' -F、2' _0013和2' -O(CH2)20CH3取代基团的核苷。2’位的取代基还可以选自烯丙基、氨基、叠氮基、硫代、0-烯丙基、0-C「C1Q烷基、0CF3、0 (CH2) 2SCH3、0 (CH2) 2_0_N(Rm)(Rn)、和O-CH2-C ( = 0)-N(Rm) (Rn)，其中各Rn^P Rn独立地为H或取代或非取代的C1-Cltl烷基。双环核酸(BNA)的例子包括但不限于在4'和2'核糖环原子之间具有桥接的核苷。在某些实施方式中，本发明所述的反义化合物包括一种或多种BNA核苷，其中桥接包括下式之一 4 ' -D-(CH2)-0-2 ' ( ^ -D-LNA) ；4 ' - (CH2)-S-2 '；4，_ ct _L_ (CH2) _0_2，( a -L-LNA) ;4，_ (CH2) 2_0_2，(ENA) ;4，_C (CH3) 2_0_2，(参见PCT/US2008/068922) ;4，-CH(CH3)-0-2，和 4，-C-H(CH2OCH3)-0-2，(参见美国专利7，399，845，2008 年 7 月 15 日授权)；4’ -CH2-N (OCH3)-2’ (参见 PCT/US2008/064591)；4’-CH2-O-N(CH3)-2’ (参见公开的美国专利申请US2004-0171570，2004年9月2日公开)；4’-CH2-N (R)-0-2’ (参见美国专利 7，427，672，2008 年 9 月 23 日授权);4，-CH2-C (CH3)-2，和 4，-CH2-C ( = CH2)-2，(参见 PCT/US2008/066154);以及其中 R 独立地为 HX1-C12 烷基、或保护基团。在某些实施方式中，本发明提供了包含修饰糖配基的修饰核苷，其中所述修饰糖配基不是双环糖配基。某些此类修饰的核苷是已知的。在某些实施方式中，核苷的糖环可以在任意位置被修饰。可以在本发明中使用的糖修饰的例子包括，但不限于，含有选自下述糖取代基团的化合物0H、F、0-烷基、S-烷基、N-烷基或0-烷基-0-烷基，其中的烷基、烯基和炔基可以是取代或非取代的C1至Cltl烷基或C2至Cltl烯基和炔基。在某些此类实施方式中，此类取代基在糖的2’位。在某些实施方式中，修饰核苷在糖的2’位具有取代基。在某些实施方式中，这样的取代基选自卤素(包括，但不限于F)、烯丙基、氨基、叠氮基、硫代、0-烯丙基、O-C1-Cltl烷基、-0CF3、O-(CH2)2-0-CH3、2' -O(CH2)2SCH3、0-(CH2)2-O-N(R111) (Rn)、或0_CH2_C( = 0)-N(Rm)(Rn)，其中各Rm和Rn独立地为H或取代或非取代的C1-Cltl烷基。在某些实施方式中，适用于本发明的修饰核苷为2-甲氧乙氧基、2’ -0-甲基(2，-O-CH3)、2’ -氟代(2，-F)。 在某些实施方式中，修饰核苷在2'-位具有的取代基选自0[ (CH2) n0]mCH3、O(CH2) nNH2、O (CH2) nCH3、O (CH2) nONH2、OCH2C ( = 0) N (H) CH3、和 0 (CH2) n0N [ (CH2) nCH3] 2，其中 n 和m为I至约10。其他2'-糖取代基团包括=C1至Cltl烷基、取代烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、0-烷芳基或 0-芳烷基、SH、SCH3> 0CN、Cl、Br、CN、CF3> OCF3> SOCH3> S02CH3> ONO2, NO2,N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨烷基氨基、聚烷氨基、取代甲硅烷基、RNA剪切基团、报告基团、插入剂、用于改善药代动力学性质的基团或用于改善寡聚化合物药效学性质的基团、以及具有类似性质的其他取代基。在某些实施方式中，修饰核苷包含2，-MOE侧链(Baker et al.，J. Biol. Chem.，1997，272，11944-12000 )。已有报道，此类2' -MOE取代比未修饰的核苷和其他修饰核苷，如2’ -0-甲基、0-丙基、和0-氨基丙基具有更好的结合亲和性。具有2' -MOE取代的寡核苷酸还可以作为基因表达的反义抑制剂，其特性有望在体内使用(Martin，P.，Helv. Chim. Acta,1995,78,486-504 ；Altmann et al. , Chimia，1996，50，168-176 ;Altmannet al. , Biochem. Soc. Trans. ,1996,24,630-637 ；以及 Altmann et al. , NucleosidesNucleotides,1997，16,917-926)。