专利名称：组氨酸-醋酸盐缓冲液中的抗体制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗体制剂，包括在组氨酸-醋酸盐缓冲液中配制的单克隆抗体，以及包含结合HER2的结构域II的抗体的制剂(例如，Pertuzumab)，和包含结合DR5的抗体的制剂(例如，Apomab)。
背景技术：
在过去十年中，生物技术的进步已经使得有可能利用重组DNA技术生产多种蛋白质进行药物应用。因为蛋白质比传统有机和无机药物更大和更复杂(即除了复杂的三维结构之外还具有多个官能团)，这些蛋白质的制剂形成了特殊的问题。为了使蛋白质保留生物学活性，制剂必须保持蛋白质氨基酸至少核心序列的构象完整性完好无损，同时保护蛋白质的多个官能团不受降解。蛋白质的降解途径可以包括化学不稳定性(即涉及通过键的形成或剪切修饰蛋白质的任何过程，其致成新的化学实体)或物理不稳定性(即蛋白质较高次序结构的改变)。化学不稳定性可以由脱酰胺作用，外消旋作用，水解，氧化作用，β消除或二硫化物交换产生。物理不稳定性可以例如由变性，聚集，沉淀或吸附作用产生。三种最常见的蛋白质降解途径为蛋白质聚集，脱酰胺作用和氧化作用。Cleland等人Critical Reviews in Therapeutc DrugCarrier Systems 10(4) :307-377(1993)。抗体制剂用于药物应用的蛋白质包括抗体。可用于治疗的抗体的例子为结合HER2抗原的抗体，如 Pertuzumab0美国专利号6，339，142描述了 HER2抗体组合物，包括抗HER2抗体及其一种或多种酸性变体的混合物，其中酸性变体的量少于大约25%。Trastuzumab是例示性的HER2抗体。美国专利号6，267, 958和6，685，940 (Andya等人)描述了冻干的抗体制剂，包括 HER2 和 IgE 抗体制剂。W097/04807 和 US 2004/01973^Al (Fick 等人)描述了用 IgE 抗体治疗过敏性哮喘的方法。W099/01556(LOwman等人)涉及具有倾于异构化作用的天冬酰胺 (aspartyl)残基的IgE抗体，及其改进的变体。US 2002/0045571 (Liu等人)提供了粘性降低的浓缩型蛋白质制剂，例示为人源化IgE抗体制剂，rhuMAb E25和E26。WO 02/096457 和US2004/0170623 (Arvinte等人)描述了包含抗IgE抗体E25的稳定的液体制剂。还参见涉及高浓度抗IgE制剂的US 2004/0197324A1 (Liu和Shire)。美国专利号6，171，586 (Lam等人)描述了稳定的水性抗体制剂。F(ab，)2rhuMAbCD18抗体配制在醋酸钠和组氨酸-HCl缓冲液中。rhuMAb CD18的优选制剂为IOmM醋酸钠， 8%海藻糖，0. 01% TWEEN 20 , pH 5.0。于 40°C保存一个月的 rhuMAb CD20 的醋酸盐(pH 5.0)制剂比在组氨酸中配制的那些样品(pH 5.0或6.0)显示更大的稳定性。US 2003/0190316 (Kakuta等人)涉及配制的抗体hPM-Ι，其为人源化IL-6受体抗体。单体损失在柠檬酸钠(pH 6.7)中最大，接下来为磷酸钠(pH 6.8)，Tris-HCl(pH 7. 2)，组氨酸-HCl(pH 7.2)和甘氨酸(pH 7. 6)，依次递减。评估了磷酸钠(pH 6. 5)，磷酸盐-His (pH 6. 0 或 6. 5)，His-HCl (pH 6. 5)，和磷酸钠(pH6. 0)对 hPM_l 稳定性的影响。W02004/071439 (Burke等人)指出在natalizumab (抗α 4整联蛋白人源化单克隆抗体)制剂中由聚山梨醇酯80的降解导致杂质增多，这显然是通过涉及金属离子和组氨酸的氧化反应造成的。因而，选择磷酸盐缓冲液。WO 2000/066160(英文对应文本EP 1174148A1) (Okada等人)涉及在磷酸钠或柠檬酸钠缓冲液中结合人血小板膜糖蛋白GPIIb/IIIa的纤维蛋白原受体的人源化C4G1抗体的制剂。W02004/019861 (Johnson 等人)涉及 CDP870，一种聚乙二醇化的抗 TNF α Fab 片段，其在50mM醋酸钠(pH 5. 5)和125mM氯化钠中以200mg/ml配制。W02004/004639 (Nesta, P.)涉及 huC242_DMl —种肿瘤-激活的免疫毒素在 50mM 琥珀酸缓冲液(pH 6. 0)和蔗糖(5% w/v)中的制剂。W003/039485 (Kaisheva 等人)发现 Daclizumab (人源化 IL-2 受体抗体)在琥珀酸钠缓冲液PH 6.0中具有最高的稳定性，并且在组氨酸中随着缓冲液被氧化而迅速丧失效力。WO 2004/001007涉及在组氨酸HCl，醋酸钠或柠檬酸钠缓冲液中的⑶80单克隆抗体。美国专利号6，252，055(ReltOn，J.)涉及在马来酸盐，琥珀酸盐，醋酸钠或磷酸盐缓冲液中配制的抗⑶4和抗⑶23抗体，而磷酸盐被鉴定为优选的缓冲液。美国专利号5，608，038 (Eibl等人)涉及高度浓缩的多克隆免疫球蛋白制品，其中具有免疫球蛋白，葡萄糖或蔗糖，以及氯化钠。W003/015894(Oliver等人)涉及 100mg/mLSYNAGIS ,25mM组氨酸-HCl, 1. 6mM 甘氨酸，PH 6.0，和冻干的SYNAGIS 的水性制剂，所述SYNAGIS 在配制时(冻干之前)包含25mM组氨酸，1. 6mM甘氨酸和3% w/v甘露醇pH 6. 0。US 2004/0191243A1 (Chen 等人)报道了一种人 IgG2 抗体 ABX-IL8 的制剂。US 2003/0113316A1 (Kaisheva等人)涉及一种冻干的抗IL2受体抗体制剂。HER2 抗体受体酪氨酸激酶的HER家族是细胞生长，分化和存活重要的调节剂。该受体家族包括四个不同的成员，包括表皮生长因子受体(EGFR，ErbBl，或HER1)，HER2 (ErbB2或 pl85neu)，HER3 (ErbB3)和 HER4 (ErbB4 或 tyro2)。由erbBl基因编码的EGFR与人恶性肿瘤的病因有关。具体地，在乳腺、膀胱、肺、 头、颈和胃癌以及胶质母细胞瘤中已经观察到EGFR表达的提高。EGFR受体表达提高通常与相同肿瘤细胞产生的EGFR配体，转化生长因子α (TGF-α)，增多相关联，其导致通过自分泌刺激途径激活受体。Baselga 和 Mendelsohn Pharmac. Ther. 64 :127-154(1994)。在这些恶性肿瘤的治疗中已经将抗EGFR或其配体TGF- α和EGF的单克隆抗体评估为治疗齐LU 参见，例如，Baselga and Mendelsohn.,同上；Masui 等人 Cancer Research44 1002-1007 (1984)；禾口 Wu 等人 J. Clin. Invest. 95 :1897-1905 (1995)。HER家族的第二个成员，pl85neu，最初被鉴定为来自化学处理大鼠的神经母细胞瘤的转化型基因的产物。neu原癌基因的激活形式通过所编码蛋白质的跨膜区中的点突变(缬氨酸到谷氨酸)产生。在乳房和卵巢癌中观察到neu人同系物的扩增并且与预后不良相关联(Slamon 等人，Science，235 177-182 (1987) ；Slamon 等人，Science, 244 :707-712(1989)；和美国专利号4，968，603)。到目前为止，对于人肿瘤未曾报道过与Neu原癌基因中的点突变类似的点突变。HER2的过表达(经常但并非一律由于基因扩增)在其它癌中也曾观察到，包括胃，子宫内膜，唾腺，肺，肾，结肠，甲状腺，胰腺和膀胱的癌。参见，King 等人，Science, 229 :974(1985) ；Yokota 等人，Lancet 1 :765-767(1986)； Fukushige 等人，Mol Cell Biol.，6 :955-958(1986) ；Guerin 等人，Oncogene Res.，3 21-31(1988) ；Cohen 等人，Oncogene,4 :81-88(1989) ；Yonemura 等人，Cancer Res. ,51 1034(1991) ；Borst 等人，Gynecol. Oncol. ,38 :364(1990) ；Weiner 等人，Cancer Res. ,50 421-425(1990) ；Kern 等人，Cancer Res. ,50 :5184(1990) ；Park 等人，Cancer Res. ,49 6605 (1989) ；Zhau 等人，Mol. Carcinog.，3 :254-257 (1990) ；Aasland 等人 Br. J. Cancer57 358-363(1988) ；Williams 等 Pathobiology 59 :46-52(1991)；和 McCann 等人，Cancer, 65 :88-92(1990)。HER2 可以在前列腺癌中过表达(Gu 等人Cancer Lett. 99 :185-9(1996)； Ross 等人 Hum. Pathol. 28 :827-33(1997) ；Ross 等人 Cancer 79 :2162-70(1997)；和 Sadasivan 等人 J. Urol. 150 :126-31 (1993))。已经描述过抗大鼠pl85■和人HER2蛋白质产物的抗体。Drebin和同事培育出抗大鼠neu基因产物，pl85neu的抗体。参见，例如，Drebin等人，细胞41 =695-706(1985)； Myers 等人，Meth. Enzym. 198 :277-290 (1991)；和 W094/22478。Drebin 等人 Oncogene 2 273-277(1988)报道与pl85neu两个不同区域反应的抗体的混合物带来对于移植入裸小鼠中的neu-转化NIH-3T3细胞的协同抗肿瘤效应。还参见1998年10月20日公布的美国专利 5，824，311。Hudziak等人，Mol. Cell. Biol. 9(3) :1165-1172(1989)描述了一组HER2抗体的生成，其利用人乳腺肿瘤细胞系SK-BR-3表征。在暴露于所述抗体72小时之后通过单层结晶紫染色来测定SK-BR-3细胞的相对细胞增殖。利用这种测定法，用抑制细胞增殖56%的称作4D5的抗体获得最大抑制。该组中的其它抗体在此测定法中减少细胞增殖的程度较小。 进一步发现抗体4D5使得过表达HER2的乳腺肿瘤细胞系对于TNF- α的细胞毒性效应变得敏感。还参见1997年10月14日公开的美国专利号5，677，171。在Hudziak等人中讨论的 HER2抗体在以下文献中做进一步表征。Fendly等人CancerResearch50 1550-1558 (1990)； Kotts 等人体夕卜 26(3) :59A(1990) ；Sarup 等人 Growth Regulatuon 1 :72-82(1991)； Sh 印 ard 等人 J.Clin· Immunol. 11 (3) :117-127(1991) ；Kumar 等人 Mol. Cell. Biol. 11 O) 979-986(1991) ；Lewis 等人 Cancer Immunol. Immunother. 37 :255-263(1993) ；Pietras 等人 0ncogene9 :1829-1838(1994) ；Vitetta 等人 Cancer Research54 :5301-5309(1994)； Sliwkowski 等人 J. Biol. Chem. 269 (20) :14661-14665(1994) ；Scott 等人 J.Biol. Chem. 266 14300—5(1991) ；D ‘ souza 等人 Proc. Natl. Acad. Sci. 91 :7202-7206(1994)；Lewis 等人 Cancer Research56 1457-1465(1996)；禾口 Schaefer 等人 0ncogenel5 1385-1394(1997)。鼠 HER2 抗体 4D5 的重组人源化形式(huMAb4D5_8，rhuMAb HER2, Trastuzumab 或HERCEPTIN ;美国专利号5，821，337)在临床上对于患有过表达HER2的乳癌的患者有效，所述患者先前已经接受过广泛的抗癌治疗(Baselga等人，J. Clin. Oncol. 14 737-744(1996))。1998年9月25日Trastuzumab收到食品与药物管理局的销售许可，用于治疗其肿瘤过表达HER2蛋白的患有转移性乳癌的患者。在 Tagliabue 等人 ht. J. Cancer 47 :933-937 (1991) ；McKenzie 等人 Oncogene 4 :543-548(1989) ；Maier 等人 Cancer Res. 51 :5361-5369 (1991) ；Bacus 等人 Molecular Carcinogenesis 3 :350-362(1990) ；Stancovski 等人 PNAS(USA)88 :8691-8695(1991)； Bacus 等人 Cancer Research52 :2580-2589 (1992) ；Xu 等人 Int.J.Cancer 53: 401-408(1993) ；W094/00136；Kasprzyk 等人 CancerResearch52 :277卜2776(1992)； Hancock 等人 Cancer Res. 51 :4575-4580(1991) ；Shawver 等人 Cancer Res. 54 1367-1373 (1994) ；Arteaga 等人 CancerRes. 54 :3758-3765 (1994) ；Harwerth 等人 J. Biol. Chem. 267 :15160-15167(1992)；美国专利号 5，783，186 ；和 Klapper 等人 OncogeneH 2099-2109(1997)中描述了具有各种特性的其它HER2抗体。同源性筛选已经鉴定了两种其它HER受体家族成员；HER3(美国专利号5，183，884 和 5，480，968 以及 Kraus 等人 PNAS (USA) 86 :9193-9197(1989))和 HER4(EP Pat Appln No 599，274 ；Plowman 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 :1746-1750(1993)；禾口 Plowman 等人，Nature, 366 =473-475 (1993)) 0这些受体都对于至少某些乳癌细胞系都呈现增强的表达。一般在细胞中发现HER受体的各种组合，并且异源二聚体化作用被认为增强对于多种HER配体的细胞反应的多样性(Earp等人Breast CancerResearch and Treatment 35:115-132(1995))。