专利名称：一种虫草多糖的安全提取方法
技术领域：
本发明属于传统中药药理活性成分提取领域，具体涉及一种从冬虫夏草子实体中 提取虫草多糖的安全提取方法。
背景技术：
和人参、鹿茸并称为三大补品的冬虫夏草(Cordyc印s sinensis)，因其含有丰富 的虫草多糖、虫草素、虫草酸和多种氨基酸，是现在功能食品的研究领域的热点，其中虫草 多糖是含量最大的生理活性物质，具有很强的降血糖，抗肿瘤，延缓衰老，保护肝脏的功能。 大量医学实验研究表明，虫草多糖对单核巨噬细胞系统和体液免疫功能有增强作用。能增 强巨噬细胞的吞噬能力，调节内分泌，提高人体免疫力。现今的提取虫草多糖技术主要有超声波法，超临界(X)2法，水提醇沉法，稀醇提取 法四种。水提醇沉法，稀醇提取法是传统的提取方法。水提醇沉法是应用水浸提冬虫夏草， 使虫草多糖溶于水中，再经脱蛋白，用乙醇沉淀虫草多糖，收集沉淀干燥即得虫草多糖产 品。水提醇沉法，稀醇提取法因设备和操作简单，提取率高，现在仍被大家所接受。但是大 部分技术在除去混杂在多糖中的蛋白时都是使正丁醇氯仿=4 1)法。而 正丁醇和氯仿属于有毒物质，在利用上述kvage法去蛋白的方法提取出来的虫草多糖制 备功能食品时，残留的丙酮和氯仿会对食品安全造成危害。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的提取的虫草多糖可能存在有害物质残留的缺 点，提供一种虫草多糖的安全提取方法。本发明在冬虫夏草的浸提液中加入适当含量的氯化钙，并调节浸提液的PH值至 4 5，使浸提液中的蛋白沉淀，从而实现了本发明的目的。本发明的虫草多糖的安全提取方法，包括用水浸提冬虫夏草，浸提液经脱蛋白后， 再用乙醇沉淀，收集沉淀干燥即得虫草多糖产品，其特征在于，所述的浸提液脱蛋白包括以 下步骤(1)在浸提液中加入氯化钙，加入的氯化钙与浸提液的质量体积比为(30 40) lg/L，并调节pH值为4 5，沉淀蛋白30 60min，去除蛋白沉淀，得到去除蛋白的 液体；(2)再在去除蛋白的液体中重复步骤(1)的操作1 2次，而最终得到脱蛋白后 的液体。所述的用水浸提冬虫夏草优选是将磨碎后的冬虫夏草子实体粉末，加入其质量 10 20倍的水中，在60°C下浸提8小时，再经离心收集上清液，重复浸提3次，合并得提取 液，提取液再在60°C下浓缩至提取液原体积的1/3，得到浸提液。以该方法进行浸提，虫草 多糖的提取率比较高。所述的步骤⑵得到脱蛋白后的液体，在用乙醇沉淀之前优选是将其在60°C下，浓缩至脱蛋白后的液体的原体积的1/3，得到浓缩液。所述的用乙醇沉淀，收集沉淀干燥即得虫草多糖产品，优选包括以下步骤在浓缩 液中加入浓缩液3倍体积的体积分数为95%的乙醇水溶液，4°C静止12小时，收集沉淀，在 60°C烘箱中烘干得到虫草多糖产品。上述优选措施的烘干、提取和浓缩温度均为60°C，该温度既有利于保护虫草多糖 结构的稳定性，从而保护虫草多糖的药效，同时在该温度下，产出效率高，生产能耗和成本 低。本发明的虫草多糖的安全提取方法，利用合适浓度的氯化钙，并调节浸提液的pH 值为4 5，使其接近冬虫夏草浸提液中的大部分蛋白质在氯化钙混合液中的等电点，有利 于除去大部分酸性蛋白，提高多糖的纯度。利用氯化钙使蛋白质变性沉淀蛋白，使大部分蛋 白沉淀而被分离，减少了多糖在沉淀蛋白过程中的流失，利用本发明的方法中的氯化钙脱 蛋白，制备出的虫草多糖产品中的蛋白残留量为左右，多糖纯度为85%以上，脱蛋白效 果很好，并且氯化钙价格便宜，操作方便，在室温下即可进行，且不破坏多糖的结构，适于工 业化生产。本发明利用氯化钙代替传统的有毒的丙酮和氯仿混合液或三氯乙酸等除蛋白，确 保了制备出来的虫草多糖安全无毒，避免对食品安全造成危害。本发明的虫草多糖的安全提取方法中的氯化钙脱蛋白与现有技术中的三种脱蛋 白方法的比较如表1所示表1 虫草多糖提取方法中脱蛋白方法的比较