在某些实施方式中，2'-糖取代基团可以位于阿拉伯糖(上)位或核糖(下)位。在某些此类实施方式中，2'-阿拉伯糖修饰为2' -F阿拉伯糖(FANA)。类似的修饰还可以位于糖的其他位置，特别是在3'末端核苷或2' -5'连接的寡核苷酸的糖的3'位，以及在5'末端核苷酸的5'位。在某些实施方式中，适用于本发明的核苷具有糖替代物如环丁基，以替代呋喃核糖基糖。教导制备此类修饰糖结构的美国专利的例子包括，但不限于，美国专利4，981,957 ；5，118，800 ;5，319，080 ;5，359，044 ;5，393，878 ;5，446，137 ;5，466，786 ;5，514，785 ；5，519，134 ;5，567，811 ;5，576，427 ;5，591，722 ;5，597，909 ;5，610，300 ;5，627，053 ；5，639，873 ;5，646，265 ;5，658，873 ;5，670，633 ;5，792，747 ;和 5，700，920，每一篇都通过引用全文参考并入。在某些实施方式中，本发明提供在糖的2’ -位具有修饰的核苷。在某些实施方式中，本发明提供在糖的5’ -位具有修饰的核苷。在某些实施方式中，本发明提供了在糖的2’ -位和5’ -位都具有修饰的核苷。在某些实施方式中，修饰的核苷可以用于掺入寡核苷酸。在某些实施方式中，修饰的核苷掺入到位于寡核苷酸5’ -末端的寡核苷。b.某些核苷间连接本发明的反义寡核苷酸可以任选地含有一种或更多种修饰的核苷间连接。根据存在或不存在磷原子，将连接基团定义为两个主要的分类。具有代表性的含磷连接包括，但不限于，磷酸二酯(P = 0)、磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、和硫代磷酸酯(P = S)。具有代表性的不含磷的连接基团包括，但不限于，亚甲基甲基亚胺基(-CH2-N (CH3) -0-CH2-)、硫代二酯(_0_C(0)-S-)、硫擬氨基甲酸酯(-O-C(O) (NH)-S-);娃氧烧(-O-Si (H) 2_0_);以及N,N/ - 二甲肼(-CH2-N(CH3)-N(CH3)-)。将具有非磷连接基团的寡核苷酸称为寡核苷。与天然磷酸二酯键相比，修饰的连接可以改变，通常为增加，寡核苷酸对核酸酶的抗性。在某些实施方式中，具有手性原子的连接可以被制备为外消旋混合物，或制备为单独的对映异构体。具有代表性的手性连接包括，但不限于，烷基膦酸酯和硫代磷酸酯。含磷和非含磷连接的制备方法为本领域技术人员所熟知。本文所述的反义寡核苷酸含有一个或更多个不对称的中心，因此产生了对映异构体、非对映异构体和依据绝对立体化学可以被定义为(R)或(S)的其他立体异构构型，如糖端基异构体，或可以被定义为(D)或(L)的其他立体异构构型，如氨基酸等。本文的反义化合物中可包括所有此类可能的异构体，及其外消旋体以及光学纯形式。在某些实施方式中，反义寡核苷酸具有至少一个修饰的核苷间连接。在某些实施方式中，反义寡核苷酸具有至少两个修饰的核苷间连接。在某些实施方式中，反义寡核苷酸具有至少3个修饰的核苷间连接。在某些实施方式中，反义寡核苷酸具有至少10个修饰的核苷间连接。在某些实施方式中，反义寡核苷酸的各核苷间连接均为修饰的核苷间连接。在某些实施方式中，此类修饰的核苷间连接为硫代磷酸酯连接。c.长度在某些实施方式中，本发明提供的反义寡核苷酸具有任意多种范围的长度。在某些实施方式中，本发明提供的反义化合物或反义寡核苷酸包含X-Y连接的核苷或者由X-Y连接的核苷组成，其中X和Y均独立地选自8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、和50 ;其中X < Y。例如，在某些实施方式中，本发明提供的反义化合物或反义寡核苷酸包含下述核苷或由下述核苷组成8-9、8-10、8-11、8-12、8-13、8-14、8-15、8-16、
8-17、8-18、8-19、8-20、8-21、8-22、8-23、8-24、8-25、8-26、8-27、8-28、8-29、8-30、9-10、
9-11、9-12、9-13、9-14、9-15、9-16、9-17、9-18、9-19、9-20、9-21、9-22、9-23、9-24、9-25、
9-26、9-27、9-28、9-29、9-30、10-11、10-12、10-13、10-14、10-15、10-16、10-17、10-18、