EGFR与六种不同的配体结合；表皮生长因子(EGF)，转化生长因子 α (TGF-α)，双调蛋白(amphiregulin)，肝素结合型表皮生长因子(HB-EGF)，beta细胞蛋白(betacellulin)和上皮调节蛋白(印iregulin) (Groenen 等人 Growth Factors 11: 235-257(1994))。缘自单基因选择性剪切的调蛋白蛋白质家族是HER3和HER4的配体。调蛋白家族包括α，β和γ调蛋白(Holmes等人，Science, 256 :1205-1210(1992)；美国专利号 5，641，869 ；和 khaefer 等人 0ncogenel5 :1385-1394(1997)) ；neu 分化因子(NDFs)， 神经胶质生长因子(GGFs)；乙酰胆碱受体诱导活性(ARIA)；和感觉与运动神经元衍生的因子(SMDF) ο 综述参见 Groenen 等人 Growth Factorsll :235-257(1994) ；Lemke,G. Molec. & Cell. Neurosci. 7 :247-262(1996)和 Lee 等人 Pharm. Rev. 47 :51-85 (1995)。最近鉴定了三种另外的HER配体；据报道结合HER3或HER4的神经调节蛋白-2 (NRG-幻(Chang等人 Nature 387509-512(1997) ；and Carraway 等人 Nature 387 :512-516(1997))；结合 HER4 的神经调节蛋白-3 (Zhang等人PNAS (USA) 94 (18) :9562-7(1997))；和结合HER4的神经调节蛋白-4 (Harari 等人 Oncogene 18 :2681-89 (1999))。HB-EGF，beta 细胞蛋白和上皮调节蛋白也结合HER4。尽管EGF和TGF α并不结合HER2，EGF刺激EGFR和HER2形成异源二聚体，其激活 EGFR并导致HER2在异源二聚体中的转磷酸作用。二聚体化作用和/或转磷酸作用似乎激活HER2酪氨酸激酶。参见Earp等人，同上。同样地，当HER3与HER2共表达时，形成活性信号复合物并且抗HER2抗体能够破坏这种复合物(Sliwkowski等人，J. Biol. Chem. ,269(20) 14661-14665(1994))。此外，当与HER2共表达时，HER3对调蛋白(HRG)的亲和性提高到较高的亲和性状态。关于HER2-HER3蛋白复合物还参见，Levi等人，JournalofNeuroscience 15 :1329-1340(1995) ；Morrissey 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1431-1435(1995)； 和 Lewis 等人，CancerRes. ,56 :1457-1465 (1996)。HER4，像 HER3 —样，与 HER2 形成活性信号复合物(Carraway 和 Cantley, Cell 78 :5-8(1994))。为了靶向HER信号途径，将rhuMAb 2C4 (Pertuzumab，0MNITARG )开发为人源化抗体，其抑制HER2与其它HER受体的二聚体化作用，由此抑制配体驱动的磷酸化作用和激活作用，以及RAS和AKT途径的下游激活作用。在Pertuzumab作为治疗实体肿瘤的单一药剂的I期试验中，用Pertuzumab治疗三名患有晚期卵巢癌的受试者。一名患者有持续的部分反应，而其它受试者病情稳定持续15周，Agus等人ftOcAmSoc Clin 0ncol22 :192， Abstract 771(2003) DR5 抗体本领域已经鉴定了属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族的各种配体和受体。这些配体包括肿瘤坏死因子-α ( “ TNF-α ”)，肿瘤坏死因子-β ( “ TNF-β ”或“淋巴毒素-α ”)，淋巴毒素-β ( “LT- β ”)，CD30 配体，CD27 配体，CD40 配体，0Χ-40 配体，4-1ΒΒ 配体，LIGHT, Apo-I配体(也称作Fas配体或CD95配体)，Apo-2配体(也称作Apo2L或TRAIL)，Apo-3 配体(也称作TTOAK) ,APRIL, OPG配体(也称作RANK配体，0DF，或TRANCE)，和TALL-I (也称作 BlyS, BAFF 或 THANK)(参见，例如，Ashkenazi, Nature Review, 2 :420-430(2002)； Ashkenazi and Dixit, Science,281 1305-1308 (1998) ；Ashkenazi and Dixit, Curr. Opin.Cell Biol.，11 :255-260(2000) ；Golstein, Curr. 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Cell，4 :563-571(1999) ；Cha 等人，Immunity, 11 :253-261(1999)； Mongkolsapaya 等人，Nature Structural Biology,6 1048(1999) ；Hymowitζ 等人’ Biochemistry, 39 :633-644 (2000))。不过，Apo2L/TRAIL，不像其它 TNF 家族成员，被发现具有独特的结构特征，其中三个半胱氨酸残基(同源三聚体每个亚基的位置230上)一起与锌原子配位，并且锌结合对于三聚体稳定性和生物学活性是重要的(Hymowitz等人，同上； Bodmer 等人，J. Biol. Chem.，275 :20632-20637 (2000))。在文献中已经报道Apo2L/TRAIL可以在免疫系统调节中发挥作用，包括在自身免疫疾病如风湿性关节炎中(参见，例如，Thomas等人，J. Immunol.，161 =2195-2200(1998)； Johnsen 等人，细胞因子，11 :664-672 (1999) ;Griffith 等人，J. Exp. Med.，189 1343-1353(1999) ；Song 等人，J. Exp. Med.，191 1095-1103 (2000))。已经报道Apo2L/TRAIL的可溶形式在许多癌细胞中诱导凋亡，包括结肠，肺，乳房，前列腺，膀胱，肾，卵巢和脑的肿瘤，以及黑素瘤，白血病，和多发性骨髓瘤(参见，例如， Wiley等人，同上；Pitti等人，同上；公开于2000年2月四日的美国专利6，030, 945 ；公开于2004年6月 8 日的美国专利6，746，668 ；Rieger等人，FEBSLetters，427 :124-128(1998)； Ashkenazi 等人，J.Clin· Invest.，104 :155-162(1999) ；Walczak 等人，Nature Med.， 5 :157-163(1999) ；Keane 等人，Cancer Research,59 :734-741(1999) ；Mizutani 等人， Clin. Cancer Res.，5 :2605-2612(1999) ；Gazitt，Leukemid，13 1817-1824(1999) ；Yu 等人，Cancer Res. ,60 :2384-2389(2000) ；Chinnaiyan 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. ,97 17M-1759(2000))。鼠肿瘤模型的体内研究进一步提示Apo2L/TRAIL，单独或结合化疗或放疗，能够发挥基本的抗肿瘤作用(参见，例如，Ashkenazi等人，同上；Walzcak等人， 同上；Gliniak 等人，Cancer Res. ,59 :6153-6158(999) ；Chinnaiyan 等人，同上；Roth 等人，Biochem. Biophys. Res. Comm.，265 :1999(1999) ；PCT 申请 US/00/15512 ；PCT 申请 US/01/23691)。与许多类型的癌细胞相反，大多数正常的人细胞类型似乎通过某种重组形式的Apo2L/TRAIL耐受凋亡诱导(Ashkenazi等人，同上；Walzcak等人，同上)。Jo等人报道多组氨酸标记的可溶形式的Apo2L/TRAIL在诱导正常分离的人肝细胞的体外凋亡，但不能诱导非人肝细胞的凋亡(Jo等人，Nature Med.，6 =564-567(2000)；还参见，Nagata,Nature Med.，6 =502-503 (2000)) 据信某些重组Apo2L/TRAIL制品对于患病和正常细胞的生化特性和生物学活性可以有所不同，这取决于，例如，标记分子的存在或缺失，锌含量， 禾口三聚体百分比含量(参见，Lawrence 等人，Nature Med.，Letter to the Editor, 7 383-385(2001) ；Qin 等人，Nature Med. , Letter to the Editor，7 :385-386 UOOl))。已经发现Apo2L/TRAIL结合至少五种不同的受体。结合Apo2L/TRAIL的受体中至少两种包含功能性细胞质死亡结构域。一种这类受体称作“DR4” (和/或称作TR4 或 TRAIL-R1) (Pan 等人，Science, 276 :111-113(1997)；还参见公开于 1998 年 7 月 30 日的W098/3^56 ；公开于1999年7月四日的W099/37684 ；公开于2000年12月7日的 WO 00/73349 ；公开于2002年8月13日的US 6，433，147 ；公开于2002年10月8日的US 6，461，823，和公开于 2002 年 1 月 29 日的 US 6，342，383)。Apo2L/TRAIL的另一种这类受体称作DR5 (或者它还称作Apo_2 ；TRAIL-R或 TRAIL-R2, TR6, Tango-63，hAP08, TRICK2 或 KILLER)(参见，例如，Sheridan 等人，Science, 277 :818-821 (1997)，Pan 等人，Science, 277 :815-818 (1997)，公开于 1998 年 11 月 19 日的 W098/51793 ；公开于 1998 年 9 月 24 日的 W098/41629 ；Screaton 等人，Curr. Biol.，7 693-696(1997) ；Walczak 等人，EMBO J.，16 :5386-5387 (1997) ；Wu 等人，Nature Genetics, 17 141-143 (1997)；公开于 1998 年 8 月 20 日的 W098/35986 ；公开于 1998 年 10 月 14 日的EP870, 827 ；公开于1998年10月22日的W098/46643 ；公开于1999年1月21日的W099/(^653 ；公开于1999年1月25日的W099/09165 ；公开于1999年3月11日的 W099/11791 ；公开于2002年8月13日的US 2002/0072091 ；公开于2001年12月7日的 US 2002/0098550 ；公开于2001年12月6日的US 6，313，269 ；公开于2001年8月2日的 US2001/0010924 ；公开于 2003 年 7 月 3 日的 US 2003/01255540 ；公开于 2002 年 10 月 31 日的US 2002/0160446,公开于2002年4月25日的US2002/004878 ；公开于2002年2月的US 6，342，369 ；公开于2003年5月27日的US 6，569，642，公开于2000年6月6日的 US 6，072, 047，公开于2003年11月4日的US 6，642，358 ；公开于2004年6月1日的IS 6，743，625)。像DR4 —样，据报道DR5包含细胞质死亡结构域并且能够在配体结合后发出凋亡信号(或经与分子相结合，所述分子如激动剂抗体，其模仿配体的活性)。在Apo-2L/ TRAIL和DR5之间形成的复合物的晶体结构描述于Hymowitz等人，Molecular Cell,4 563-571(1999)中。在配体结合后，DR4和DR5都能够通过称作FADD/Mortl的包含死亡结构域的接头分子，独立地通过募集和激活凋亡起始因子胱天蛋白酶-8而促进凋亡(Kischkel等人， Immunity, 12 :611-620(2000) ；Sprick 等人，Immunity, 12 :599-609 (2000) ；Bodmer 等人， Nature CellBiol. ，2 :241-243(2000)) 据报道Apo2L/TRAIL也结合称作DcRl，DcR2和OPG的那些受体，据信它们充当抑制剂，而非信号传导剂(参见，例如，DcRl (也称作TRID，LIT或TRAIL-R3) (Pan 等人，Science, 276 :111-113(1997) ；Sheridan 等人，Science，277 :818-821 (1997)； McFarlane 等人，J. Biol. Chem.，272 :25417-25420(1997) ；Schneider 等人，FEBS Letters, 416:329-334(1997) ；Degli-Esposti 等人，J. Exp. Med.，186 1165-1170 (1997)；和 Mongkolsapaya 等人，J. Immunol.，160 :3-6(1998)) ；DcR2(也称作 TRUNDD 或 TRAIL-R4) (Marsters 等人，Curr. Biol.，7 1003-1006 (1997) ;Pan 等人，FEBS Letters, 424 41-45(1998) ；Degli-Esposti 等人，Immunity，7 :813-820 (1997))，和 0PG。与 DR4 和 DR5 相反，DcRl和DcR2受体并不发出凋亡信号。在文献中已经报道了某些结合DR4和/或DR5受体的抗体。例如，在某些哺乳动物细胞中针对DR4受体并且具有激动性或凋亡性活性的抗DR4抗体在，例如，公开于1999 年7月四日的WO 99/37684 ；公开于2000年7月12日的WO 00/73349 ；公开于2003年 8月14日的WO 03/066661中进行了描述。还参见，例如，Griffith等人，J. Immunol., 162 :2597-2605(1999) ；Chuntharapai 等人，J. Immunol.，166 :4891-4898(2001)；公开于 2002年12月2日的WO 02/097033 ；公开于2003年5月22日的WO 03/042367 ；公开于 2003年5月8日的WO 03/038043 ；公开于2003年5月8日的W003/037913。同样地描述了某些抗DR5抗体，参见，例如，公开于1998年11月8日的WO 98/51793 ；Griffith等人，J. Immunol.