项目 方法性质效果价格操作CaCl2无毒无副作用效果较好价格低廉，需 求量少简便，二次离心即可Scvagc 法正丁醇属低毒 物，氯仿有毒， 有刺激性气味效果好于其他方法价格低廉，需 求量大较复杂，重复三次，且分离不便TCA (Ξ氯乙酸)低毒物质，有刺 激性气味效果较好，酸性容易破 坏呋喃糖残基多糖价格低廉，需 求量少较复杂，液体分离不便酶解法无毒无副作用效果较好，但容易引入 新蛋白杂质价格较高，需 求量少简便，但需要适宜反应条件
具体实施例方式
以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1(1)提取将60°C温度下烘干的冬虫夏草子实体，用中药粉碎机粉碎后过40目筛， 称取10克粉末，加入IOOml的蒸馏水，水温60°C提取8小时，离心(3000r/min, 10分钟)收 集上清液，将沉淀物再加蒸馏水提取，重复提取三次，合并得提取液。(2)浓缩将提取液加入到旋转蒸发仪的蒸发瓶中，真空度为-0. IMPa，调节水浴 锅温度为60°C，将提取液浓缩至原体积的三分之一，得到浓缩后的浸提液。(3)脱蛋白在浓缩后的浸提液中加入氯化钙，使其浓度为3% (w/v)，调节pH为 4，室温振摇30分钟后离心，除去蛋白沉淀，再在去除蛋白的溶液中加入氯化钙，加入的氯 化钙与去除蛋白的溶液的质量体积比为30 lg/L，室温振摇30分钟后离心，除去蛋白沉 淀，得到脱蛋白后的液体。(4) 二次浓缩将脱蛋白后的液体加入到旋转蒸发仪中浓缩，真空度为-0. IMPa, 60°C蒸发至原体积的三分之一，获得浓缩液。(5)干燥在步骤(4)获得的浓缩液加入该浓缩液3倍体积(体积分数为95% ) 的乙醇水溶液，4°C冰箱中静止12小时。离心去上清，收集含有虫草多糖的沉淀，在60°C烘 箱中烘干得到淡黄色虫草多糖产品。称重得虫草多糖提取率为7.85%(6)残余蛋白和多糖含量鉴定将干燥好的虫草多糖产品加蒸馏水溶解，用 Bradford蛋白质定量试剂盒和苯酚-硫酸法分别测定虫草多糖产品中残余蛋白和多糖含 量。得残余蛋白含量为1%，多糖纯度为87.7%。实施例2(1)提取将60°C温度下烘干的冬虫夏草子实体用中药粉碎机粉碎后过60目筛， 称取10克粉末，加入200ml的蒸馏水，水温60°C提取8小时，离心(3000r/min, 10分钟)收 集上清液，将沉淀物再加蒸馏水提取，重复提取三次，合并提取液。(2)浓缩将提取液加入到旋转蒸发仪的蒸发瓶中，真空度为-0. IMPa，调节水浴 锅温度为60°C，将提取液浓缩至原体积的三分之一，得到浓缩后的浸提液。(3)脱蛋白在浓缩后的浸提液中加入氯化钙，加入的氯化钙与浸提液的质量体 积比为40 lg/L，调pH为5，室温振摇60分钟后离心，除去蛋白沉淀，得到去除蛋白的溶 液。再在该去除蛋白的溶液中重复上述操作2次，得脱蛋白后的液体。(4) 二次浓缩将脱蛋白后的液体加入到旋转蒸发仪中浓缩，真空度为-0. IMPa, 60°C蒸发至原体积的三分之一，得到浓缩液。(5)干燥在步骤(4)得到的浓缩液中加入该浓缩液3倍体积(体积分数95% ) 的乙醇水溶液，4°C冰箱中静止12小时。收集含有虫草多糖的沉淀，在60°C烘箱中烘干得到 淡黄色虫草多糖产品。重量分析为虫草多糖提取率为8.1%(6)残余蛋白和多糖含量鉴定将干燥好的虫草多糖产品加蒸馏水充分溶解，用 Bradford蛋白质定量试剂盒和苯酚-硫酸法分别测定虫草多糖产品中残余蛋白和多糖含 量。得残余蛋白含量为1.0%，多糖纯度为85.2%。测定方法(1)蛋白含量测定方法(Bradford蛋白质定量试剂盒)标准曲线的绘制将0、10、20、30、40、50、60μ 1的牛血清白蛋白(BSA)标准溶 液(lmg/ml)分别加入到试管中，加入PBS补足到150 μ 1，向各试管中加入考马斯亮蓝染2. 