10-19、10-20、10-21、10-22、10-23、10-24、10-25、10-26、10-27、10-28、10-29、10-30、
I卜12、I 卜13、I 卜14、I 卜15、I 卜16、I 卜17、I 卜18、I 卜19、I 卜20、I 卜21、I 卜22、I 卜23、I卜24、I卜25、I卜26、I卜27、I卜28、I卜29、I卜30、12-13、12-14、12-15、12-16、12-17、12-18、12-19、12-20、12-21、12-22、12-23、12-24、12-25、12-26、12-27、12-28、12-29、
12-30、13-14、13-15、13-16、13-17、13-18、13-19、13-20、13-21、13-22、13-23、13-24、
13-25、13-26、13-27、13-28、13-29、13-30、14-15、14-16、14-17、14-18、14-19、14-20、
14-21、14-22、14-23、14-24、14-25、14-26、14-27、14-28、14-29、14-30、15-16、15-17、
15-18、15-19、15-20、15-21、15-22、15-23、15-24、15-25、15-26、15-27、15-28、15-29、
15-30、16-17、16-18、16-19、16-20、16-21、16-22、16-23、16-24、16-25、16-26、16-27、
16-28、16-29、16-30、17-18、17-19、17-20、17-21、17-22、17-23、17-24、17-25、17-26、
17-27、17-28、17-29、17-30、18-19、18-20、18-21、18-22、18-23、18-24、18-25、18-26、
18-27、18-28、18-29、18-30、19-20、19-21、19-22、19-23、19-24、19-25、19-26、19-29、 19-28、19-29、19-30、20-21、20-22、20-23、20-24、20-25、20-26、20-27、20-28、20-29、
20-30、2卜22、2卜23、2卜24、2卜25、2卜26、2卜27、2卜28、2卜29、2卜30、22-23、22-24、
22-25、22-26、22-27、22-28、22-29、22-30、23-24、23-25、23-26、23-27、23-28、23-29、
23-30,24-25,24-26,24-27,24-28,24-29,24-30,25-26,25-27,25-28,25-29,25-30,26-27、26-28、26-29、26-30、27-28、27-29、27-30、28-29、28-30、或 29-30 个连接的核苷。在某些实施方式中,本发明的反义化合物或反义寡核苷酸的长度为15个核苷。在某些实施方式中，本发明的反义化合物或反义寡核苷酸的长度为16个核苷。在某些实施方式中，本发明的反义化合物或反义寡核苷酸的长度为17个核苷。在某些实施方式中，本发 明的反义化合物或反义寡核苷酸的长度为18个核苷。在某些实施方式中，本发明的反义化合物或反义寡核苷酸的长度为19个核苷。在某些实施方式中，本发明的反义化合物或反义寡核苷酸的长度为20个核苷。d.某些寡核苷酸基序在某些实施方式中，反义寡核苷酸具有的化学修饰的亚基沿着其长度以特定方向排列。在某些实施方式中，本发明的反义寡核苷酸是完全修饰的。在某些实施方式中，本发明的反义化合物是均一修饰的。在某些实施方式中，本发明的反义化合物是均一修饰的且各核苷包含2’-MOE糖配基。在某些实施方式中,本发明的反义寡核苷酸是均一修饰的且各、核苷包含2’-OMe糖配基。在某些实施方式中,本发明的反义寡核苷酸是均一修饰的且各核苷包含吗啉取代糖配基。在某些实施方式中，本发明的寡核苷酸包含交替的基序。在某些此类实施方式中，交替的修饰类型选自2’ -M0E、2’ -F、双环糖修饰核苷、和DNA(未修饰的2’ -脱氧)。在某些此类实施方式中，各交替的区域包含单一核苷。在某些实施方式中，本发明的寡核苷酸包含一个或更多个第一类型核苷区和一个或更多个第二类型核苷区。在某些实施方式中，在交替的基序中，一个或多个交替的区域包括某类型的多于一个的核苷。