用于肠和肌肉恢复的glp-2的制作方法

专利名称：用于肠和肌肉恢复的glp-2的制作方法
用于肠和肌肉恢复的GLP-2概括而言，本发明涉及营养和健康的领域。具体而言，本发明提供了能够治疗、限制或预防肌肉萎缩的组合物。本发明的实施方案涉及包含GLP-2的组合物和刺激GLP-2在体内的分泌以治疗或预防肌肉萎缩的组合物。在分解代谢状态中的肌肉萎缩是发病和致死的一个间接原因，这是由于生物体从所述分解代谢事件恢复的能力被严重损害。因此，临床营养中的一个主要挑战是改善全身蛋白质平衡，和由此的骨骼肌中蛋白质平衡的改善，所述骨骼肌是体内蛋白质的主要贮库。然而，合成代谢分子诸如胰岛素、支链氨基酸或谷氨酰胺对于恶病质患者的肌肉如果有积极效果的话，也只是较小的效果。最近显示，在年轻的饥饿/重新饲喂的大鼠中，骨骼肌依赖泛素-蛋白酶体的蛋白酶解对血浆胰岛素和氨基酸水平两者的增加的应答不足。该结论基于对肌肉蛋白酶解土蛋白酶解抑制剂(包括蛋白酶体抑制剂MG132)、泛素-蛋白酶体途径的几种组分的基因表 达和骨骼肌中遍在蛋白化速率的体外测定(Kee, A. J.，等人，2003，Journal of Physiology546:765-776)。如果发生肌肉质量的减少，则该状况通常被称为“肌肉萎缩”。肌肉萎缩特点为肌肉质量的部分损失。所述肌肉萎缩与减少蛋白质合成或增加蛋白质降解或与这二者相关。肌肉萎缩常常造成生活质量受损。日常工作变得越来越难以完成，且突然的乏力可能引起意外事故。罹患肌肉萎缩的个体常常为老年个体和/或罹患具有肌肉质量缩小的后果的疾病的个体。功能电刺激或简单的锻炼为对抗肌肉萎缩的通常措施。然而，根据待治疗个体的整体状况，这些方法可能不总是适用。因此期望得到能够治疗或预防肌肉萎缩且还可以用于不能增加体力活动的个体的组合物。所以，本发明的目的是改善本领域的状态，并提供用于治疗或预防肌肉萎缩的可摄取组合物。本发明人通过独立权利要求的主题实现该目的。从属权利要求进一步显示本发明。发明人已经进行了体内试验来研究在饥饿/重新饲喂模型中施用GLP-2对年轻的大鼠中蛋白质代谢的作用。已发现在年轻的大鼠中饥饿诱导的小肠萎缩与组织蛋白酶和蛋白酶体活性增加有关。GLP-2-诱导的小肠质量的增加与空肠和回肠二者中降低的组织蛋白酶活性相关，而蛋白酶体的肽酶活性没有改变。用GLP-2处置饥饿的大鼠(i)减少了小肠萎缩，(ii)防止了一些组织蛋白酶的活性增加和(iii)限制了空肠的绒毛高度和隐窝深度的降低。最后，当禁食的大鼠重新饲喂达6小时或24小时时，施用GLP-2确实加速了小肠和骨骼肌质量的恢复。在本发明中当大鼠接受GLP-2时，由饥饿诱导的小肠的萎缩降低16%。GLP-2处置的大鼠在重新饲喂24小时之后小肠完全恢复，而未处置的动物仍有26%的萎缩。
重要地是，骨骼肌质量恢复与小肠的恢复相似，且在GLP-2处置的大鼠中骨骼肌质量加速恢复。骨骼肌似乎不具有GLP-2受体。因此，所有这些观测数据证明对小肠质量的控制对于骨骼肌质量具有有益的影响。此外，对内脏质量的控制对于肌肉质量有影响。发明人现在相信肠的和肝的蛋白质质量这两者高度不稳定且通过溶酶体途径快速下降，所以控制肝的质量与控制小肠质量一样对肌肉质量有影响。据发明人所知，这是首个证明以下结果的研究例如在分解代谢状况(诸如禁食)之后的恢复期期间，控制小肠质量对于骨骼肌质量具有有益的影响。这些发现可应用于需要加速小肠和/或骨骼肌恢复的所有的状况，例如应用于临床情形中。 本发明还显示在营养的合成代谢作用中有优先肠的恢复总是先于肌肉质量的恢复。因此，本发明涉及支持肠的恢复的用于治疗或预防肌肉萎缩的组合物。还涉及支持肠的恢复的组合物在制备治疗或预防肌肉萎缩的组合物中应用。支持肠的恢复的组合物为本领域技术人员所知。例如，支持肠质量的恢复的组合物可以是包含肠道营养因子的组合物。肠道营养因子为本领域技术人员所知，且例如包括生长激素(GH)和/或血管活性肠肽(VIP)。此外，支持肠质量的恢复的组合物可以是包含的胰高血糖素样肽2(GLP_2)的组合物和/或刺激GLP-2在体内分泌的组合物。所以，本发明涉及用于治疗或预防肌肉萎缩的包含胰高血糖素样肽2(GLP_2)的组合物。