，162 :2597-2605(1999) ；Ichikawa 等人，Nature Med.，7 :954-960(2001)； Hylander 等人，“An Antibodyto DR5(TRAIL-receptor 2)Suppresses the Growth of Patient DerivedGastrointestinal Tumors Grown in SCID Mouse，，，Abstract, 2d InternationalCongress on Monoclonal Antibody in Cancers, Aug. 29-Sept. 1,2002, Banff, Alberta, Canada ；公开于 2003 年 5 月 8 日的 WO 03/038043 ；公开于 2003 年 5 月 8 日的WO 03/037913。此外，已经描述了具有对DR4和DR5受体都有交叉反应性的某些抗体 (参见，例如，公开于2001年6月26日的美国专利6，252,050)。发明概述本发明这里部分涉及，将组氨酸-醋酸盐(histine-acetate)，pH 5. 5-6. 5，鉴定为特别有用的缓冲液，其用于配制单克隆抗体，特别是易于脱酰胺作用(deamidation)和/ 或聚集(aggregation)的全长IgGl抗体。该制剂阻止其中抗体产品的降解。因而，在第一方面，本发明涉及一种稳定的药物制剂，其包括在组氨酸-醋酸盐缓冲液pH 5. 5-6. 5中的单克隆抗体。所述单克隆抗体优选地结合选自HER2，CD20，DR5，BR3， IgE和VEGF的抗原。此外，本发明涉及治疗受试者疾病或病症的方法，包括向受试者施用有效量的所述制剂以治疗所述疾病或病症。在另一方面，本发明涉及一种药物制剂，其包括(a)易于发生脱酰胺作用或聚集的全长IgGl抗体，其量为从大约lOmg/mL到大约250mg/mL ； (b)组氨酸-醋酸盐缓冲液 (histine-acetate buffer)，pH 5. 5-6. 5 ； (c)选自海藻糖和蔗糖的糖，其量从大约6OmM到大约250mM ；和(d)聚山梨醇酯20，其量为从大约0. 01%到大约0. 1%。本发明还提供降低治疗性单克隆抗体的脱酰胺作用或聚集作用的方法，包括在组氨酸-醋酸盐缓冲液，PH 5. 5-6. 5中配制所述抗体。在又一方面，本发明涉及包含抗体，糖和表面活性剂的药物制剂，所述抗体在pH 从大约5. 5到大约6. 5的组氨酸缓冲液中结合HER2的结构域II。本发明还涉及一种药物制剂，其包含从大约20mg/mL到大约40mg/mL的量的 Pertuzumab,组氨酸-醋酸盐缓冲液，蔗糖，和聚山梨醇酯20，其中所述制剂的pH为大约 5. 5到大约6. 5。本发明还涉及一种药物制剂，其包含在pH从大约5. 5到大约6. 5的组氨酸缓冲液中的DR5抗体，糖，和表面活性剂。
在另一方面，本发明涉及一种药物制剂，其包含从大约lOmg/mL到大约30mg/mL的量的Apomab，组氨酸-醋酸盐缓冲液，海藻糖，和聚山梨醇酯20，其中所述制剂的pH为大约 5. 5到大约6. 5。在又一方面，本发明提供一种治疗受试者中癌症的方法，包括向受试者施用有效量的药物制剂以治疗癌症。本发明还涉及带有可以通过注射器刺穿的塞子的小瓶或不锈钢罐，所述小瓶或罐中包含可选为冻干形式的所述制剂。另外，本发明提供制备药物制剂的方法，包括(a)制备单克隆抗体制剂；和(b)评估制剂中单克隆抗体的物理稳定性，化学稳定性，或生物学活性。附图简述
图1描绘了 HER2的细胞外结构域的结构域I_IV(分别为SEQ IDNos. 19-22)。图2A和2B描绘了以下氨基酸序列的比对鼠单克隆抗体2C4可变轻(\)(图2A) 和可变重(Vh)(图2B)链结构域(分别为SEQ ID Nos. 1和2)；人源化2C4版本574的\ 和Vh结构域(分别为SEQ ID Nos. 3和4)，以及人\和Vh共有框架(hum κ 1，轻kappa亚基I ；humlll，重亚基III)(分别为SEQID Nos. 5和6)。星号标识在人源化2C4版本574和鼠单克隆抗体2C4之间或在人源化2C4版本574和人框架之间的区别。互补决定区(CDRs) 在括号中。图3A和;3B显示Pertuzumab轻链和重链的氨基酸序列(分别为SEQ IDNos. 15和 16)。CDR以粗体显示。计算的轻链和重链的分子量为23，526. 22Da和49，216. 56Da(还原形式的半胱氨酸)。糖部分附着于重链的Asn 299上。图4A和4B显示Pertuzumab轻和重链的氨基酸序列，每个都包括完整的氨基末端信号肽序列(分别为SEQ ID Nos. 17和18)。图5图示了 2C4在HER2的异源二聚体结合位点上的结合，由此阻止与活化的EGFR 或HER3的异源二聚体化作用。图6描绘了 HER2/HER3与MAI3K和Akt途径的偶联。图 7 比较了 Trastuzumab 禾口 Pertuzumab 的活性。图8通过离子交换(IEX)分析显示了 Pertuzumab制剂的稳定性。图9通过大小排阻层析(SEC)分析显示了 Pertuzumab制剂的稳定性。图10反映了 Pertuzumab在不同的制剂中的物理稳定性。图11来自Pertuzumab液体制剂的搅动研究(agitation study)。图12来自Pertuzumab液体制剂的其它搅动研究。图13来自Pertuzumab制剂的冻-融研究。图 14A 禾口 14B 显示 Trastuzumab 轻链(SEQ ID No. 13)和重链(SEQ ID No. 14)的
氨基酸序列。图15A和15B描绘了变体Pertuzumab轻链序列(SEQ ID No. 23)和变体 Pertuzumab 重链序列(SEQ ID No. 24)。图16A和16B显示了在IgG抗体中普遍观察到的寡糖结构。图17A和17B显示了特异性抗IgE抗体E25，E26，HAE1和Hu-901折轻和重链的序列(SEQ ID Nos. 37-44)。在图17A中，可变轻链结构域在残基111的残基VEIK结束。在图17B中，可变重链结构域在残基120附近的残基VTVSS结束。图 18A 是比较鼠 2H7 (SEQ ID No. 25)，人源化 2H7vl6 变体(SEQ ID No. 26)，和人 kappa轻链亚基I (SEQ ID No. 27)中每一种的可变轻结构域(V)的氨基酸序列的序列比对。 2H7 和 hu2H7vl6 的 \ 的 CDR 如下CDR1 (SEQID No. 57)，CDR2 (SEQ ID No. 58)，和 CDR3 (SEQ ID No.59)。图 18B 是比较鼠 2H7 (SEQ ID No. 28)，人源化 2H7vl6 变体(SEQ ID No. 29)，和重链亚基III的人共同序列(SEQ ID No. 30)的可变重结构域(Vh)的氨基酸序列的序列比对。 2H7 和 hu2H7vl6 的 Vh 的 CDR 如下:CDR1 (SEQ IDNo. 60)，CDR2 (SEQ ID No. 61)，禾口 CDR3 (SEQ ID No.62)。在图18A和图18B中，每条链中的⑶Rl，⑶R2和⑶R3都包括在括号中，侧翼为框架区，表示为FR1-FR4。2H7指鼠2H7抗体。在序列两行之间的星号表示在两条序列之间不同的位置° 残基根据 Kabat 等人 Sequences ofImmunologicallnterest, 5th Ed. Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md. (1991) Ι ， 入11 ^ a, b, c, d,禾口 e。图19描绘了三种不同的VEGF抗体的可变结构域序列，其分别为SEQID Nos.31-36。图20显示下列Apomab样品的大小排阻层析(SEC)洗脱曲线(a)对照和制剂，其在(b)pH 4.0，(c)pH 5.0, (d)pH 6. 0和(e)pH 7. 0的条件制备。在分析前将制备的样品保存于40°C 2个月。图21描绘了保存过程中Apomab抗体单体损失的pH速率曲线。在保存过程中于 30°C和40°C监测SEC的单体动力学，并计算一级速率常数。图22提供Apomab样品的离子交换层析(IEC)洗脱曲线如下(a)对照和制剂，其在(b)pH 4. 0，(c)pH 5. 0，(d)pH 6. 0和(e)pH 7. 0的条件制备。在分析之前将配制的样品保存于40°C 2个月。图23显示在保存期间IEC主峰损失的pH速率曲线。在保存过程中于30°C和40°C 监测IEC的主峰动力学，并计算一级速率常数。图M显示人Apo-2配体cDNA的核苷酸序列(SEQ ID No. 45)及其衍生的氨基酸序列(SEQ ID No. 46)。核苷酸位置447上的“N” (在SEQ ID No. 45中)用来表示核苷酸碱基可以是“T”或“G”。图25A和25B显示于1998年11月19日在WO 98/51793中公开的人DR5受体(SEQ ID No. 47)的411个氨基酸序列，以及编码核苷酸序列(SEQ IDNo. 48) 0图26A和26B显示人DR5受体的440个氨基酸序列以及编码核苷酸序列(SEQ ID No. 50)，其也于1998年8月20日在WO 98/35986中公开。图27显示Apomab 7. 3重链氨基酸序列(SEQ ID No. 51)。图28显示Apomab 7. 3轻链氨基酸序列(SEQ ID No. 52)。图 29 显示 16E2 重链(SEQ ID No. 53)和 Apomab 7. 3 重链(SEQ ID No. 51)氨基酸序列的比对。图 30 显示 16E2 轻链(SEQ ID No. 54)和 Apomab 7. 3 轻链(SEQ ID No. 52)氨基酸序列的比对。
图3IA和3IB描绘了 Apomab 7. 3的可变重链氨基酸序列(图31A ； SEQID No. 55) 和可变轻链氨基酸序列(图31B ；SEQ ID No. 56)。⑶R残基以粗体标识。图32显示成熟2H7vl6和2H7v511轻链(分别为SEQ ID Nos. 63和64)的比对。 用Kabat可变结构域残基编号方法和Eu恒定结构域残基编号方法显示序列。图33显示成熟2H7vl6和2H7v511重链(分别为SEQ ID Nos. 65和66)的比对。 用Kabat可变结构域残基编号方法和Eu恒定结构域残基编号方法显示序列。优选实施方案详述I.定义术语“药物制剂”指一种制备物，其形式允许活性成分的生物学活性有效，并且其不包含其它组分，所述其它组分对于将对其施用该制剂的受试者来说具有不可接受的毒性。这些制剂是无菌的。“无菌(sterile) ”制剂是经灭菌的(aseptic)或不含所有活体微生物及其孢子。在这里，“冷冻”制剂是在0°C以下温度的制剂。一般来说，冷冻制剂不是冻干的， 它在之前或之后也未进行冻干。优选地，冷冻制剂包含进行保存的冷冻药物物质(在不锈钢罐中)或冷冻药物产品(在最终的药瓶配置中)。“稳定的”制剂是这样的制剂，其中的蛋白质在保存后基本上保持其物理稳定性和 /或化学稳定性和/或生物学活性。优选地，该制剂在保存后基本上保持其物理和化学稳定性，以及其生物学活性。一般基于希望的制剂保质期来选择贮存期。用来测量蛋白质稳定性的各种分析技术是本领域已有的并且在例如P印tide and Protein Drug Delivery, 247-301，Vincent Lee Ed.，MarcelDekker, Inc.，New York, New York, Pubs. (1991)禾口 Jones, A. Adv. Drug DeliveryRev. 10 =29-90(1993)中进行了综述。可以在选定的温度下测量稳定性持续选定的时间。优选地，所述制剂在大约40°C稳定至少大约2-4周，和/或在大约5°C和/或15°C稳定至少3个月，和/或在大约-20°C稳定至少3个月或至少1年。 另外，所述制剂优选在制剂的冷冻(至，例如，-70 0C )和融解后是稳定的，例如在1，2或3 个循环的冻融之后。稳定性能够以许多不同的方式进行定性和/或定量地评估，包括评估聚集物形成(例如利用大小排阻层析，通过测量浊度，和/或通过肉眼观察)；通过利用阳离子交换层析或毛细管分区电泳评估电荷异质性；氨基末端或羧基末端序列分析；质谱分析；SDS-PAGE分析以比较减小的和完整的抗体；肽图谱(例如胰蛋白酶或LYS-C)分析；评估生物学活性或抗体的抗原结合功能；等等。不稳定性可以包括下列的任一种或多种聚集，脱酰胺作用(例如Asn脱酰胺作用)，氧化作用(例如Met氧化作用)，异构化作用(例如Asp异构化作用)，剪切/水解/片段化(例如铰链区片段化)，琥珀酰亚胺形成，未配对的半胱氨酸，N-末端延伸，C-末端加工，糖基化作用差异，等等。本文的“脱酰胺”单克隆抗体是这样一种抗体，其中它的一个或多个天门冬酰胺残基已经被衍生成，例如，天冬氨酸或异-天冬氨酸。“易于脱酰胺作用”的抗体是这样一种抗体，其包括一个或多个被发现易于发生脱