例如，本发明的寡聚化合物可以包含下述核苷基序中任一种的一个或更多个区域Nu1 Nu1 Nu2 Nu2 Nu1 Nu1 ；Nu1 Nu2 Nu2 Nu1 Nu2 Nu2 ；Nu1 Nu1 Nu2 Nu1 Nu1 Nu2 ；Nu1 Nu2 Nu2 Nu1 Nu2 Nu1 Nu1 Nu2 Nu2 ；Nu1 Nu2 Nu1 Nu2 Nu1 Nu1 ；Nu1 Nu1 Nu2 学习 Nu1 Nu2 Nu1 Nu2 ；Nu1 Nu2 Nu1 Nu2 Nu1 Nu1 ；Nu1 Nu2 Nu2 Nu1 Nu1 Nu2 Nu2 Nu1 Nu2 Nu1 Nu2 Nu1 Nu1 ；Nu2 Nu1 Nu2 Nu2 Nu1 Nu1 Nu2 Nu2 Nu1 Nu2 Nu1 Nu2 Nu1 Nu1 ;或Nu1 Nu2 Nu1 Nu2 Nu2 Nu1 Nu1 Nu2 Nu2 Nu1 Nu2 Nu1 Nu2 Nu1 Nu1 ；其中Nu1为第一类型的核苷且Nu2为第二类型的核苷。在某些实施方式中，Nu1和Nu2中的一个为2’ -MOE核苷且Nu1和Nu2中的另一个选自2’ -OMe修饰的核苷、BNA和未修饰的DNA或RNA核苷。2.寡聚化合物在某些实施方式中，本发明提供寡聚化合物。在某些实施方式中，寡聚化合物仅包含寡核苷酸。在某些实施方式中，寡聚化合物包含寡核苷酸和一种或更多种缀合和/或末端基团。在上文所讨论的具有任意化学基序的寡核苷酸中可以插入此类缀合和/或末端基团。因此，例如，包含具有交替核苷区域的寡核苷酸的寡聚化合物可以包含末端基团。a.某@缀合基团在某些实施方式中，通过连接一个或更多个缀合基团对本发明的寡核苷酸进行修饰。一般而言，缀合基团可修饰与之连接的寡聚化合物的一种或多种性质，包括但不限于，药效学、药代动力学、稳定性、结合、吸收、细胞分布、细胞摄取、电荷和清除率。缀合基团在化学领域被常规使用，且与母体化合物直接连接，或通过任选的缀合连接配基或缀合连接基团相连接，母体化合物例如寡聚化合物，如寡核苷酸。缀合基团包括但不限于，插入齐U、报告分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、硫醚、聚醚、胆固醇、硫代胆固醇、胆酸配基、叶酸酯、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、菲啶、蒽醌、金刚烷胺、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素和染料。某些缀合基团此前已被描述，例如胆固醇配基(Letsinger et al.，Proc. Natl. Acad. Sci.USA,1989,86,6553-6556)、胆酸(Manoharan et al. , Bioorg. Med. Chem. Let. ,1994,4,1053-1060)、硫醚，例如，己基-S-三硫醇(Manoharan et al.，Ann. N. Y. Acad. Sci.，1992,660,306-309 ；Manoharan et al. , Bioorg. Med. Chem. Let. , 1993, 3, 2765-2770)、硫代胆固醇(Oberhauser et al. , Nucl. Acids Res. , 1992, 20, 533-538)、脂肪链，例如，十二烧基二醇或十一烧基残基(Saison-Behmoaras et al. ,EMBO J. , 1991,10,1111-1118 ；Kabanov etal. ,FEBS Lett. ,1990,259,327-330 ；Svinarchuk et al. , Biochimie,1993, 75,49-54)、憐月旨，例如，双十六烷基-rac-甘油或三乙基-铵1，2-双-0-十六烷基-rac-甘油-3-H-膦酸酯(Manoharan et al. , Tetrahedron Lett. , 1995, 36, 3651-3654 ；Shea et al. , Nucl.Acids Res. , 1990,18, 3777-3783)、聚胺或聚乙二醇链(Manoharan et al. ,Nucleosides &Nucleotides, 1995,14,969-973)、金刚烧胺乙酸(Manoharan et al. ,Tetrahedron Lett.,1995，36，3651-3654)、棕榈酰配基(Mishra et al. , Biochim. Biophys. Acta, 1995,1264,229-237)、或十八胺或己基氨基-羰基-轻胆固醇配基(Crooke et al. , J. Pharmacol. Exp.Ther.，1996，277，923-937)。在某些实施方式中，缀合基团包含活性药物，例如，阿司匹林、华法林、保泰松、布洛芬、舒洛芬、芬布芬、酮洛芬、(S)-⑴-吡喃洛芬、卡洛芬、丹肌氨酸、2，3，5_三碘苯甲酸、氟芬那酸、亚叶酸、苯并噻二嗪、氯噻嗪、二氮杂卓、吲哚美辛、巴比妥酸盐、头孢菌素、磺胺类药物、抗糖尿病药、抗菌剂或抗生素。