本发明还涉及胰高血糖素样肽2(GLP_2)在制备用于治疗或预防肌肉萎缩的组合物中的应用。胰高血糖素样肽2 (GLP-2)是源自肠内分泌L-细胞中表达的胰高血糖素原基因的组织特异性的、翻译后加工的33-氨基酸的肽。Drucker 等人，Gut, 2002, 50, 428-435 和 Burrin 等人 Journal ofNutrition, 2001,第709-712页报道了各物种的GLP-2肽序列有比较高的同源性(87 -97%)，所述物种包括人、猪、奶牛和大鼠。因此，本发明的GLP-2包括人GLP-2和与人GLP-2具有至少87%序列同源性的蛋白质，优选与人GLP-2具有至少90%序列同源性的蛋白质，例如与人GLP-2具有至少95%序列同源性的蛋白质。人GLP-2具有以下序列HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD(SEQ-ID No. I)例如在2位的A可被G所替代，以防止GLP-2被二肽肽酶IV (DP IV)降解，并因此增加其半衰期。所得到的GLP-2具有以下序列HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD(SEQ-ID No. 2)例如依据本发明可使用的另外的GLP-2蛋白质如下HADGSFSDEMNTILDNLATRDFINWLIQTKITD(SEQ-ID No. 3)或HGDGSFSDEMNTILDNLATRDFINWLIQTKITD(SEQ-ID No. 4)。本发明的一个实施方案还涉及用于治疗、限制和/或预防肌肉萎缩的组合物，其包含胰高血糖素样肽2 (GLP-2)和/或刺激GLP-2在体内的分泌的配制物，所述配制物的热量密度范围为O. 8-2. Okcal/ml，其中至少10%的卡路里源自脂肪和/或至少25%的卡路里源自碳水化合物。虽然可摄入GLP-2以达到本发明的目的，但本发明还涉及当被摄取时刺激GLP-分泌的用于治疗或预防肌肉萎缩的组合物。因此本发明的一个实施方案是刺激GLP-2在体内的分泌的用于治疗或预防肌肉萎缩的组合物。
GLP-2分泌的主要刺激是营养摄取。Xiao，Q.等人Gastroenterologyl 17:99 - 105(1999)报道了发现N-IR-GLP-2水平在服用混合膳食和特别是响应于碳水化合物和脂肪而增加。因此刺激GLP-2在体内的分泌的组合物可以是富含碳水化合物和/或脂肪的组合物。此类组合物的热量密度范围可为O. 8-2. Okcal/ml，其中至少10%的卡路里源自脂肪和/或至少25%的卡路里源自碳水化合物。所述组合物可包含或可不包含蛋白质源。如果存在时，蛋白质源提供所述组合物的至多10%的卡路里。本发明的组合物可包含至少一种蛋白质源、至少一种碳水化合物源和/或至少一种脂质源。如果组合物包含碳水化合物源，则所使用的碳水化合物的种类没有特别限制。可使用任何合适的碳水化合物，例如蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、玉米糖浆固体、麦芽糖糊精、淀粉及其混合物。可使用不同的碳水化合物源的组合。碳水化合物源在组合物中可以以每IOOkcal组合物7. 0-19. Og的量存在。如果组合物包含脂质源，则所使用的脂质的种类没有特别限制。可加入长链n-3和/或n-6多不饱和脂肪酸,诸如DHA、ARA和/或EPA。适合的脂肪谱(fat profile)可使用芥花籽油、玉米油、高油酸向日葵油和中链甘油三酯油的混合物得到。脂质源在组合物中可以以每IOOkcal组合物I. 5-5. Og的量存在。如果存在，则蛋白质源可包括任何膳食蛋白质，例如动物蛋白质(诸如乳蛋白质、肉类蛋白质和卵蛋白质)；蔬菜蛋白质(诸如大 蛋白质、小麦蛋白质、大米蛋白质和婉 蛋白质);肽类；游离氨基酸的混合物；或其组合。可优选乳蛋白质诸如酪蛋白和乳清以及大豆蛋白质。至于乳清蛋白质而言，该蛋白质源可基于酸乳清或甜乳清或其混合物，并且可以以任何需要的比例包含α-乳清蛋白和乳球蛋白。