酰胺基的残基。“易于聚集”的抗体是这样一种抗体，其已经被发现与其它抗体分子一起聚集，特别是在冷冻和/或搅动之后。“易于片段化”的抗体是这样一种抗体，其已经被发现剪切成两个或多个片段，例如在其铰链区。“减弱脱酰胺作用，聚集，或片段化”意欲相对于在不同的PH或在不同的缓冲液中配制的单克隆抗体来防止或减少脱酰胺作用，聚集，或片段化的量。在这里，单克隆抗体的“生物学活性”指该抗体结合抗原并导致可测量生物学反应的能力，所述生物学反应可以在体外或体内进行测量。这种活性可以是拮抗性的(例如当所述抗体为HER2抗体时)或激动性的(例如当所述抗体结合DR5时)。对于Pertuzumab 而言，在一个实施方案中，生物学活性指配制的抗体抑制人乳癌细胞系MDA-MB-175-VII增殖的能力。当所述抗体为Apomab时，生物学活性可以指，例如，配制的抗体杀伤结肠癌， Colo205细胞的能力。“等渗的”意指目标制剂具有与人血液基本上相同的渗透压。等渗制剂一般将具有从大约250到350m0sm的渗透压。等渗性可以利用例如蒸气压或冰冻型渗压计进行测量。如本文所用的，“缓冲液”指通过其酸-碱共轭组分的作用而耐受pH变化的缓冲溶液。本发明的缓冲液优选具有的PH从大约5. 0到大约7. 0，优选从大约5. 5到大约6. 5，例如从大约5. 8到大约6. 2，最优选具有大约6. 0的pH。将控制pH在此范围中的缓冲液的例子包括醋酸盐，琥珀酸盐，琥珀酸盐，葡萄糖酸盐，组氨酸，柠檬酸盐，甘氨酰甘氨酸和其它有机酸缓冲液。本文的优选缓冲液是组氨酸缓冲液。“组氨酸缓冲液”是包括组氨酸离子的缓冲液。组氨酸缓冲液的实例包括组氨酸氯化物，组氨酸醋酸盐，组氨酸磷酸盐，组氨酸硫酸盐。发现在本文实施例中鉴定的优选组氨酸缓冲液是组氨酸醋酸盐。在优选的实施方案中，通过用醋酸(液体)滴定L-组氨酸(游离碱，固体)来制备组氨酸醋酸盐缓冲液。优选地，组氨酸缓冲液或组氨酸-醋酸盐缓冲液为 pH 5. 5-6. 5，优选地 pH 5. 8-6. 2。本文的“糖”包含常规组合物(CH2O)n及其衍生物，包括单糖，二糖，三糖，多糖，糖醇，还原性糖，非还原性糖等等。本文的糖的实例包括葡萄糖，蔗糖，海藻糖(trehalose)， 乳糖，果糖，麦芽糖，右旋糖苷，甘油，右旋糖苷，赤藻糖醇，丙三醇，阿拉伯糖醇，sylitol， 山梨糖醇，甘露醇，密里二糖(mellibiose)，松三糖(melezitose)，蜜三糖(raffinose)， 甘露三糖(marmotriose)，水苏糖(stachyose)，麦芽糖，乳果糖(lactulose)，麦芽酮糖 (maltulose)，山梨醇(glucitol)，麦芽糖醇，乳糖醇，异-麦芽酮糖(maltulose)，等等。本文优选的糖是非还原性二糖，如海藻糖或蔗糖。在本文中，“表面活性剂”指表面活性制剂，优选非离子性表面活性剂。本文的表面活性剂的实例包括聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20和，聚山梨醇酯80)；聚羟亚烃 (poloxamer)(例如聚羟亚烃188) ；Triton ；十二烷基磺酸钠(SDQ ；月桂基磺酸钠；辛基糖甙钠；月桂基_、肉豆蔻基_、亚油基_、或硬脂基-磺基甜菜碱；月桂基_、肉豆蔻基_、亚油基_、或硬脂基-肌氨酸；亚油基_、肉豆蔻基_、或鲸蜡基-甜菜碱；月桂酰胺基丙基_、柯卡酰胺基丙基_、亚油酰胺基丙基_、肉豆蔻酰胺基丙基_、棕榈酰胺基丙基_、或异硬脂酰胺基丙基-甜菜碱(如月桂酰胺基丙基)；肉豆蔻酰胺基丙基_、棕榈酰胺基丙基_、或异硬脂酰胺基丙基-二甲基胺；甲基可可酰基钠或甲基油基牛磺酸钠；以及M0NAQUAT 系列(Mona Industries, Inc.，Paterson，New Jersey)；聚乙二醇，聚丙二醇，和乙烯与丙烯二醇的共聚物(例如PluroniCS，PF68等)；等等。本文优选的表面活性剂是聚山梨醇酯20。"HER受体”是受体蛋白质酪氨酸激酶，它属于HER受体家族，包括EGFR，HER2，HER3和HER4受体以及将来鉴定的此家族的其它成员。HER受体一般将包含细胞外结构域，它可以结合HER配体；亲脂性跨膜结构域；保守性细胞内酪氨酸激酶结构域；和具有几个酪氨酸残基的羧基末端信号结构域，它可以进行磷酸化。优选地HER受体是天然序列人HER受体。HER2的细胞外结构域包含四个域，结构域I (氨基酸残基从大约1_195)，结构域II (氨基酸残基从大约196-320)，结构域III (氨基酸残基从大约321-488)，和结构域IV(氨基酸残基从大约489-63 (没有信号肽的残基编号)。参见Garrett等人Mol. Cell. . 11 :495-505^003)，Cho 等人 Nature 421 :756_76(K2003)，Franklin 等人癌细胞 5 317-328 (2004)，或 Plowman 等人 Proc. Natl. Acad. Sci. 90 1746-1750 (1993)。还参见本文的图1。术语“ErbBl”，"HER1 “，“表皮生长因子受体”和“EGFR”在本文中可以相互交换使用，并且如例如在Carpenter等人Ann. Rev. Biochem. 56 :881-914(1987)中公开的，称作 EGFR，包括其自然发生的突变形式(例如Humphrey等人PNAS (USA) 87 :4207-4211(1990)中的删除突变体EGFR)。erbBl指编码EGFR蛋白质产物的基因。表述方式“ErbB2”和“HER2”在本文中可以相互交换使用，并且称作人HER2蛋白质，例如，在 kmba 等人，PNAS (USA) 82 :6497-6501 (1985)和 Yamamoto 等人 Nature 319 230-234(1986) (Genebank编号X03363)中所述。术语“erbB2”指编码人ErbB2的基因而 “neu”指编码大鼠pl85neu的基因。优选的HER2是天然序列人HER2。“ErbB3” 和 “HER3” 指例如，在美国专利号 5，183，884 禾口 5, 480, 968 以及 Kraus 等人PNAS (USA) 86 :9193-9197(1989)中所公开的受体多肽。本文的术语“ErbB4”和“HER4”指例如在欧洲专利申请号599，274 ；Plowman 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 1746-1750 (1993)；和 Plowman 等人，Nature， 366 :473-475(1993)中公开的受体多肽，包括其异构体，例如，在公开于1999-04-22的 W099/19488中所披露的。“ HER配体”意指结合和/或激活HER受体的多肽。本文中具体的目标HER 配体是天然序列人HER配体如表皮生长因子(EGF) (Mvage等人，J. Biol. Chem. 247 7612-7621 (1972))；转化生长因子 α (TGF- α ) (Marquardt 等人，Science 223 1079-1082(1984))；双调蛋白也称作雪旺细胞瘤(sctiwanoma)或角化细胞自分泌生长因子 (Shoyab 等人 kience 243:1074-1076(1989) ；Kimura 等人 Nature 348:257-260(1990)； 和 Cook 等人 Mol. Cell. Biol. 11 :2547-2557(1991)) ； β 纤维素(Shing 等人，Science 259 1604-1607(1993)；和 Sasada 等人 Biochem. Biophys. Res. Commun. 190 :1173(1993))；肝素结合型表皮生长因子(HB-EGF) (Higashiyama 等人，Science 251 :936-939(1991))；上皮调节蛋白(印 iregulin) CToyoda 等人，J. Biol. Chem. 270 :7495-7500 (1995)；和 Komurasaki 等人Oncogene 15:2841-2848(1997))；调蛋白(参见下文)；神经调节蛋白-2 (NRG-2) (Carraway 等人，Nature 387 :512-516(1997))；神经调节蛋白-3 (NRG-3) (Zhang 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. 94 :9562-9567(1997))；神经调节蛋白 _4(NRG_4) (Harari 等人 Oncogene 18 :2681-89(1999))或 cripto (CR-I)(Kannan 等人 J. Biol. Chem. 272(6) 3330-3335 (1997))。结合 EGFR 的 HER 配体包括 EGF，TGF- α，双调蛋白，β 纤维素，HB-EGF 和上皮调节蛋白。结合HER3的HER配体包括调蛋白。能够结合HER4的HER配体包括β 纤维素，上皮调节蛋白，HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4和调蛋白。
当用在本文中时“调蛋白”(HRG)指由在美国专利号5，641，869或Marchionni 等人，Nature, 362 :312-318(1993)中公开的调蛋白基因产物所编码的多肽。调蛋白的实例包括调蛋白-α，调蛋白-β 1，调蛋白-β 2和调蛋白-i3 3(HolmeS等人，Science, 256 1205-1210(1992)；和美国专利号 5，641，869) ；neu 分化因子(NDF) (Peles 等人细胞 69 205-216(1992))；乙酰胆碱受体诱导活性(ARIA) (Falls 等人.Cell72 :801-815 (1993))；] 神经胶质生长因子(GGFs) (Marchionni 等人，Nature, 362 :312-318(1993))；感觉和运动神经元衍生因子(SMDF) (Ho 等人 J.Biol. Chem. 270 :14523-14532(1995)) ； γ-调蛋白 Gchaefer等人Oncogene 15 :1385-1394 (1997))。该术语包括天然序列HRG多肽的生物学活性片段和/或氨基酸序列变体，如其EGF样结构域片段(例如HRG β 1177_244)。本文的“HER 二聚体”是非共价结合的二聚体，包括至少两种不同的HER受体。当表达两种或多种HER受体的细胞暴露于HER配体时可以形成这种复合物，并且可以通过免疫沉淀进行分离并通过SDS-PAGE进行分析，如例如Sliwkowski等人，J. Biol. Chem.， 269(20) :14661-14665(1994)所述。这些 HER 二聚体的实例包括 EGFR-HER2，HER2-HER3 和 HER3-HER4异二聚体。另外，HER 二聚体可以包含两个或多个结合不同HER受体，如HER3， HER4或EGFR的HER2受体。其它蛋白质，如细胞因子受体亚基(例如gpl30)可以与二聚体相结合。HER2上的“异二聚体结合位点”，指HER2的细胞外结构域中的区域，在形成二聚体后，它与EGFR，HER3或HER4细胞外结构域中的区域相接触，或相接触。在HER2的结构域II 中发现该区。Franklin 等人 Cancer Cell5 :317-328(2004) "HER激活”或“HER2激活”指任何一个或多个HER受体，或HER2受体的激活，或磷酸化作用。一般来说，HER激活导致信号转导(例如由HER受体的细胞内激酶结构域引发的信号转导，所述结构域磷酸化HER受体或底物多肽中的酪氨酸残基)。HER激活可以通过 HER配体与包括目标HER受体的HER 二聚体的结合来介导。HER配体结合HER 二聚体可以激活二聚体中一个或多个HER受体的激酶结构域并由此导致一个或多个HER受体中酪氨酸残基的磷酸化作用，和/或其它底物多肽中酪氨酸残基的磷酸化作用，如Akt或MAPK细胞内激酶。以最宽泛的意义使用本文的术语“抗体”，具体包括全长单克隆抗体，多克隆抗体， 由至少两个全长抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)，和抗体片段，只要它们展示所需的生物学活性。本文中所用的术语“单克隆抗体”指从实质上均一的抗体群获得的抗体，即包含该群体的单个抗体除了可能在单克隆抗体生产过程中发生的变体以外都相同和/或结合相同的表位，这些变体一般以小量存在。与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品相反，每种单克隆抗体都针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性之外， 其优势还在于它们未被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆的”指抗体获自实质上均一的抗体群的特征，不应理解为限定由任何特定方法产生抗体。例如根据本发明使用的单克隆抗体可以通过由Kohler等，自然，256 =495(1975)首次描述的杂交瘤方法来制备，或可以通过重组DNA法(如美国专利4，816，567)来制备。“单克隆抗体”还可以用Clackson等， 自然，352 =624-628(1991)和Marks等，分子生物学杂志，222 :581-597(1991)所述技术从噬菌体抗体库中分离。
本文中单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分等同于或同源于源自特定物种的抗体或属于特定抗体类或亚类的抗体的相应序列，而链的其余部分等同于或同源于来自另一种物种的抗体或属于另一抗体类或亚类的抗体的相应序列条件是它们展示所需生物学活性(见美国专利4，816，567 ；Morrison等，美国国家科学院学报，81 :6851-6855(1984))。本文的目标嵌合抗体包括“灵长类化(primatized) ” 抗体，其包含源于非人灵长类可变结构域抗原结合序列(例如Old World Monkey，猿等)和人恒定区序列。抗体片段”包括全长抗体的一部分，优选包括其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括？油斤油，斤(油，)2，和Fv片段；二价抗体；线性化抗体；单链抗体分子；和由抗体片段构成的多特异性抗体。“全长抗体”是这样一种抗体，其包含抗原-结合可变区以及轻链恒定结构域(Q) 和重链恒定结构域s，CH1, Ch2*Ch3。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。优选地，全长抗体具有一种或多种效应功能。本文中术语“主要种类抗体”指组合物中的一种抗体结构，其在该组合物中是在量上占优势的抗体分子。在一个实施方案中，主要种类抗体是HER2抗体，如结合HER2结构域 II的抗体，比Trastuzumab更有效抑制HER 二聚体化作用的抗体，和/或结合HER2的异二聚体结合位点的抗体。本文的主要组分HER2抗体的优选实施方案是这样一种实施方案，其包括SEQ IDNos. 3和4中的可变轻和可变重氨基酸序列，最优选包括SEQ ID Nos. 15和16 中的轻链和重链氨基酸序列(Pertuzumab)。本文中“氨基酸序列变体”抗体是具有不同于主要种类抗体的氨基酸序列的抗体。 一般，氨基酸序列变体将与主要种类抗体具有至少大约70%同源性，优选地，它们至少将与主要种类抗体具有大约80%，更加优选至少大约90%同源性。氨基酸序列变体在主要种类抗体的氨基酸序列之内或邻近的某些位置上具有取代，删除，和/或添加。本文的氨基酸序列变体的实例包括酸性变体(例如脱酰胺抗体变体)，碱性变体，在其一个或两个轻链上具有氨基末端引导延伸(例如VHS-)的抗体，在其一个或两个重链上具有C-末端赖氨酸残基的抗体，等等，并且包括重和/或轻链氨基酸序列变异的组合。本文的特定目标抗体变体是在其一个或两个轻链上包含氨基末端引导延伸的抗体，任选地进一步包括相对于主要种类抗体的其它氨基酸序列和/或糖基化作用差异。“治疗性单克隆抗体”是用于治疗人受试者的抗体。本文公开的治疗性单克隆抗体包括用于癌症和各种非恶性疾病或病症的HER2抗体；用于治疗B细胞恶性瘤，自身免疫疾病，移植物排斥，或阻抑针对外源抗原的免疫反应的CD20或BR3抗体；用于治疗IgE介导的病症的IgE抗体；用于治疗癌症的DR5或VEGF抗体。本文的“糖基化作用变体”抗体是具有一个或多个糖部分附于其上的抗体，其不同于附于主要种类抗体上的一个或多个糖部分。本文的糖基化作用变体的实例包括具有Gl 或G2寡糖结构，而非GO寡糖结构附于其Fc区上的抗体，有一个或两个糖部分附于其一个或两个轻链上的抗体，没有糖附于抗体的一个或两个重链上的抗体，等等，以及糖基化作用变化的组合。当抗体具有Fc区时，可以将寡糖结构如图16所示的结构附于抗体的一个或两个重链上，例如在残基299上(四8，残基的Eu编号)。对于Pertuzumab来说，GO是占优势的寡糖结构，在Pertuzumab组合物中发现有较少量的其它寡糖结构如GO-F，G_1，Man5，Man6， Gl-LGl (1-6), Gl (1-3)和 G2。