寡核苷酸-药物缀合物及其制备方法参见美国专利申请 09/334，130。教导寡核苷酸缀合物制备方法的具有代表性的美国专利包括，但不限于，美国专利4，828，979 ;4，948，882 ;5，218，105 ;5，525，465 ;5，541，313 ;5，545，730 ;5，552，538 ；5，578，717,5, 580, 731 ;5，580, 731 ;5，591，584 ;5，109, 124 ;5，118，802 ;5，138，045 ；5，414，077 ;5，486，603 ;5，512，439 ;5，578，718 ;5，608，046 ;4，587，044 ;4，605，735 ；4，667，025 ;4，762，779 ;4，789，737 ;4，824，941 ;4，835，263 ;4，876，335 ;4，904，582 ；4，958，013 ;5，082，830 ;5，112，963 ； 5, 214，136 ;5，082，830 ;5，112，963 ;5，214，136 ；5，245，022 ;5，254，469 ;5，258，506 ;5，262，536 ;5，272，250 ;5，292，873 ;5，317，098 ；5，371，241，5，391，723 ;5，416，203，5，451，463 ;5，510，475 ;5，512，667 ;5，514，785 ；5，565，552 ;5，567，810 ;5，574，142 ;5，585，481 ;5，587，371 ;5，595，726 ;5，597，696 ；5，599，923 ;5，599，928 和 5，688，941。缀合基团可以连接于寡核苷酸的任一个或两个末端(末端缀合基团)和/或任意内部位点。b.末端基团在某些实施方式中，寡聚化合物的一个或两个末端包含末端基团。在某些实施方式中，末端基团可以包含上文所述的任意缀合基团。在某些实施方式中，末端基团可以包含附加的核苷和/或反向无碱基核苷。在某些实施方式中，末端基团为稳定基团。
在某些实施方式中，寡聚化合物包含一种或更多种末端稳定基团，其能够增强诸如核酸酶稳定性等特性。稳定基团包括帽结构。本文使用的术语“帽结构”或“末端帽配基”是指可以连接到寡聚化合物的一个或两个末端的化学修饰。某些此类末端修饰可以保护具有末端核酸配基的寡聚化合物不受外切核酸酶的降解，且可以帮助其在细胞内的递送和/或定位。帽可以存在于5'-末端(5'-帽)或3'-末端(3'-帽)或可以存在于两个末端(更详细的内容参见Wincott et al.，国际PCT公开号WO 97/26270 ；Beaucageand Tyer，1993，Tetrahedron 49，1925 ;美国专利申请公开号 US 2005/0020525 ;以及 WO03/004602)。在某些实施方式中，将一个或更多个附加的核苷加入寡聚化合物的寡核苷酸的一个或两个末端。此类附加的末端核苷在本文中称为末端基团核苷。在双链化合物中，此类末端基团核苷是末端(3’和/或5’)突出。在双链反义化合物中，此类末端基团核苷可以与靶核酸互补或不互补。在某些实施方式中，末端基团为非核苷末端基团。此类非末端基团可以为除核苷以外的任意末端基团。
c.寡聚化合物基序在某些实施方式中，本发明的寡聚化合物包含基序Tf(Nu1)nl-(Nu2)也-(Nu1)n3-(Nu2)Jl4-(Nu1)n5-T2,其中Nu1，为第一类型的核苷；Nu2，为第二类型的核苷；每一个nl和n5均独立地为0至3 ;n2与n4之和在10至25之间;n3为0至5;以及每一个T1和T2均独立地为H、羟基保护基团，任选地连接的缀合基团或加帽基团。在此类实施方式中，n2和n4之和为13或14 ;nl为2 ;n3为2或3 ;以及n5为2。在某些此类实施方式中，本发明的寡聚化合物包含选自表A的基序。
权利要求
1.ー种方法，包括向对象给药包含反义寡核苷酸的反义化合物，该反义寡核苷酸互补 于人SMN2mRNA前体的编码核酸的内含子7，其中所述反义化合物给药至脑脊液。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述给药是至鞘内空隙。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述给药是至脑内的脑脊液。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，其中所述给药包含推注注射。