蛋白质源还可包括牛血清白蛋白、酸析干酪素、酪蛋白酸盐、α -酪蛋白、β-酪蛋白、Y-酪蛋白。蛋白质源在组合物中可以以每IOOkcal组合物2. 0-8. 5g的量存在。所述蛋白质可以是完整的蛋白质或经水解的蛋白质或游离氨基酸。可使用完整的蛋白质和/或经水解的蛋白质和/或游离氨基酸的混合物。可能希望提供部分水解的蛋白质(水解程度(DH)在2和20%之间)以促进吸收。如果需要经水解的蛋白质，则根据需要进行水解操作，这是本领域已知的。例如，可通过在一个或多个步骤中酶促水解乳清片段来制备乳清蛋白水解物。还可添加膳食纤维。膳食纤维可以是可溶的或不溶的，通常，优选两种类型的混合物。合适的膳食纤维源包括大豆、豌豆、燕麦、果胶、瓜尔胶、阿拉伯胶、低聚果糖、低聚半乳糖、唾液酸乳糖和来源于动物乳的寡糖。优选的纤维共混物是菊粉与短链低聚果糖的混合物。本发明的组合物可通过本领域已知的任何方式制备。例如，如果所述组合物是营养配方产品，诸如临床营养配方产品或婴儿喂养产品，则其可以通过将蛋白质源、碳水化合物源和脂肪源以适合的比例一起混合而制备。如果使用，则乳化剂可包括在混合物中。可在此时加入维生素和矿物质，但通常稍后加入以避免热降解。可在混合之前将任何亲脂性维生素、乳化剂等溶解入脂肪源。然后可混入水、优选已进行反渗透的水，以形成液体混合物。然后可热处理液体混合物以减少细菌的载量。例如，可将该液体混合物快速加热至约120° C至约140° C的温度，进行大约5秒至约30秒。这可通过蒸汽注射或通过换热器进行；例如板式换热器。然后可将液体混合物冷却至大约60° C至大约85° C ;例如通过瞬时冷却。然后可匀化液体混合物；例如分两个阶段，在第一阶段大约7MPa至大约40Mpa，在第二阶段大约 2MPa至大约14Mpa。然后进一步冷却匀化的混合物以加入任何热敏成分；例如维生素和矿物质。此时方便地调整匀化混合物的pH和固体含量。将匀化的混合物转移至合适的干燥装置例如喷雾干燥器或冷冻干燥器，将其转变为粉末。粉末应当具有低于以重量计大约5%的含水量。还可以将GLP-2与刺激GLP-2在体内的分泌的组合物共同施用。本发明的组合物可被施用于人或动物，特别是宠物动物。还可以将其施用于具有完整结肠的患者。本发明的组合物可以是任何种类的组合物。所述组合物例如可经口、肠内、胃肠外施用(静脉内或皮下或肌内)。例如它可以是药物组合物、功能性食品、食品添加剂、宠物食品、食品或饮料。本发明的食品包括乳制品，诸如发酵乳制品，例如酸乳酪、酪乳等；冰激凌；浓缩乳；乳；乳奶油(dairy creams);调味的乳饮品；基于乳清的饮料；顶端料(toppings);咖啡奶精；巧克力；基于干酪的产品；汤；果酱；菜泥；调味品；布丁 ；乳蛋糕(custard);婴儿食品；营养配方产品，诸如全营养配方产品，例如婴儿配方产品、儿童配方产品、青少年配方产品、成年人配方产品、老年人配方产品或垂危患者配方产品；谷类食物和压缩干粮。饮料包括，例如基于乳-或酸乳酪的饮料、发酵乳、蛋白质饮料、咖啡、茶、能量饮料、大豆饮料、水果和/或蔬菜饮料、水果和/或蔬菜汁。食品添加剂或药物可以例如是片剂；胶囊剂；锭剂；小药囊；凝胶剂；或液体制剂的形式，例如，营养液。组合物还可包含保护性水胶体(如树胶、蛋白质、改性淀粉)、粘合剂、成膜剂、包封剂/材料、壁/壳材料、基质化合物、包衣剂、乳化剂、表面活性剂、增溶剂(油、脂肪、蜡、卵磷脂等)、吸附剂、载体、填充剂、辅助化合物(co-compound)、分散剂、润湿剂、加工助剂(溶剂)、助流剂、味道掩蔽剂、增重剂、成凝胶剂、凝胶形成剂、抗氧化剂和抗菌剂。组合物还可包含常规的药物添加剂和辅助剂、赋形剂和稀释剂，包括但不限于水、任何来源的明胶、植物胶、木质素磺酸盐、滑石粉、糖、淀粉、阿拉伯胶、植物油、聚亚烷基二醇、矫味剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂、润滑剂、着色剂、润湿剂、填充剂等。此外，组合物可包含适于口服或肠内施用的有机或无机载体物质以及依据政府机构诸如USDA所推荐的维生素、矿物质痕量元素和其它的微量营养素。可加入稳定剂以稳定所述组合物及其组分。可加入矫味剂和/或着色剂以调节味道和赋予组合物以易于鉴别和/或感觉愉快的颜色。本发明的组合物可用于改善骨骼肌恢复。可能特别在临床营养领域有这样的需求。本发明的组合物还可用于改善小肠和肌肉质量恢复。