除非另外指定，本文的“G1寡糖结构”包括G-I，Gl-I，Gl (1-6)和Gl (1_3)结构。本文中“氨基末端引导延伸(amino-terminal leader extension) ”指氨基末端引导序列的一个或多个氨基酸残基，其存在于抗体的任何一个或多个重或轻链的氨基末端。 例示性的氨基末端引导延伸包含或由存在于抗体变体一条或两条轻链上的三个氨基酸残基，VHS组成。“同源性”被定义为在比对序列和引入缺口之后氨基酸序列变体残基相同的百分比，如果有必要的话，去实现最大百分比同源性。进行比对的方法和计算机程序是本领域公知的。一种这类计算机程序为“Align 2”，其于1991年12月10日在美国版权局，华盛顿区，DC20559以用户文件存档。抗体“效应功能”指那些可归结于抗体Fc区的生物学活性(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)。“效应功能”的例子包括Clq结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体-依赖型细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体的下调(例如B细胞受体；BCR)等。根据其重链恒定结构域的氨基酸序列，可以将全长抗体指定到不同的“类别”。有五种主要的全长抗体类别IgA，IgD，IgE，IgGjP IgM，其中几种可以进一步分入“亚类”(同种型)，例如，IgGl, IgG2，IgG3，IgG4，IgA,和IgA2。对应于不同类别抗体的链恒定结构域分别叫作α，δ，ε，Y，和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是公知的。“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”指一种细胞介导的反应，其中表达Fc 受体(FcR)的非特异性细胞毒细胞(如自然杀伤(NK)细胞，中性粒细胞，和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，并随后引起靶细胞的裂解。介导ADCC的主要细胞即NK细胞仅表达 Fc YR III，而单核细胞表达 Fc YR I, Fc γ R II 和 Fc y R III。Raveth 和 Kinet 在免疫学年鉴9 457-92 (1991)，464页的表3中总结了造血细胞上的FcR表达。为评估目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC试验，如美国专利5，500，362号或5，821，337号中所述。这类试验中有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。任选地或另夕卜，目的分子的ADCC活性可在体内评估，例如在Clynes等PNAS (USA) 95 :652-656(1998) 公开的动物模型中。“人效应细胞”是表达一种或多种FcR并执行效应剂功能的白细胞。优选所述细胞至少表达Fc γ R III并执行ADCC效应剂的功能。例如可介导ADCC的人白细胞包括人外周血单个核细胞(PBMC)，自然杀伤(NK)细胞，单核细胞，细胞毒T细胞和中性粒细胞；其中优选PBMC和NK细胞。效应细胞可分离自其天然来源，例如如本文所述分离自血液和PBMC。术语“Fe受体”或“FcR”用于描述与抗体Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列的人FcR。而且，优选的FcR是与IgG抗体结合的受体(γ受体)，包括Fc yR I,Fc yR II和Fc YR III亚型，以及这些受体的等位基因变体和可替换的剪接形式。Fc YR II受体包括Fc yR IIA( “活化型受体”)和Fc yR IIb( “抑制型受体”)，二者的氨基酸序列相似，主要区别在其胞浆结构域。活化型受体Fc yR IIA在其胞浆结构域包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制型受体Fc yR IIB在其胞浆结构域包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(见综述Daeron,免疫学年鉴15 :203-234 (1997))。在Ravetch和Kinet，免疫学年鉴9 :457-92(1991) ；Capel等，免疫方法(免疫学方法)4 :25-34 (1994)； 和de Haas等，实验室及临床医学杂志(J. Lab. Clin. Med.) 126 :330-41 (1995)中对FcR进行了综述。其它FcR，包括将来被确定的，均被包含在术语“FcR”中。该术语也包括新生期的受体，Fcfoi，其负责将母体的IgG转运至胎儿(Guyer等，免疫学杂志117 :587(1976)和 Kim等，免疫学杂志24 249 (1994))。“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在时分子裂解标靶的能力。补体活化途径由补体系统第一个成分(Clq)结合至一个与同源抗原形成复合物的分子(如抗体) 来启动。为评价补体活化，可如feizzano-Santoro等，免疫学方法杂志202 :163(1996)所述进行CDC试验。“天然抗体”通常是约150，000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，由两个相同的轻链 (L)和两个相同的重链(H)构成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而免疫球蛋白不同种型的重链中二硫键数目不同。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫键。每个重链在其一个端有可变结构域(Vh)，紧接着多个恒定结构域。每个轻链端有可变结构域 (Vl)，而另一端有恒定结构域；轻链恒定结构域与重链第一恒定结构域并列，轻链的可变结构域与重链的可变结构域并列。据信在轻链和重链的可变结构域之间特定氨基酸形成一个界面。术语“可变的”是指不同抗体的可变区某些部分序列差异很大，且这些部分在每种特定抗体与其特定抗原的结合和特异性中有用。然而在抗体整个可变区中可变性的分布并不均等。它集中在轻链和重链可变区的三个被称为高变区的节段中。可变区的更高度保守部分被称为框架区(FR)。天然轻链和重链的可变区分别包含四个FR，它们大多采用β片层构型，通过三个高变区相连，这些高变区与β片层结构形成环状，有时形成部分环状。每条链的高变区通过FR连接至十分接近，并与其他链的高变区共同形成抗体的抗原结合位点(见Kabat等，具有免疫学意义的蛋白的序列，第5版，Public HealthService,National Institutes ofHealth，Bethesda，MD. (1991))。恒定区不直接参与抗体对抗原的结合，但显示多种效应功能，如使抗体参与抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。当用在本文中时术语“高变区”指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常含有来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如轻链可变区的残基M_34(L1)， 50-56 (L2)和 89-97 (L3),重链可变区的残基 31-35 (HI), 50-65 (H2)和 95-102 (H3)； Kabat等，具有免疫学意义的蛋白的序列，第5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))，和/或“高变环”的残基(例如轻链可变区的残基 26-32 (Li)，50-52 (L2)和 91-96 (L3)，重链可变区的残基 26-32 (Hl)，53-55 (H2)和 96-101 (H3) ；Chothia 和 Lesk，分子生物学杂志 196 :901-917 (1987))。“框架区”或“FR”残基是除本文所定义的高变区残基以外的可变区残基。抗体经木瓜蛋白酶消化产生两个相同的称为“Fab”的抗原结合片段和一个残余 “Fe”片段，每个Fab片段具有单个抗原结合位点，Fc的名称反映了其容易形成结晶的能力。 胃蛋白酶处理产生一个？(油)2片段，它有两个抗原结合位点并仍能与抗原交联。“Fv”是最小抗体片段，包含完整的抗原识别和抗原结合位点。这个区域是由一条重链和一个轻链可变区紧密、非共价结合成的二聚体。在二聚体表面，每个可变区的三个高变区在构型上相互作用，从而限定抗原结合位点。六个高变区共同赋予抗体以抗原结合特性。但即使单个可变区(或Fv中仅包含三个抗原特异性高变区的那一半)也能识别并结合抗原，只是比完整结合位点的亲和力低。Fab片段还包含轻链恒定区和重链的第一恒定区(CHl)。Fab，不同于Fab片段之处在于，其重链CHl结构域的羧基端添加了数个残基，其中包括来自抗体铰链区的一或多个半胱氨酸。本文中Fab’_SH指一种Fab’，其中恒定区的半胱氨酸残基有至少一个游离巯基。F(ab’)2抗体片段最初是作为Fab’片段对且它们之间有铰链区半胱氨酸的形式产生的。抗体片段的其它化学连接也是已知的。可以将脊椎动物任何物种的抗体的“轻链”指定为两种完全不同的型之一，称作κ 和λ，型别区分的依据是其恒定区氨基酸序列。“单链Fv”或“scFv”抗体片段包括抗体的Vh和\结构域，这些结构域存在于单个多肽链上。优选地，Fv多肽在Vh和\结构域之间还包含一个多肽接头，它能使scFv形成抗原结合所需的结构。关于scFv的综述见Pluckthim在《单克隆抗体的药理学》，第113 卷，Rosenburg 禾口 Moore 编，Springer-Verlag，New York，第 269—315 页(1994)。 HER2 抗体 scFv片段在W093/16185 ；美国专利号5，571，894 ；和美国专利号5，587，458中进行了描述。术语“二价抗体(diabodies) ”是指具有两个抗原结合位点的小分子抗体片段，这些片段在一条多肽链(Vh-VJ上含有相连的一个重链可变区(Vh)和一个轻链可变区(\)。 利用一种非常短的接头，其使得同一条链上的两个结构域无法配对，被迫与另一条链上的互补结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。在EP 404, 097 ；W093/11161 ；和Hollinger 等，美国国家科学院学报，90 =6444-6448(1993)中对二价抗体作更充分地描述。“人源化”形式的非人(例如啮齿动物)抗体是包含源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。对于大多数的部分而言，人源化抗体人免疫球蛋白(受体(recipient)抗体)，其中受体的高变区残基被具有所需特异性、亲和力和能力(capacity)的非人物种如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类(供体(donor)抗体)的高变区的残基所替代。在一些情况下， 人免疫球蛋白框架区(FR)残基被相应的非人残基取代。而且人源化抗体可包含未在受体抗体或供体抗体中发现的残基。这些修饰旨在进一步细化抗体的功能。一般情况下，人源化抗体基本上包含至少一个、通常两个可变区的全部，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，所有或基本上所有FR是人的免疫球蛋白序列中的那些。人源化抗体任选地还包含免疫球蛋白恒定区(Fe)、通常为人免疫球蛋白的至少一部分。祥见Jones 等，自然 321 :522-525(1986) ；Riechmann 等，自然 332 :323-329(1988)；和 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593-596(1992)。人源化HER2 抗体包括 huMAb4D5_l，huMAb4D5_2，huMAb4D5_3，huMAb4D5_4， huMAb4D5-5, huMAb4D5_6，huMAb4D5_7 和 huMAb4D5_8 或 Trastuzumab (HERCEPTIN ), 如美国专利5，821，337的表3中所述，本文特别将其并入作为参考；本文所述的人源化 520C9 (W093/21319)和人源化 2C4 抗体。对于本文的目的而言，“Trastuzumab，”“HERCEPTIN ,’’和“huMAb4D5_8〃 分别指包括SEQ ID N0S. 13和14中的轻和重链氨基酸序列的抗体。在这里，“Pertuzumab，”“rhuMAb2C4，”和“0MNITARG ”分别指包括 SEQ ID N0S. 3 和4中的可变轻和可变重氨基酸序列的抗体。其中Pertuzumab是全长抗体，优选地它分别包含SEQ ID N0S. 15和16中的轻链和重链氨基酸序列。