5.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，其中所述给药包含利用递送泵输注。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的方法，其中所述反义化合物给药的剂量为0.01至 10毫克反义化合物每千克对象体重。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述给药剂量为0.01至10毫克反义化合物每千 克对象体重。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述给药剂量为0.01至5毫克反义化合物每千克对象体重。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述给药剂量为0.05至1毫克反义化合物每千克对象体重。
10.根据权利要求6所述的方法，其中所述给药剂量为0.01至0. 5毫克反义化合物每千克对象体重。
11.根据权利要求6所述的方法，其中所述给药剂量为0.05至0. 5毫克反义化合物每千克对象体重。
12.根据权利要求6-11任意一项所述的方法，其中毎日给药所述剂量。
13.根据权利要求6-11任意一项所述的方法，其中每周给药所述剂量。
14.根据权利要求6-11任意一项所述的方法，其中连续给药所述反义化合物，且其中 所述剂量是每日给药的剂量。
15.根据权利要求1-13任意一项所述的方法，包括在诱导期给药至少ー个诱导剂量， 且在维持期给药至少ー个维持剂量。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述诱导剂量为0.05至5. 0毫克反义化合物每 千克对象体重。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述维持剂量为0.01至1.0毫克反义化 合物每千克对象体重。
18.根据权利要求15-17任意一项所述的方法，其中所述诱导期的持续时间为至少1周。
19.根据权利要求15-18任意一项所述的方法，其中所述维持期的持续时间为至少1周。
20.根据权利要求15-19任意一项所述的方法，其中各诱导剂量和各维持剂量均包含单次注射。
21.根据权利要求15-19任意一项所述的方法，其中各诱导剂量和各维持剂量均独立 地包含两次或更多注射。
22.根据权利要求1-21任意一项所述的方法，其中在至少1周的治疗期内，给药所述反 义化合物至少2次。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述治疗期为至少ー个月。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述治疗期为至少2个月。
25.根据权利要求22所述的方法，其中所述治疗期为至少4个月。
26.根据权利要求15-25任意一项所述的方法，其中通过一次或更多推注注射给药所 述诱导剂量，和通过输注泵给药所述维持剂量。
27.根据权利要求1-26任意一项所述的方法，包括评估反义化合物的所述耐受性和/ 或有效性。
28.根据权利要求1-27任意一项所述的方法，其中当出现所述反义化合物给药不耐受 的指征时，降低反义化合物的给药剂量或频率。
29.根据权利要求1-28任意一项所述的方法，其中当出现所述反义化合物给药有效的 指征时，维持或降低反义化合物的给药剂量或频率。
30.根据权利要求1-29任意一项所述的方法，其中当出现所述反义化合物给药无效的 指征时，增加反义化合物的剂量。
31.根据权利要求1-30任意一项所述的方法，其中当出现所述反义化合物给药有效的 指征时，降低反义化合物的给药频率。
32.根据权利要求1-31任意一项所述的方法，其中当出现所述反义化合物给药无效的 指征时，增加反义化合物的给药频率。
33.根据上述权利要求任意一项所述的方法，包括将所述反义化合物与至少一种其他 疗法联合给药。
34.根据权利要求33所述的方法，其中将所述反义化合物与至少一种其他疗法同时联合给药。
35.根据权利要求34所述的方法，其中在至少一种其他治疗给药前，给药所述反义化 合物。
36.根据权利要求34所述的方法，其中在至少一种其他治疗给药后，给药所述反义化 合物。
37.根据权利要求33-36任意一项所述的方法，其中所述至少一种其他治疗包括，给药 丙戊酸、利鲁唑、羟基脲和丁酸盐中的一种或更多种。
38.根据权利要求33-37任意一项所述的方法，其中所述至少一种其他治疗包括给药曲古霉素-A。