重要地是，小肠与肌肉质量例如骨骼肌质量的恢复可通过使用本发明中描述化合物而同时改善。本发明的组合物还可用于增加肝蛋白质质量恢复。所以，该组合的作用可通过仅施用一种组合物而达成，所述组合物即包含胰高血糖素样肽2 (GLP-2)的组合物、刺激GLP-2在体内的分泌的组合物或这二者的组合产品。本发明的组合物可在营养不良期期间或之后施用。营养不良期可(例如)由几种临床状态引起,诸如多种急性或慢性疾病,例如,感染、癌症、AIDS、烧伤、创伤及其它。营养不良当然还可由食物摄取不足或由进食不能足量提供所有营养素的膳食而引起。本领域的技术人员将理解就本发明所描述的所有特征可被组合而不背离所公开发明的范围。具体而言，就本发明的组合物所描述的特征可应用本文所述的用途，反之亦然。以下实施例、表格和附图
阐明本发明的进一步的特征和优势。图I.空肠中绒毛高度(A)和隐窝深度(B)的形态测定的分析和测定。数值为n=5只动物的平均值土SEM(竖线)，且表示为占饲喂对照的％。饲喂的大鼠(实心棒)；饥饿的大鼠(空心棒)。具有不同字母的棒具有显著性差异(P〈0.05)。图2.回肠中绒毛高度(A)和隐窝深度(B)的形态测定的分析和测定。数值为n=5只动物的平均值土SEM(竖线)，且表示为占饲喂对照的％。饲喂的大鼠(实心棒)、饥饿的大鼠(空心棒)。具有不同字母的棒具有显著性差异(P〈0.05)。图3.注射盐水或GLP-2的、饲喂的和饥饿的大鼠的空肠(A)和回肠(B)中的蛋白酶体的糜蛋白酶样和胰蛋白酶样活性。数据表示荧光底物(参见实施例部分)所释放的任意荧光单位对时间的最佳拟合的斜率。数值表示为占注射盐水-饲喂的大鼠的％，且为每组的5只动物的平均值土SEM(竖线)。注射盐水-饲喂的大鼠(空心棒)、注射GLP-2-饲喂的大鼠(阴影线棒)、注射盐水-饥饿的大鼠(实心棒)和注射GLP-2-饥饿的大鼠(点形棒)。具有不同字母的棒具有显著性差异(P〈0.05)。图4.注射盐水-或GLP-2-的、饲喂的和饥饿的大鼠的空肠(A)和回肠(B)中的组织蛋白酶(B、B+S、B+L+S和D)活性。数据表示荧光底物(参见材料和方法部分)所释放的任意突光单位(arbitrary fluorescence units)对时间的最佳拟合的斜率。数值被表示为占注射盐水-饲喂的大鼠的％，且为每组的5只动物的平均值土SEM(竖线)。注射盐水-饲喂的大鼠(空心棒)、注射GLP-2-饲喂的大鼠(阴影线棒)、注射盐水-饥饿的大鼠(实心棒)和注射GLP-2-饥饿的大鼠(点形棒)。具有不同字母的棒具有显著性差异(Ρ〈0· 05)。图5.注射盐水或GLP-2的大鼠在饥饿48小时和重新饲喂6或24小时后的小肠的质量。数据为每组的5只动物的平均值土SEM。饲喂的大鼠(空心棒)、饥饿的大鼠(实心棒)、6小时重新饲喂的-饥饿的大鼠(阴影线棒)和24小时重新饲喂的-饥饿的大鼠(灰色棒)。具有不同字母的棒具有显著性差异(Ρ〈0.05)。图6.注射盐水或GLP-2的大鼠在饥饿48小时和重新饲喂6或24小时后的胫骨前肌、腓肠肌和EDL肌肉的质量。数据为每组的5只动物的平均值土SEM。饲喂的大鼠(空心棒)、饥饿的大鼠(实心棒)、6小时重新饲喂的-饥饿的大鼠(阴影线棒)和24小时重新饲喂的-饥饿的大鼠(灰色棒)。具有不同字母的棒具有显著性差异(Ρ〈0.05)。表I:禁食大鼠的体重、小肠和骨骼肌的质量。数据为平均值土SEM，每组η=8只大鼠。在一行中具有不同上标的数值具有显著性差异(Ρ〈0.05)。 表2:饥饿之后大鼠小肠中的酶活性。数值表示为占饲喂对照的％，且为平均值土SEM，每组η=8只大鼠。在一行中具有不同上标的数值具有显著性差异(Ρ〈0.05)。表3:GLP_2对饥饿-诱导的体重损失和肠萎缩的作用。数值为平均值土SEM，每组n=13-15只大鼠。通过双因素ANOVA以及随后的“事后(posterior) ” PLSD Fisher氏测试来评价统计差异。N为饥饿作用；GSGLP-2作用。