“裸抗”是未偶联到异种分子，如细胞毒性部分或放射性标准上的抗体(如本文所定义的)。“亲和性-成熟的”抗体是在其一个或多个高变区中具有一或多种变化的抗体，所述变化导致所述抗体与不具有那些变化的亲代抗体相比，前者对于抗原的亲和性提高。优选的亲和性成熟的抗体将具有纳摩尔的或甚至皮摩尔的靶抗原亲和性。通过本技术领域已知的方法产生亲和性-成熟的抗体。Marks等，Bio/Technology，10 :779-783(1992)描述了通过VH和VL域重排的亲和性成熟(affinity maturation)。⑶R和/或框架残基的随机突变由 Barbas 等，Proc. Nat. Acad. Sci, USA, 91 :3809-3813(1994) Jchier 等，Gene, 169 147-155(1995) ；Yelton 等，J. Immunol.，155 :1994-2004(1995) Jackson 等，J. Immunol.， 154(7) :3310-3319(1995)；和 Hawkins 等，J. Mol. Biol.，226 :889-896 (1992)描述。“激动剂抗体”是结合并激活受体的抗体。一般地，激动剂抗体的受体激活能力将至少在定性上与受体的天然激动剂配体相似(并且可以是基本上在定性上相似)。激动剂抗体的实例是结合TNF受体超家族中的受体，如DR5的抗体，并且其诱导表达TNF受体(例如DR5)的细胞的凋亡。确定凋亡诱导的测定法在W098/51793和W099/37684中进行了描述，特此将二者并入本文作为参考。“分离的”抗体是指从其天然环境成份中鉴定和分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染成份是会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，且可能包括酶，激素，和其它蛋白型或非蛋白型溶质。在优选的实施方案中，该抗体将纯化成(1)按劳里(Lowry)方法测定的抗体重量百分比超过95%，且最优选重量百分比超过99%，(2)其纯化程度足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列，或C3)在还原性或非还原性条件下进行SDS-PAGE并使用考马斯蓝或者，优选银染测定具有同质性。分离的抗体包括在重组细胞内的原位抗体，因为该抗体天然环境中的至少一种成份不存在。然而，一般来说，分离的抗体由至少一个纯化步骤制备。“比Trastuzumab更有效地抑制HER 二聚体化作用”的HER2抗体是比Trastuzumab 更有效地(例如至少大约2-倍更加有效地)减弱或消除HER 二聚体的抗体。优选地， 这种抗体至少大约与鼠单克隆抗体2C4，鼠单克隆抗体2C4的Fab片段，Pertuzumab，和 Pertuzumab的Fab片段同样有效地抑制HER2 二聚体化作用。可以通过直接研究HER 二聚体，或通过评估HER激活，或缘自HER 二聚化作用的下游信号，和/或通过评估抗体-HER2结合位点等等来评估HER 二聚化作用抑制。筛选具有比Trastuzumab更有效地抑制HER 二聚体化作用的抗体的测定法在Agus等人Cancer Cell2 :127-137(2002)和WOO 1/00245 (Adams 等人)中进行了描述。例如，可以通过评估，例如，HER二聚体形成的抑制(参见，例如，Agus 等人 Cancer Cell2 :127-137(2002)的图 ΙΑ-Β ；和 W001/00245)；表达 HER 二聚体的细胞的 HER 配体激活的减弱(例如，W001/00245 和 Agus 等人 Cancer Cell2 :127-137(2002)的图 2A-B) ；HER配体与表达HER 二聚体的细胞的结合的阻抑(例如，W001/00245，和Agus等人 Cancer Cell2 :127-137(2002)的图2E)；在HER配体存在(或缺失)时表达HER 二聚体的癌细胞(例如MCF7，MDA-MD-134, ZR-75-1，MD-MB-175，T-47D细胞)的细胞生长抑制(例如，W001/00245 和 Agus 等人 Cancer Cell2 :127-137(2002)的图 3A-D)；下游信号的抑制 (例如，HRG-依赖型AKT磷酸化作用的抑制或HRG-或TGF α -依赖型MAPK磷酸化作用的抑制)(参见，例如，W001/00M5，和 Agus 等人 Cancer Cell2 :127-137(2002)的图 2C-D)来测定HER 二聚体化作用的抑制。还可以通过研究抗体HER2结合位点，例如，通过评估结合 HER2的抗体的结构或模型，如晶体结构，来评估抗体是否抑制HER 二聚体化作用(参见，例如，Franklin 等人 Cancer Cell5 :317-328 (2004)) HER2抗体可以比Trastuzumab更加有效地“抑制HRG-依赖型AKT磷酸化作用”和 /或抑制“HRG-或TGF α-依赖型MAPK磷酸化作用，，(例如至少2-倍更加有效地)(例如参见 Agus 等人 Cancer Cell2 :127-137(2002)和 W001/00245)。HER2抗体可以“不抑制HER2外部结构域(ectodomain)切割”(Molina等人Cancer Res. 61 :4744-4749(2001)。“结合HER2的异二聚体结合位点”的HER2抗体，结合结构域II中的残基(任选地还结合其它HER2细胞外结构域，如结构域I和III中的残基)，并且至少在某种程度上可以空间阻碍 HER2-EGFR，HER2-HER3，或 HER2-HER4 异二聚体的形成。Franklin 等人 Cancer Cell5 :317-328(2004)表征了 HER2_Pertuzumab晶体结构，保存在RCSB蛋白质数据库(ID CodeIS78)，例证了结合HER2的异二聚体结合位点的例示性抗体。“结合HER2的结构域II”的抗体结合结构域II中的残基并且任选地结合HER2其它结构域，如结构域I和III中的残基。优选地结合结构域II的抗体结合到HER2的结构域I，II和III之间的连接上。当在本文中使用时“生长抑制剂”指在体外或体内抑制细胞，特别是表达HER的癌细胞的生长的化合物或组合物。因而，生长抑制剂可以是显著减少处于S期的表达HER的细胞的百分比的抑制剂。生长抑制剂的实例包括阻抑细胞周期进程(在S期以外处)的试剂，如诱导Gl阻滞和M-期阻滞的试剂。典型的M-期阻抑剂包括长春花碱类(vincas) (长春新碱和长春碱)，紫杉烷，和拓扑II抑制剂如阿霉素，表柔比星(印irubicin)， 柔红霉素(daunorubicin)，依托泊苷(etoposide)，和博来霉素。那些阻滞Gl的试剂也延伸到S期阻滞，例如，DNA烷化剂如它莫西芬，强的松，达卡巴嗪(dacartazine)，氮芥(mechlorethamine)，顺钼，氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶，和阿糖胞苷(ara-C)。其它信息可以见于 The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohnand Israel, eds. ， Chapter 1， entitled " Cell cycle regulation, oncogenes, andantineoplastic drugs " by Murakami 等人(WB Saunders =Philadelphia, 1995)，特别是第 13 页。“生长抑制性”抗体的实例是那些结合HER2和抑制过表达HER2癌细胞的生长的抗体。优选的生长抑制性HER2抗体以大约0.5-30yg/ml的抗体浓度抑制细胞培养物中 SK-BR-3乳房肿瘤细胞的生长超过20%，优选超过50% (例如从大约50%到大约100% )， 其中所述生长抑制是在SK-BR-3细胞暴露于抗体六天之后(参见发布于1997年10月14日的美国专利号5，677，171)测定的。SK-BR-3细胞生长抑制测定在该专利和下文中作更加详细的描述。优选的生长抑制性抗体是鼠单克隆抗体4D5的人源化变体，例如，Trastuzumab。“诱导凋亡”的抗体是指诱导程序性细胞死亡的抗体，所述死亡可通过膜联蛋白 (armexirOV的结合，DNA片段化，细胞皱缩，内质网膨胀，细胞碎裂，和/或膜泡(称为凋亡小体)形成确定。所述细胞通常是表达该抗体所结合抗原的细胞。优选地所述细胞是肿瘤细胞。例如磷脂酰丝氨酸(PQ转位可以通过膜联蛋白结合测量；DNA片段化可以通过DNA 梯度评估；而伴随着DNA片段化的核/染色质浓缩可以通过亚二倍体细胞的任何增长进行评估。优选地，在膜联蛋白结合测定中，诱导凋亡的抗体是导致相对于未处理细胞对膜联蛋白结合的诱导为大约2-50倍，优选地大约5-50倍，最优选大约10-50倍的抗体，所述测定利用表达该抗体所结合抗原的细胞进行。诱导凋亡的抗体的实例为HER2抗体7C2和7F3， 和某些DR5抗体。“表位2C4”是抗体2C4结合的HER2细胞外结构域中的区域。为了筛选结合2C4 表位的抗体，可以进行常规交叉阻抑测定，如在Antibodies，ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)中所述的测定。或者，可以进行表位图谱绘制以评估抗体是否结合到HER2的2C4表位上。表位2C4包含来自HER2 细胞外结构域中结构域II的残基。2C4和Pertuzumab在结构域I，II和III的连接处结合HER2的细胞外结构域。Franklin等人癌细胞5 =317-328 (2004)。“表位 4D5” 是抗体 4D5(ATCC CRL 10463)和 Trastuzumab 进行结合的 HER2 细胞外结构域中的区域。这一表位靠近HER2的跨膜结构域，并且在HER2的结构域IV内。为了筛选结合4D5表位的抗体，可以进行常规交叉阻抑测定，如在Antibodies，ALaboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)中所述的测定。或者，可以进行表位图谱绘制以评估抗体是否结合到HER2的4D5表位上(例如从HER2 的大约残基5 到大约残基625的区域中任何一个或多个残基，包括残基5 和残基625)。“表位7C2/7F3”是7C2和/或7F3抗体(都保存在ATCC，参见下文)结合的HER2 细胞外结构域的结构域I之内的，氨基末端上的区域。为了筛选结合7C2/7F3表位的抗体， 可以进行常规交叉阻抑测定，如在 Antibodies，ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)中所述的测定。或者,可以进行表位图谱绘制以证实抗体是否结合到HER2上的7C2/7F3表位上(例如从HER2的大约残基22到大约残基53的区域中任何一个或多个残基)。“治疗”指治疗性治疗和预防性措施。需要处理的人包括已经患有疾病的人以及要预防疾病的人。因此，可以将本文待处理的患者诊断为患有疾病或可能倾向或易于患有该疾病。术语“癌症”和“癌的”指或描述哺乳动物的生理状态，其一般表征为无节制的细胞生长。癌症的实例包括，但不限于，癌，淋巴瘤，胚细胞瘤(包括髓母管细胞瘤和视网膜母细胞瘤)，肉瘤(包括脂肪肉瘤和滑液细胞肉瘤)，神经内分泌肿瘤(包括类癌样肿瘤，促胃泌素瘤，和胰岛细胞癌)，间皮瘤，神经鞘瘤(包括听神经瘤)，脊膜瘤、腺癌、黑素瘤，和白血病或淋巴恶性瘤。这些癌症的更加具体的实例包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)，肺癌包括小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺的腺癌和肺的鳞状细胞癌，腹膜癌，肝细胞癌，肠胃癌包括胃肠癌，胰腺癌，胶质母细胞瘤，颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝癌，乳癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜或子宫癌，唾液腺癌，肾癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝癌，肛门癌，阴茎癌，阴囊癌，食道癌，胆道肿瘤，以及头和颈部的癌。术语“有效量”指对患者疾病有效的药物量。当所述疾病是癌症时，药物的有效量可以减少癌细胞的数目；减少肿瘤大小；抑制(即，在某种程度上延缓并且优选终止)癌细胞浸润入外周器官；抑制(即，在某种程度上延缓并且优选终止)肿瘤转移；在某种程度上抑制肿瘤生长；和/或在某种程度上减轻一种或多种与癌症相关联的症状。在药物可以阻止癌细胞生长和/或杀死现存癌细胞的程度上，它可以是抑制细胞生长的和/或细胞毒性的。所述有效量可以延长进程自由存活，导致产生目标反应(包括部分反应，PR，或完全反应，CR)，提高整体存活时间，和/或改善癌症的一种或多种症状。“表达HER2的癌症”是包含具有HER2蛋白存在于其细胞表面上的细胞的癌症。“过表达”HER受体的癌症是这样一种癌症，其与相同组织类型的非癌细胞相比，在其细胞表面具有显著更高水平的HER受体，如HER2。这种过表达可能是由基因扩增或由增强的转录或翻译而引起的。HER受体过表达可以在诊断性或预后性测定中通过评估存在于细胞表面上的HER蛋白质的水平提高而进行测定(例如通过免疫组化测定；IHC)。或者，或此外，可以通过例如荧光原位杂交(FISH ；参见1998年10月公开的W098/45479)，DNA印迹， 或聚合酶链式反应(PCR)技术，如定时定量PCR(RT-PCR)测量编码HER的核酸在细胞中的水平。还可以通过测量在生物液如血清中渗出的抗原来研究HER受体过表达(参见，例如， 1990-06-12 发布的美国专利号 4，933，294 ； 1991-04-18 公开的 W091/05264 ；1995-03-28 发布的美国专利 5，401，638 ；和 Sias 等人 J. Immunol. Methods 132 :73-80 (1990))。除了以上测定之外，熟练专业人员还可利用各种体内测定法。例如，可以将患者体内的细胞暴露于抗体，所述抗体任选地标记了可检测标记，例如放射性同位素，并且可以通过例如外部扫描放射性或通过分析取自先前暴露于抗体的患者的活检组织来评估抗体与患者体内细胞的结
I=I ο相反，“不过表达HER2受体”的癌症是这样一种癌症，其与相同组织类型的非癌细胞相比，并不会表达高于正常水平的HER2受体。“过表达”HER配体的癌症是这样一种癌症，其与相同组织类型的非癌细胞相比，产生显著更高水平的该配体。这种过表达可能是由基因扩增或由增强的转录或翻译引起的。 可以通过评估患者体内配体(或编码它的核酸)的水平来诊断性确定HER配体的过表达， 例如在肿瘤活检组织中或通过各种诊断性测定法如IHC，FISH，DNA印迹，PCR或上述的体内测定法来进行。本文中所用的术语“细胞毒制剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语旨在包括放射性核素(例如At211，I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212，P32和镥的放射性同位素)，化疗剂，和毒素如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体。