39.根据权利要求33-38任意一项所述的方法，其中所述至少一种其他治疗包括给药 干细胞。
40.根据权利要求33-39任意一项所述的方法，其中所述至少一种其他治疗为基因治疗。
41.根据上述权利要求任意一项所述的方法，其中所述反义化合物的给药浓度为约 0. 01mg/ml、约 0. 05mg/ml、约 0. lmg/ml、约 0. 5mg/ml、约 lmg/ml、约 5mg/ml、约 10mg/ml、约 50mg/ml、或约 100mg/ml。
42.根据权利要求1-41任意一项所述的方法，其中在对象的运动神经元中，SMN2mRNA 对外显子7的包含增加。
43.根据权利要求1-42任意一项所述的方法，其中在对象的运动神经元中，SMN2多肽 对外显子7的氨基酸的包含增加。
44.一种在对象的运动神经元中增加SMN2mRNA对外显子7的包含的方法，包括向对象 给药含有反义寡核苷酸的反义化合物，所述反义寡核苷酸互补于人SMN2编码核酸的内含 子7，进而在对象的运动神经元中增加SMN2mRNA对外显子7的包含。
45.一种在对象的运动神经元中増加SMN2多肽对外显子7氨基酸的包含的方法，包括 向对象给药含有反义寡核苷酸的反义化合物，所述反义寡核苷酸互补于人SMN2编码核酸 的内含子7，进而在对象的运动神经元中増加SMN2多肽对外显子7氨基酸的包含。
46.根据权利要求1-45任意一项所述的方法，其中所述对象患有SMA。
47.根据权利要求1-45任意一项所述的方法，其中所述对象患有I型SMA。
48.根据权利要求1-45任意一项所述的方法，其中所述对象患有II型SMA。
49.根据权利要求1-45任意一项所述的方法，其中所述对象患有III型SMA。
50.根据权利要求1-49任意一项所述的方法，其中在子宫内进行第一次给药。
51.根据权利要求50所述的方法，其中在血脑屏障完全形成前进行所述第一次给药。
52.根据权利要求1-49任意一项所述的方法，其中在对象出生1周内进行第一次给药。
53.根据权利要求1-49任意一项所述的方法，其中在对象出生1个月内进行第一次给药。
54.根据权利要求1-49任意一项所述的方法，其中在对象出生3个月内进行第一次给药。
55.根据权利要求1-49任意一项所述的方法，其中在对象出生6个月内进行第一次给药。
56.根据权利要求1-49任意一项所述的方法，其中在对象1至2岁时进行第一次给药。
57.根据权利要求1-49任意一项所述的方法，其中在对象1至15岁时进行第一次给药。
58.根据权利要求1-49任意一项所述的方法，其中在对象15岁以上时进行第一次给药。
59.根据权利要求1-58任意一项所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述对象是人。
61.根据权利要求1-60任意一项所述的方法，包括识别患有SMA的对象。
62.根据权利要求61所述的方法，其中通过测定对象ー块或更多块肌肉的电活性来识 别所述对象。
63.根据权利要求61所述的方法，其中通过遗传检测以确定对象的SMm基因中是否具 有突变来识别所述对象。
64.根据权利要求61所述的方法，其中通过肌肉组织活检来识别所述对象。
65.根据权利要求42所述的方法，其中所述反义化合物的给药使得含有外显子7的 SMN2mRNA的量增加至少10%。
66.根据权利要求65所述的方法，其中含有外显子7的SMN2mRNA的量増加至少20%。
67.根据权利要求65所述的方法，其中含有外显子7的SMN2mRNA的量増加至少50%。
68.根据权利要求65所述的方法，其中含有外显子7的SMN2mRNA的量増加至少70%。
69.根据权利要求43所述的方法，其中所述反义化合物的给药使得含有外显子7氨基 酸的SMN2多肽的量増加至少10%。
70.根据权利要求69所述的方法，其中含有外显子7氨基酸的SMN2多肽的量增加至少 20%。
71.根据权利要求69所述的方法，其中含有外显子7氨基酸的SMN2多肽的量增加至少 50%。
72.根据权利要求69所述的方法，其中含有外显子7氨基酸的SMN2多肽的量增加至少 70%。
73.根据权利要求1-72任意一项所述的方法，其中所述反义化合物的给药能在所述对 象中减轻SMA的至少一种症状。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述反义化合物的给药使得在所述对象中的运 动功能改善。
75.根据权利要求73所述的方法，其中所述反义化合物的给药使得在所述对象中运动 功能丧失被推迟或减少。
76.根据权利要求73所述的方法，其中所述反义化合物的给药使得呼吸功能改善。