在一行中具有不同上标的数值具有显著性差异(P〈0. 05)。表4:GLP_2对饥饿-诱导骨骼肌萎缩的作用。数值为平均值土 SEM，每组n=5只大鼠。通过双因素ANOVA以及随后的“事后(posterior)” PLSD Fisher氏测试来评价统计差异。N为饥饿作用；GSGLP-2作用。在一行中具有不同上标的数值具有显著性差异(Ρ〈0· 05)。实施例材料大鼠重组体GLP-2购自Washington Biotechnology Inc.(哥伦比亚，马里兰州，美国)。2位的[Ala]被[Gly]替代以使肽抗DPP IV降解。本研究中使用的GLP-2肽序列如下HGDGSFSDEMNTILDNLATRDFINWLIQTKITDo动物、饲养和试验设计年轻的雄性Wistar大鼠(50_60g)来自Charles River (拉尔布雷勒，法国)，并保持在控制温度的室内(22±1° C)，12-小时光照/12-小时黑暗交替。在5天的适应期内使它们自由接近标准的啮齿动物饲料(A03 ;UAR，Epernay sur Orge,法国)和水。进行了三个试验。(I)在第一个试验中，对大鼠无限制供应食物或者禁食I或2天。在禁食期末尾，腹膜内注射氨基甲酸乙酯将大鼠麻醉(I. 7g/kg体重,Sigma Aldrich,里昂，法国)并处死。(2)在第二个试验，将动物随机分为对照组和GLP-2处置组(每组n=26-30只)。在第O天每12小时注射盐水(400 μ L)或GLP-2 (20 μ g/400 μ L盐水)，并持续直至试验结束。在第4天，将各组中一半的大鼠禁食2天。在第6天，如上文所述将动物处死。(3)在最后一个试验中，如试验2中所述将大鼠进行分配。将对照和GLP-2处置组(每组n=20只)分为2组，分别为饲喂的大鼠组(n=5)和饥饿的大鼠组(n=15)。注射盐水和GLP-2持续至处死大鼠。在第6天，将来自使用GLP-2处置或未使用GLP-2处置的饲喂组和48小时禁食组的5只大鼠如上文所述处死。从第6天将来自对照组和GLP-2处置组的剩余的禁食动物无限制地重新饲喂6或24小时。重新饲喂后，将大鼠如上文所述处死。组织收集 将完整的小肠迅速取出，使用冰冷的PBS清洗三次，标记并称重。将幽门括约肌端的尾部的IOcm和回肠-盲肠连接处头部的IOcm取出并弃去。将空肠和回肠切断，称重，并分为5cm的小段。将第一段立即处理，用于测定组织蛋白酶活性。剩余的小段冷冻在液氮中，并在-80° C存储至进一步分析。在试验3中，还将骨骼肌(EDL、腓肠肌和胫骨前肌)小心的切出并称重。组织蛋白酶活性 使用polytron匀浆器将空肠和/或回肠的5cm的小段立即在之前所述3°的含SOmmoI /T, KCI - 1mmoI /T, EDTA 和 O. 25mol/L 鹿糖的 10mmol/L 憐酸盐缓冲液(pH 7. 4)中勻化。然后以1，OOOg将匀浆离心(10分钟，4° C)。将上清液以2，500g离心(10分钟，4° C)，然后再次以40，OOOg离心(20分钟，4° C)。将所得的小球再混悬于含O. 2mmol/L EDTA的20mmol/L的醋酸钠缓冲液(pH 5.5)中，并在-20° C存储至再次分析。分别使用荧光底物Z-精氨酸-精氨酸-AMC (ZAA-AMC, 50 μ mol/L, Sigma)、Z_ 苯丙氨酸-精氨酸-AMC (ZPA-AMC，30 μ mol/L, Sigma)测定组织蛋白酶B和组织蛋白酶B+L+S活性3°。由于中性pH降低组织蛋白酶L活性，使用ZPA-AMC在pH 7. O测定的大部分的组织蛋白酶B+L+S活性反应了组织蛋白酶 B+S 活性。使用突光底物 MOCAc-Gly-Lys-Pro-Ile-Leu-Phe-Arg-Leu-Lys (Dnp) -D-Arg-NH2 (M0CA, 20 μ mol/L, Peptide Institute Inc，大阪，日本)测定组织蛋白酶 D 活性。通过在37° C使用萤光光谱仪FLX800 (Biotek)测定荧光分解产物(甲基香豆素基_酰胺，AMC)在45分钟内的累积，来测定肽酶活性。