“化疗剂”是可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的实例包括烷化剂，如噻替哌(thiot印a)和环膦酰胺(cyclosphamide) (CYTOXAN );烷基磺酸酯如白消安 (busulfan),英丙舒凡(improsulfan)禾口喊泊舒凡(piposulfan)；氣丙 如 benaodopa, 卡波醌(carboquone)，美妥替哌(meturedopa)和尿烷亚胺(uredopa)；乙撑亚胺和 methylamelamine 包括六甲蜜胺(altretamine)，三亚乙基蜜胺(triethylenemelamine), 三亚乙基磷酰胺，三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺(trimethylolomelamine)； acetogenins ( ^50 bulIatacin 禾口 bullatacinone) ；delta-9- 0 ,^) ! ' (dronabinol, MARINOL ) ；beta-拉帕酮；拉帕醇；colchicines ；白桦脂酸；喜树碱(包括合成的类似物拓扑替康(topotecan)) ；CPT-11 (依立替康，CAMPTOSAR )；乙酰基喜树碱， 东莨菪甙元，和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin) ；callystatin ;CC_1065 (包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼白毒素；鬼白树酸；替尼泊甙；crypt0phyCinS(特别是cryptophycin 1和 cryptophycin8) ； · L (dolastatin) ；duocarmycin ( ^ ^ S^MU ， Kff-2189禾口 CBI—TMI) ；eleutherobin ；pancratistatin ；sarcodictyin ；spongistatin ； 氣芥 (nitrogenmustards)如苯丁酸氮芥，萘氮芥，胆磷酰胺(cholophosphamide)，雌氮芥 (estramustine)，异环磷酰胺(ifosfamide)，氮芥(mechlorethamine)，盐酸氧氮芥；左旋苯丙氨酸氮芥(melphalan)，新氮芥(novembichin)，胆留醇苯乙酸氮芥，松龙苯芥 (prednimustine),曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥；亚硝基脲(nitrosureas)如亚硝基脲氮芥(carmustine),氯脲菌素(chlorozotocin),福莫司汀(fotemustine),洛莫司汀(Iomustine)，尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素如烯二醇抗生素(如加利车霉素，尤其是加利车霉素Yl和加利车霉素ω 1，参见例如Agnew Chem Intl.Ed. Engl. 33 183-186(1994) ；dynemicin,包括 dynemicinA ；esperamicin ； 以及新制癌菌素生色团(chromophore)和相关的色蛋白enediyne抗生素生色团)，阿克拉霉素，放线菌素，authramycin,重氮丝氨酸，博来霉素，放线菌素C(cactinomycin)， carabicin,洋红霉素(carminomycin)，嗜癌素(carzinophilin),色霉素，方文线菌素D，柔红菌素(daunorubicin)，地托比星(detorubicin)，6-重氮_5_氧-L-正亮氨酸，阿霉素(doxorubicin)(包括ADRIAMYCIN ,吗啉代-阿霉素，氰基吗啉代-阿霉素，2-吡咯啉基-阿霉素，阿霉素HCl脂质体注射液(DOXIL )，脂质体阿霉素TLC D-99 (MYOCET ),聚乙二醇化的脂质体阿霉素(CAELYX ),和脱氧阿霉素)，表阿霉素(印irubicin)，依索比星(esorubicin)，伊达比星(idarubicin)，发波霉素(marcellomycin)，丝裂霉素如丝裂霉素C，霉酚酸，诺加霉素(nogalamycin)，橄榄霉素(olivomycin)，培洛霉素(peplomycin), potf iromycin，嘌呤霉素，三铁阿霉素 (quelamycin)，罗多比星(rodorubicin)，链黑菌素；链脲霉素(str印tozocin)，杀结核菌素，乌苯美司(ubenimex)，净司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代谢药如氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸(denopterin)，氨甲蝶呤，蝶罗呤，三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物如氟达拉滨(fludarabine)，6_巯基嘌呤， 硫咪嘌呤，硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨(ancitabine)，阿扎胞苷(azacitidine)， 6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷，双脱氧尿苷，去氟氧尿苷(doxifluridine)， 依诺他滨(enocitabine)，氟尿苷；抗肾上腺类，如氨鲁米特(aminoglutethimide)，米托坦(mitotane),曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂如frolinic acid;醋葡内酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；安吖唆(amsacrine) ；bestrabucil ；比生群(biasntrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酉先胺 (defofamine)；秋水仙胺；地吖醌(diaziquone) ；elfornithine ；依利醋铵(elliptinium acetate)；印othilone ；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(Ientinan)； 氯尼达明(Ionidamine)；美登木素生物碱(maytansinoids)(包括美登素和柄型菌素) 米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；硝呋旦 (nitracrine)；喷司他丁 (pentostatin)；蛋氛氣芥(phenamet) ；口比柔比星(pirarubicin)； 鬼臼树酸(podophyllinic acid) ；2-乙基酰胼；丙卡巴胼(procartazine) ；PSK 多糖
(JHS Natural Products, Eugene, OR) -Mit^. (razoxane) ；rhizoxin ； (sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2，2‘，2〃 -三氯三乙胺(trichlorrotriethylamine)；单端孢霉烯族毒素类(尤其是T-2毒素，verracurinA， 杆孢菌素A，蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；达卡巴嗪(dacartazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol) ；二溴卫矛醇；哌泊溴烧(pipobroman) ；gacytosine ；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；三胺硫磷(thiot印a)；紫杉烷(taxoid)，如紫杉醇(TAXOL ,紫杉醇的白蛋白改造纳米颗粒制剂(ABRAXANETM)，和紫杉萜(TAXOTERE ); chloranbucil ； 6-硫代鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；钼类药剂如顺钼，奥沙利钼和卡钼；长春花碱，其阻止微管蛋白聚合作用形成微管，包括长春碱(VELBAN )，长春新碱(ONCOVIN ), 长春地辛(ELDISINE , FILDESIN ),和长春瑞宾(NAVELBINE )；依托泊甙 (etoposide) (VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；Ieucovovin ；诺安托(novantrone)；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；伊拜膦酸盐；拓扑异构酶抑制剂RFS2000 ；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄醛如维甲酸，包括bexarotene(TARGRETIN );二膦酸盐如氯甲双磷酸盐(例如，BONEFOS 或OSTAC )，依替膦酸钠(DIDROCAL ), NE-58095,唑来瞵酸(zoledronic acicO/zoledronate (ZOMETA ),阿仑膦酸钠(FOSAMAX ), 帕米膦酸钠(AREDIA ),替鲁膦酸盐(SKELID ),或利塞膦酸盐(ACTONEL )； 曲沙他滨(troxacitabine) (1，3_ 二氧戊烷核苷胞核嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是那些抑制在涉及失控细胞增殖的信号途径中的基因表达的反义寡核苷酸，如，例如，PKC-α，Raf, H-Ras,和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗如THERATOPE 疫苗和基因治疗疫苗，例如，ALLOVECTIN 疫苗，LEUVECTIN 疫苗，和VAXID 疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如，LURTOTECAN ) ； rmRH (例如，ABARELIX )； BAY439006 (sorafenib ；Bayer) ；SU-11248 (Pfizer)；哌立福辛(perifosine)，C0X-2 抑制剂(例如塞来考昔(celecoxib)或艾托考昔(etoricoxib))，蛋白体抑制剂(例如PS341)； bortezomib (VELCADE ) ； CCI-779 ；tipifarnib (R11577) ；orafenib, ABT510 ；Bcl_2 抑制剂如 oblimersensodium(GENASENSE );pixantrone ；EGFR 抑制剂(参见下面的定义)；酪氨酸激酶抑制剂(参见下面的定义)；和可药用的盐，酸或任何上述药剂的衍生物； 以及以上药剂中的两种或多种的组合，如CHOP，环磷酰胺，阿霉素，长春新碱和脱氢皮质醇的组合疗法的缩写，以及F0LF0X，用奥沙利钼(EL0XATIN )结合5-FU和leucovovin的治疗方案的缩写。 这一定义还包括作用来调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂，如具有混合激动剂/拮抗剂模式的抗雌激素剂，包括，他莫昔芬(NOLVADEX )，4-羟基他莫昔芬，托瑞米芬(FARESTON )，碘昔芬，屈洛昔芬，雷洛昔芬(EVISTA )，曲沃昔芬，keoxifene, 和选择性雌激素受体调节剂(SERMs)如SERM3;无激动剂特性的纯抗雌激素剂如 fulvestrant(FASLODEX )，和EM800(这种药剂可以阻抑雌激素受体(ER) 二聚作用， 抑制DNA结合，增强ER更新，和/或抑制ER水平)；芳香酶抑制剂，包括留族芳香酶抑抑制剂如福美司坦和依西美坦(exemestane) (AROMASIN ),和非甾族芳香酶抑制剂如阿纳托唑(ARIMIDEX )，来曲唑(FEMARA )和氨鲁米特，和其它芳香酶抑制剂包括伏氯唑(vorozole) (RIVISOR ),甲地孕酮醋酸盐(MEGASE ) , fadrozole，咪唑；促黄体激素释放激素激动剂，包括亮丙瑞林(LUPRON 和ELIGARD )，戈舍瑞林，布舍瑞林， 和tripterelin ；性类固醇，包括孕激素如甲地孕酮醋酸盐和甲羟孕酮醋酸盐，雌激素如己烯雌酚和普雷马林(premarin)，和雄性激素/视黄醛如氟甲睾酮，所有的transretionicacid和芬维A胺；奥那司酮(onapristone)；抗黄体酮剂；雌激素受体下调剂(ERDs)；抗雄性激素如氟他胺，尼鲁米特和比卡鲁胺(bicalutamide)；睾丸酮；和可药用的盐，酸或任何上述药剂的衍生物；以及以上药剂中的两种或多种的组合。如本文所用的，术语“EGFR靶向药物”指结合EGFR并且，任选地，抑制EGFR激活的治疗剂。这种制剂的实例包括结合EGFR的抗体和小分子。结合EGFR的抗体的实例包括 MAb 579(ATCC CRL HB 8506)，MAb 455(ATCC CRL HB8507)，MAb 225 (ATCC CRL 8508)，MAb 528 (ATCC CRL8509)(参见，美国专利号4，943，533，Mendelsohn等人)及其变体，如嵌合的 225 (C225 或Cetuximab ；ERBUTIX )和重构的人225 0122 (参见，TO96/40210，Lnclone Systems Inc.)；结合II型突变体EGFR的抗体(美国专利号5，212，290)；结合EGFR的人源化和嵌合抗体，如美国专利号5，891，996中所述；和结合EGFR的人抗体，如ABX-EGF (参见TO98/50433，Abgenix)。抗EGFR抗体可以缀合以细胞毒性剂，由此生成免疫缀合物(参见，例如，EP659, 439A2，Merck Patent GmbH)。结合EGFR的小分子实例包括ZD1839或 Gefitinib (IRESSA ；Astra Zeneca)，CP-358774 或 Erlotinib HCL (TARCEVA ；Genentech/ 0SI)和 AG1478，AG1571(SU 5271 ；Sugen)。“酪氨酸激酶抑制剂”是在某种程度上抑制酪氨酸激酶如HER受体的酪氨酸激酶活性的分子。这类抑制剂的实例包括在前段落中提到的EGFR靶向药物以及小分子 HER2酪氨酸激酶抑制剂如可获自Takeda的TAK165，双-HER抑制剂如优选结合EGFR但抑制HER2和EGFR-过表达细胞的EKB-569 (可获自Wyeth)，口服HER2GW572016 (可获自Glaxo)和EGFR酪氨酸激酶抑制剂，和H(I-166(可获自Novartis) ；pan-HER抑制剂如 canertinib(CI-1033 ；Pharmacia) ；Raf-I 抑制剂如可获自 ISIS Pharmaceuticals 的反义试剂ISIS-5132，其抑制Raf-I信号过程；非-HER靶向TK抑制剂如Imatinib甲磺酸盐(Gleevac )，可获自Glaxo ；MAPK细胞外调节的激酶I抑制剂CI-1040 (可获自 Pharmacia)；喹唑啉，如 PD 153035,4-(3-氯苯胺)喹唑啉；pyridopyrimidines ； pyrimidopyrimidines ；pyrrolopyrimidines,如 CGP 59326, CGP 60261 禾口 CGP 62706 ； pyrazolopyrimidines，4-(苯氨基)-7H-吡咯基[2，3_d]嘧啶；姜黄素(diferuloyl 甲烷，4，5-二(4-对氟苯胺)邻苯二甲酰亚胺)；包含硝基噻吩部分的tyrphostines; PD-0183805 (Warner-Lamber)；反义分子(例如结合HER-编码核酸的那些)；喹噁啉(美国专利号 5，804，396) ；tryphostins (美国专利号 5,804,396) ；ZD6474(Astra Zeneca)； PTK-787 (Novartis/Schering AG) ；pan-HER 抑制剂如 CI-1033 (Pfizer) ；Affinitac (ISIS 3521 ；Isis/Lilly) ；Imatinib 甲磺酸 ^leevac;Novartis) ;PKI 166 (Novartis)； GW2016(Glaxo SmithKline) ；CI-1033 (Pfizer) ；EKB-569(Wyeth) ；Semaxinib (Sugen)； ZD6474 (AstraZeneca) ；PTK-787 (Novartis/Schering AG) ；INC-ICl1(Imclone) ； ■ 下面任一个专利公开文本中所述的美国专利号5，804, 396 ；W099/09016 (American Cyanimid) ；W098/43960 (American Cyanamid) ；W097/38983 (Warner Lambert)； W099/06378(Warner Lambert) ；W099/06396(WarnerLambert) ；W096/30347(Pfizer，Inc)； W096/33978(Zeneca) ；W096/3397(Zeneca)；和 W096/33980(Zeneca)。