77.根据权利要求73所述的方法，其中所述反义化合物的给药使得生存期改善。
78.根据权利要求1-77任意一项所述的方法，其中所述反义寡核苷酸的至少一个核苷 包含修饰的糖配基。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述至少一个修饰的糖配基包含2’-甲氧乙基糖配基。
80.根据权利要求1-79任意一项所述的方法，其中所述反义寡核苷酸的各核苷基本上 均包含修饰的糖配基。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述包含修饰糖配基的核苷均包含相同的糖修饰。
82.根据权利要求81所述的方法，其中各修饰的糖配基均包含2’-甲氧乙基糖配基。
83.根据权利要求1-79任意一项所述的方法，其中所述反义寡核苷酸的各核苷均包含 修饰的糖配基。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述核苷均包含相同的糖修饰。
85.根据权利要求84所述的方法，其中各修饰的糖配基均包含2’-甲氧乙基糖配基。
86.根据权利要求1-85任意一项所述的方法，其中至少一个核苷间连接是硫代磷酸酯 核苷间连接。
87.根据权利要求86所述的方法，其中各核苷间连接均为硫代磷酸酯核苷间连接。
88.根据权利要求1-87任意一项所述的方法，其中所述反义寡核苷酸由10至25个连 接的核苷组成。
89.根据权利要求1-87任意一项所述的方法，其中所述反义寡核苷酸由12至22个连 接的核苷组成。
90.根据权利要求1-87任意一项所述的方法，其中所述反义寡核苷酸由15至20个连 接的核苷组成。
91.根据权利要求1-87任意一项所述的方法，其中所述反义寡核苷酸由18个连接的核 苷组成。
92.根据权利要求1-91任意一项所述的方法，其中所述反义寡核苷酸与人SMN2的编码核酸具有至少90 %的互补性。
93.根据权利要求92所述的方法，其中所述反义寡核苷酸与人SMN2的编码核酸具有完 全的互补性。
94.根据权利要求1-93任意一项所述的方法，其中所述寡核苷酸具有核碱基序列，所 述核碱基序列包含SEQ ID NO 1的核碱基序列中的至少10个连续核碱基。
95.根据权利要求94所述的方法，其中所述寡核苷酸具有核碱基序列，所述核碱基序 列包含SEQ ID NO 1的核碱基序列中至少15个连续核碱基。
96.根据权利要求94所述的方法，其中所述寡核苷酸具有核碱基序列，所述核碱基序 列包含SEQ ID NO 1的核碱基序列。
97.根据权利要求94所述的方法，其中所述寡核苷酸具有核碱基序列，所述核碱基序 列由SEQ ID NO 1的核碱基序列组成。
98.根据权利要求1-97任意一项所述的方法，其中所述反义化合物包含缀合基团或末 端基团。
99.根据权利要求1-97任意一项所述的方法，其中所述反义化合物由反义寡核苷酸组成。
100.根据权利要求1-99任意一项所述的方法，其中所述反义化合物还可以全身给药。
101.根据权利要求100所述的方法，其中所述全身给药是通过静脉或腹腔注射。
102.根据权利要求100或101所述的方法，其中所述全身给药和给药至中枢神经系统 同时进行。
103.根据权利要求100或101所述的方法，其中所述全身给药和给药至中枢神经系统 在不同时间进行。
104.一种包含反义寡核苷酸的反义化合物，所述反义寡核苷酸互补于人SMN2编码核 酸的内含子7，所述反义化合物用于权利要求1-103任意一项所述的方法。
105.根据权利要求104所述的反义化合物，所述反义化合物用于治疗与运动神经元存 活基因1(SMN1)有关的疾病或状态。
106.一种包含反义寡核苷酸的反义化合物用于生产药物的用途，所述反义寡核苷酸互 补于人SMN2编码核酸的内含子7，所述药物用于前述任意权利要求所述的方法。
107.根据权利要求106所述的用途，其中该药物用于治疗与运动神经元存活基因 1 (SMN1)有关的疾病或状态。
全文摘要
本发明公开了用于调节对象中的SMN2mRNA剪接的化合物、组合物和方法。还提供了所公开的化合物和组合物用于生产药物的用途，所述药物用于治疗疾病和病症，包括脊髓性肌萎缩症。
文档编号A61K31/7088GK102665731SQ201080036807
公开日2012年9月12日 申请日期2010年6月17日 优先权日2009年6月17日
发明者A·R·克莱纳, C·F·班尼特, F·里戈, G·洪, K·W·克令格, L·史哈布丁, M·A·帕西尼, S·H·程, Y·华 申请人:Isis制药公司, 冷泉港实验室