连续在380nm的激发波长和440nm的发射波长测定荧光。通过线性回归分析AMC在底物水解之后累积的时程以计算肽酶活性，例如累积的AMC的最佳拟合的斜率。通过反应中蛋白质的量校正最终数据。蛋白酶体活性使用polytron勻衆器将空肠和/或回肠的小段的蛋白质在含50mmol/L Tris/HCl、5mmol/L MgCl2、250mmol/L 鹿糖、10mmol/L ATP> lmmol/L DTT、10 μ g/mL 抑蛋白酶妝、10 μ g/mL亮抑蛋白酶肽、10 μ g/mL抗蛋白酶、10 μ g/mL抑胃酶肽A和0. 2mmol/L苯基甲基磺酰基氟化物(PMSF)的冰冷的缓冲液(pH 7.5)中匀化。如述将蛋白酶体分离31。将蛋白酶体小球再混悬于含50mmol/L Tris/HCl、5mmol/L MgCl2和20%甘油的缓冲液中。将分离的蛋白酶体在-80° C存储至分析。依据制造商说明书使用Biorad蛋白质测定法测定蛋白酶体制备物的蛋白质含量。在蛋白酶体抑制剂MGUZGOymol/USigma)存在和不存在的情况下，分别使用突光底物琥拍酰-leu-leu-val-tyr-AMC(Suc-LLVY_AMC, 300 μ mol/L, Sigma)和 boc-leu-arg-arg-AMC (Boc-LRR-AMC,800 μ mol/L, Biomol InternationalLP，埃克赛特，德文郡，UK)测定糜蛋白酶样、胰蛋白酶样活性。如对组织蛋白酶活性测定所述那样，在37° C连续测定AMC在45分钟内的累积。计算40 μ mol/L蛋白酶体抑制剂MG132 (Affiniti)存在或不存在时在反应介质中的所记录的任意荧光单位之间的差别。通过反应中蛋白质的量校正最终数据。
组织学测定和形态测定将来自空肠和回肠的组织样品固定于使用Na2C03(10g/L)缓冲的10%甲醛中，并进行绒毛高度和隐窝深度测定。在测定时载玻片的处置标志是遮盖的。统计数据表示为平均值土SEM。使用单因素或双因素ANOVA来解决在试验I中的禁食作用和试验2和3中的禁食作用和GLP-2作用。进行事后的PLSD Fisher氏测试以评价各组的差别。认为P值〈O. 05为统计学显著，且认为P值〈O. 10为统计学趋势。结果禁食后小肠肽酶活性表I显示在I和2天的禁食之后禁食诱导强烈的和进行性的体重的损失(分别 为-16%和-28%)。2天的饥饿过程中小肠的和EDL肌肉的质量逐渐降低，至达到27%的萎缩(表I)。为表征蛋白酶解在小肠萎缩中的作用，在空肠评价来自依赖溶酶体和依赖蛋白酶体的蛋白酶解途径的肽酶活性(表2)。饥饿诱导20S蛋白酶体的糜蛋白酶样(+47%，ns)、胰蛋白酶样(+66%)和胱天蛋白酶样(+111%)的活性的增加。此外，与饲喂的动物相比，在饥饿48小时的大鼠中组织蛋白酶B、B+S和B+L+S活性增加34至38%。禁食达到24小时后组织蛋白酶D活性就开始增加(+91%)，且在禁食48小时后继续增加至161%。因此小肠的萎缩与空肠中组织蛋白酶及蛋白酶体的活性的增加相关，48小时禁食后作用最大。因此在饲喂的和饥饿48小时的大鼠研究GLP-2对小肠的蛋白酶解的作用。GLP-2对饥饿-诱导的体重损失、小肠萎缩和组织学改变的作用GLP-2处置没有改变动物的每日食物摄取(未给出数据)。饥饿诱导强烈的体重损失，所述损失在未处置组和处置组相似(分别为-25%和-22%，P〈0. 0001，表3)。饥饿后小肠强烈萎缩(_29%，P〈0. 0001)，空肠和回肠中的萎缩相似(分别为-32和_22%，P〈0. 001，表3)。双因素ANOVA分析表明，除饥饿诱导的萎缩之外，GLP-2处置还增加总的小肠的、空肠的和回肠的质量分别达22%(P〈0. 0001)、21%(P〈0. 0001)和17. 5%(P〈0. 005)。虽然，在注射盐水和注射GLP-2的大鼠中饥饿的作用相似，但在注射盐水的-饲喂大鼠和在GLP-2处置的-饥饿的大鼠中整个小肠的和回肠的质量相似。此外，与未处置的饥饿的大鼠(对比注射盐水的-饲喂的大鼠_32%，P〈0. 