85ml，混勻，室温放置5-10分钟；以不含BSA的样品光吸收值作为空白对照，用分光光度 计测定595nm处的吸光值，并记入读数，绘制标准曲线。样品含量测定将适量体积的样品加入到试管中，并用PBS补足到150 μ 1，再加 2. 85ml考马斯亮蓝染液，测定吸光值，计算样品中残余蛋白含量。(2)多糖含量测定方法(苯酚-硫酸法)标准曲线绘制称量50mg的葡萄糖于IOOml的容量瓶中，加水稀释到刻度，制得 0. 5mg/ml的标准溶液，分别吸取:2ml、4ml、6ml、8ml、10ml、12ml的标准溶液至50ml的容 量瓶中·加水稀释到刻度·稀释至浓度为0. 02mg/ml、0. (Mmg/ml、0. 06mg/ml、0. 08mg/ml、 0. 10mg/ml,0. 12mg/ml吸取^il以上的各浓度的标准对照品于IOml的具塞试管中，加入 5%的苯酚试液Iml，摇勻，迅速加入浓硫酸5ml，振摇2分钟，置于沸水浴中加热15分钟.取 出，冷却，加水至刻度，再冷却。5%的苯酚和浓硫酸比为1 5加入到IOml的容量瓶中加 水至刻度为对照溶液。在585nm下测定吸光度，以吸光度A为横坐标，浓度C为正坐标绘制 标准曲线。多糖含量测定取2ml溶解的多糖溶液于IOml的具塞试管中，加入5%的苯酚试 液1ml，摇勻，迅速加入浓硫酸5ml，振摇2分钟，置于沸水浴中加热15分钟，取出，冷却，加 水至刻度，再冷却，在585nm下测定吸光度，计算多糖含量。
权利要求
1.一种虫草多糖的安全提取方法，包括用水浸提冬虫夏草(Cordyc印S sinensis)，浸 提液经脱蛋白后，再用乙醇沉淀，收集沉淀干燥即得虫草多糖产品，其特征在于，所述的浸 提液脱蛋白包括以下步骤(1)在浸提液中加入氯化钙，加入的氯化钙与浸提液的质量体积比为(30 40) lg/L，并调节pH值为4 5，沉淀蛋白30 60min，去除蛋白沉淀，得到去除蛋白的 液体；(2)再在去除蛋白的液体中重复步骤(1)的操作1 2次，而最终得到脱蛋白后的液体。
2.根据权利要求1所述的虫草多糖的安全提取方法，其特征在于，所述的用水浸提冬 虫夏草是将磨碎后的冬虫夏草子实体粉末，加入其质量10 20倍的水中，在60°C下浸提8 小时，再经离心收集上清液，重复浸提3次，合并得提取液，提取液再在60°C下浓缩至提取 液原体积的1/3，得到浸提液。
3.根据权利要求2所述的虫草多糖的安全提取方法，其特征在于，所述的步骤(2)得到 脱蛋白后的液体，在用乙醇沉淀之前是将其在60°C下，浓缩至脱蛋白后的液体的原体积的 1/3，得到浓缩液。
4.根据权利要求3所述的虫草多糖的安全提取方法，其特征在于，所述的用乙醇沉淀， 收集沉淀干燥即得虫草多糖产品，包括以下步骤在浓缩液中加入浓缩液3倍体积的体积 分数为95%的乙醇水溶液，4°C静止12小时，收集沉淀，在60°C烘箱中烘干得到虫草多糖产品 O
全文摘要
本发明公开了一种虫草多糖的安全提取方法。它包括用水浸提冬虫夏草，浸提液经脱蛋白后，再用乙醇沉淀，收集沉淀干燥即得虫草多糖产品，所述的浸提液脱蛋白包括以下步骤(1)在浸提液中加入氯化钙，加入的氯化钙与浸提液的质量体积比为30～40∶1g/L，并调节pH值为4～5，沉淀蛋白30～60min，去除蛋白沉淀，得到去除蛋白的液体；(2)再在去除蛋白的液体中重复步骤(1)的操作1～2次，而最终得到脱蛋白后的液体。利用本发明的方法制备出的虫草多糖产品中的蛋白残留量为1％左右，多糖纯度为85％以上，脱蛋白效果很好，并且氯化钙价格便宜，操作方便，在室温下即可进行，且不破坏多糖的结构，适于工业化生产，制备出来的虫草多糖安全无毒，避免对食品安全造成危害。
文档编号A61P35/00GK102070726SQ20111004220
公开日2011年5月25日 申请日期2011年2月22日 优先权日2011年2月22日
发明者叶克难, 张艳, 钟建春 申请人:中山大学