0001)相比，在GLP-2-处置的饥饿的大鼠中GLP-2限制空肠的萎缩(对比注射盐水的-饲喂的大鼠_12%，P〈0. 005)(表3)。禁食诱导空肠中绒毛高度和隐窝深度的降低(分别为-23%和-31%，P〈0. 05，图I)。与之相反，饥饿在回肠中仅诱导很少的形态学变化(图2)。在空肠中，GLP-2处置限制饥饿后绒毛高度的减少(-13%)，并阻止饥饿后隐窝深度的下降(图I)。在回肠中GLP-2处置的作用非常不同，原因是它对禁食后的绒毛高度无作用，且不抑制禁食后的隐窝深度的降低(图2)。GLP-2对饥饿-诱导的小肠中蛋白酶体的肽酶活性的提升的作用在试验2中，在注射盐水的大鼠中，饥饿诱导空肠中的蛋白酶体的糜蛋白酶样活性(+98%, P<0. 0001)和胰蛋白酶样活性(+40%, P<0. 0005)的强烈的增加(图3A)，但在回肠中对这些活性没有作用(图3B)。通过每日施用GLP-2，空肠中蛋白酶体的肽酶活性(图3A)或回肠中蛋白酶体的肽酶活性(图3B)没有变化。而且，GLP-2处置不阻止禁食后在空肠中观测到的糜蛋白酶样和胰蛋白酶样活性的增加(图3A)。在空肠和回肠中测定溶酶体蛋白水解活性。在空肠中饥饿后组织蛋白酶B+L+S和组织蛋白酶D的活性分别增加25%(P〈0. 01)和90%(P〈0. 05)(图4A)。此外，在饥饿的大鼠的空肠中组织蛋白酶B和组织蛋白酶B+S活性趋于分别增加50%(P〈0. 10)和31%(P>0. I)。与之相反，与饲喂对照组相比，组织蛋白酶B和组织蛋白酶B+L+S在饥饿的大鼠的回肠中完全不增加(图4B)。有趣地是，GLP-2处置阻止饥饿的大鼠的空肠中的组织蛋白酶活性的增加(图4A)。而且，与未处置的大鼠相比，施用GLP-2诱导回肠中组织蛋白酶B活性(-43%, P〈0. 002)和组织蛋白酶B+L+S活性(-50%，P〈0. 0005)的降低，甚至饥饿都不改变该组织中的溶酶体活性(图4B)。这些结果表明GLP-2对空肠的保护作用可能源自对溶酶体途径的抑制。GLP-2对饥饿-诱导的骨骼肌萎缩的作用
2天的饥饿之后胫骨前肌、腓肠肌和EDL肌肉萎缩 20%(P〈0. 0001)。GLP-2施用不阻止这种骨骼肌损失。然而，GLP-2被认为是肠粘膜上皮细胞应答内腔营养素的动态适应的生理调节剂。因此，已在48小时饥饿期之后重新饲喂的大鼠中对GLP-2处置的影响进行了研究。图5显示与注射盐水的动物相比，GLP-2处置的动物显示小肠的质量恢复加速。当大鼠接受GLP-2时，重新饲喂6小时之后小肠的萎缩减少至15%(P〈0. 001)，且在24小时之后完全消失，而在注射盐水大鼠中，萎缩在6小时(-32%，P<0. 0001)和24小时(-26%，P<0. 0001)之后仍然明显。有趣地是，骨骼肌的质量恢复与小肠恢复相似，且通过所述处置而改善。在注射盐水的大鼠重新饲喂24小时之后，胫骨前肌(图6A)、腓肠肌(图6B)和EDL(图6C)肌肉仍然分别萎缩10%、16· 5%和18%(P〈0. 0001)。这与饥饿48小时之后所观测到的肌肉质量损失几乎完全相同(图6)。相反，GLP-2处置增强骨骼肌恢复。与GLP-2处置的、饲喂的大鼠相比，在重新饲喂24小时之后，胫骨前肌和EDL肌肉完全恢复，而腓肠肌仍然有9%的轻微地萎缩(P〈0. 05)。序列表〈110〉雀巢产品技术援助有限公司〈120〉肠和肌肉恢复<130>N0 10200<160>4<170>PatentIn 版本 3. I<210>1<211>33<212>PRT〈213〉人类〈400〉IHis Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr He Leu Asp Asn151015Leu Ala Ala Arg Asp Phe He Asn Trp Leu He Gln Thr Lys He Thr202530
Asp<210>2<211>33<212>PRT〈213〉人工〈220〉〈223〉在2位具有Ala_>Gly替换的人GLP-2序列<400>2His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr He Leu Asp Asn151015Leu Ala Ala Arg Asp Phe He Asn Trp Leu He Gln Thr Lys He Thr202530Asp<210>3<211>33<212>PRT〈213〉黑鼠(Rattus rattus)<400>3His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr He Leu Asp Asn151015Leu Ala Thr Arg Asp Phe He Asn Trp Leu He Gln Thr Lys He Thr202530Asp<210>4<211>33<212>PRT〈213〉人工〈220〉〈223〉在2位具有Ala_>Gly替换的大鼠GLP-2序列<400>4 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr He Leu Asp Asn151015Leu Ala Thr Arg Asp Phe He Asn Trp Leu He Gln Thr Lys He Thr202530Asp表I:
权利要求
1.用于治疗、限制和/或预防肌肉萎缩的组合物，其包含 胰高血糖素样肽2 (GLP-2)和/或 刺激GLP-2在体内的分泌的配制物，其热量密度范围为0. 8-2. Okcal/ml，其中至少10%的卡路里源自脂肪和/或至少25%的卡路里源自碳水化合物。
2.依据权利要求I的组合物，其中所述肌肉萎缩是骨骼肌萎缩。
3.通过支持肠的恢复用于治疗、限制和/或预防肌肉萎缩的依据权利要求1-2中的一项的组合物。
4.依据前述权利要求中的一项的组合物，其还包含肠道营养因子，诸如生长激素(GH)和/或血管活性肠肽(VIP)。
5.依据权利要求1-4中的一项的组合物，其中所述GLP-2具有选自以下的氨基酸序列HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD(SEQ-ID No. I)、HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD(SEQ-ID No. 2)、HADGSFSDEMNTILDNLATRDFINWLIQTKITD(SEQ-ID No. 3)、HGDGSFSDEMNTILDNLATRDFINWLIQTKITD (SEQ-ID No. 4)或其组合。
6.用于改善骨骼肌恢复的依据前述权利要求中的一项的组合物。
7.用于改善小肠和肌肉质量恢复的依据前述权利要求中的一项的组合物。
8.用于增加肝蛋白质质量恢复和改善肌肉质量恢复的依据前述权利要求中的一项的组合物。
9.在营养不良期期间或之后施用的依据前述权利要求中的一项的组合物。
10.依据前述权利要求中的一项的组合物，其中所述组合物选自食品、功能性食品、饮料、食品添加剂和药物。
11.依据前述权利要求中的一项的组合物，其中所述组合物是营养配方产品。
12.依据前述权利要求中的一项的组合物，其中所述组合物旨在用于口服、经肠和/或肠胃外施用。
13.依据前述权利要求中的一项的组合物，其中所述组合物包含每IOOkcal组合物7-19g的量的碳水化合物源。
14.依据前述权利要求中的一项的组合物，其中所述组合物包含每IOOkcal组合物1.5-5. Og的量的脂质源。
15.依据前述权利要求中的一项的组合物，其中所述组合物包含每IOOkcal组合物2. 0-8. 5g的量的蛋白质源。
全文摘要
概括而言，本发明涉及营养和健康的领域。具体而言，本发明提供了能够治疗、限制或预防肌肉萎缩的组合物。本发明的实施方案涉及包含GLP-2的组合物和刺激GLP-2在体内的分泌以治疗或预防肌肉萎缩的组合物。
文档编号A61P1/00GK102711803SQ201080055259
公开日2012年10月3日 申请日期2010年10月7日 优先权日2009年10月7日
发明者A·科德兰-雷松, D·布勒耶, D·阿泰, I·科尔特赛-图拉兹, L·孔巴雷特 申请人:法国农业科学研究院, 雀巢产品技术援助有限公司