“抗血管生成剂”指在某种程度中阻抑或干扰血管形成的化合物。抗血管生成因子可以，例如，是结合参与促进血管生成的生长因子或生长因子受体的小分子或抗体。本文优选的抗血管生成因子是结合血管内皮生长因子(VEGF)的抗体，如Bevacizumab (AVASTIN ) 术语“细胞因子”是由一个细胞群释放的、作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白的总称。这类细胞因子有淋巴因子，单核因子，和传统的多肽激素。细胞因子包括生长激素，如人生长激素，N-甲二磺酰人生长激素，和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；前胰岛素；松驰素；前松驰素；糖蛋白激素如卵泡刺激素(FSH)，甲状腺刺激素(TSH)， 促黄体(生成)激素(LH)；肝细胞生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳激素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-α和β ；苗勒管(mullerian)-抑制物；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；苯丙酸诺龙；血管内皮细胞生长因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神经生长因子如NGF-β ；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β ；胰岛素样生长因子-I和-II ；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子(osteoinductive factors)；干扰素如干扰素-α , "β , "Y ；集落刺激因子(CSF)如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；粒细胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素(IL)如 IL-1，IL-I α，IL-2，IL-3， IL-4, IL-5, IL-6, IL-7，IL-8，IL-9，IL-11，IL-12，IL-15 ；肿瘤坏死因子如 TNF-α 或 TNF-β ；和其它多肽因子包括LIF和kit配体(KL)。本文所用的术语细胞因子包括天然蛋白或来自重组细胞培养物的蛋白以及天然序列细胞因子的生物活性等效物。配制的抗体优选是基本上纯的并且是基本上均一的(即不含污染性蛋白质等)。 “基本上纯的”抗体意指基于组合物的总重量，包括至少大约90%重量比的抗体的组合物， 优选至少大约95%重量比。“基本上均一的”抗体意指基于组合物的总重量，包括至少大约 99%重量比的抗体的组合物。本文的“B细胞表面标记”或“B细胞表面抗原”是在B细胞表面上表达的抗原， 其可以用与其结合的抗体靶向。例示性的B细胞表面标记包括⑶10，⑶19，⑶20，⑶21， CD22, CD23, CD24, CD37, CD40, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 和 CD86 白细胞表面标记(有关描述参见 The Leukocyte Antigen Facts Book, 2nd Edition. 1997, ed. Barclay 等人 Academic Press, Harcourt Brace&Co.，New York)。其它 B 细胞表面标记包括 RP105，FcRH2, B 细胞 CR2, CCR6, P2X5, HLA-DOB, CXCR5, FCER2, BR3, Btig, NAG14, SLGC16270, FcRHl，IRTA2, ATWD578, FcRH3，IRTAl，FcRH6，BCMA，和239287。与哺乳动物的其它非B细胞组织相比本文的特定目标B细胞表面标记优选在B细胞上表达，并且可以在前体B细胞和成熟B细胞上表达。本文的优选B细胞表面标准是⑶20或BR3。“⑶20”抗原，或“⑶20”是大约35-kDa，非糖基化的磷蛋白，见于来自外周血或淋巴器官的超过90%的B细胞表面。⑶20存在于正常的B细胞以及恶变的B细胞，但是并不在干细胞上表达。在文献中⑶20的其它名称包括"B-淋巴细胞限制型抗原"和"Bp35"。 CD20 抗原在例如 Clark 等人 Proc. Natl. Acad. ki. (USA)82 :1766(1985)中进行了描述。仅仅对于本文的目的而言，“人源化2H7”指2H7抗体的人源化变体，所述2H7抗体的CDR序列公开于美国专利号5，500, 362(图5和6)中，特此将其并入本文作为参考。 本文的人源化2H7抗体的实例包括W02004/056312中所述的变体，以及其它变体，包括， 但不限于2H7vl6，2H7v31,2H7v73, 2H7v75, 2H7v96, 2H7vll4, 2H7vll5, 2H7vll6, 2H7vl38, 2H7v477，2H7v375，等等，在此将W02004/056312也并入本文作为参考。在一个实施方案中，人源化2H7抗体包含下列⑶R序列中的一种，两种，三种，四种,五种或六种CDR Ll 序列 RASSSVSYXH 其中 X 是 M 或 L(SEQ ID No. 67)，例如 SEQ ID No. 57 (图 18A)，SEQ ID No. 58 的 CDR L2 序列(图 18A)，CDR L3 序列 QQffXFNPPT 其中 X 是 S 或 A (SEQ ID No. 68)，例如 SEQID No. 59 (图 18A)，SEQ ID No. 60 的 CDR Hl 序列(图 18B)，AIYPGNGXTSYNQKFKG 的 CDR H2 序列，其中 X 是 D 或 A (SEQ ID No. 69)，例如 SEQ ID No. 61 (图 18B)，和VVYYSXXYffYFDV的CDR H3序列，其中位置6上的X是N，A，Y，W或D，而位置7上的 X 是 S 或 R (SEQ ID No. 70)，例如 SEQ ID No. 62 (图 18B)。上面的⑶R序列一般存在于人可变轻和可变重框架序列之内，如基本上人轻链κ 亚基I (VfI)的人共有FR残基，和基本上人重链亚基III(VhIII)的人共有FR残基。还参见 WO 2004/056312 (Lowman 等人)。可变重区可以连接到人IgG链恒定区上，其中该区可以是，例如，IgGl或IgG3，包括天然序列和变体恒定区。在优选的实施方案中，这类抗体包含SEQ ID No. 29的可变重结构域序列(vl6，如图18B中所示)，任选地还包括SEQ ID No.沈的可变轻结构域序列(vl6，如图18A中所示)， 其在位置56，100，和/或IOOa上任选地包含一个或多个氨基酸取代，例如D56A，N100A或 mOOY，和/或可变重结构域中的SlOOaR，在可变轻结构域位置32和/或92上的一个或多个氨基酸取代，例如M32L和/或S92A。优选地，抗体是完整抗体，包括SEQ ID Nos. 63或 64的轻链氨基酸序列，和SEQ ID No. 65，66，71或72的重链氨基酸序列。优选的人源化 2H7 抗体是 ocrelizumab (Genentech)。本文的抗体可以进一步包含Fc区中的提高ADCC活性的至少一个氨基酸取代，如这样一种氨基酸取代，其中氨基酸取代在位置四8，333，和334上，优选S298A，E333A，和 K334A，其利用重链残基的Eu编号。还参见美国专利号6，737，056B1, I^resta。这些抗体的任一种可以包含Fc区中的至少一个取代，其增强Fcfoi结合或血清半寿期，例如在重链位置434上的取代，如N434W。还参见美国专利号6，737，056B LPresta0这些抗体的任一种可以包含Fc区中的至少一个氨基酸取代，其增强⑶C活性，例如，至少包含位置幻6上的取代，优选或K3^W。还参见美国专利号 6，528，624B1 (Idusogie 等人)。一些优选的人源化2H7变体是那些包括SEQ ID No. 26的可变轻结构域和SEQ ID No. 29的可变重结构域的变体，包括在Fc区(如果存在的话)中有或无取代的变体，以及那些包括在 SEQ ID No. 29 中具有取代 WOOA ；或 D56A 禾口 N100A ；或 D56A，N100Y，和 SlOOaR 的可变重结构域以及在SEQID No. 26中具有取代M32L ；或S92A ；或M32L和S92A的可变轻结构域的变体。已经将2H7vl6的可变重链中的M34鉴定为抗体稳定性的潜在来源并且是另一种取代的潜在候选物。在本发明的一些优选实施方案的总结中，基于2H7vl6的变体的可变区包含vl6的氨基酸序列，但除了在下表中所指出的氨基酸取代位置之外。除非另外指定，2H7变体将与
vl6具有相同的轻链。 例示件的人源化2H7抗体变体
2H7 版本重链 (VH)改变轻链 (VL)改变Fc改变16用于参昭31--S298A, E333A, K334A73N100AM32L75N100AM32LS298A, E333A, K334A96D56A, N100AS92A114D56A, N100AM32L, S92AS298A, E333A, K334A115D56A, N100AM32L, S92AS298A, E333A, K334A, E356D, M358L116D56A, N100AM32L, S92AS298A, K334A, K322A138D56A, N100AM32L, S92AS298A, E333A, K334A, K326A477D56A, N100AM32L, S92AS298A, E333A, K334A, K326A, N434W375--K334L588--S298A, E333A, K334A, K326A511D56A,N100Y, SlOOaRM32L, S92AS298A, E333A, K334A, K326A一种优选的人源化2H7包含2H7vl6可变轻结构域序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI TCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFG QGTKVEIKR(SEQ ID No. 26)；和2H7vl6 可变重结构域序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGK GLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTV SS (SEQ IDNo. 29).当所述人源化2H7vl6抗体是完整抗体时，它可以包含轻链氨基酸序列DIQMTQSP SSLSASV⑶RVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY YCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESV TEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID No. 63)；禾口SEQ ID No. 65 的重链氨基酸序列或EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMH WVRQAPGKGLEffVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVff GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID No. 71).另一种优选的人源化2H7抗体包含2H7v511可变轻结构域序列DIQMTQSPSSLSAS V⑶RVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWA FNPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID No. 73)和2H7v511 可变重结构域序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPG KGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSYRYWYFDVWGQGTLVT VSS (SEQ IDNo. 74).
当所述人源化2H7v511抗体是完整抗体时，它可以包含轻链氨基酸序列DIQMTQS PSSLSASV⑶RVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAT YYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID No. 64)禾口SEQ ID No. 66 的重链氨基酸序列或EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMH WVRQAPGKGLEffVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSYRYWYFDVff GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISK AKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID No. 72)。本文的“B细胞恶性瘤”包括非何杰金(Hodgkin’ s)淋巴瘤(NHL)，包括低级/滤泡 NHL,小淋巴细胞(SL) NHL,中级/滤泡NHL，中级弥散性NHL，高级免疫母细胞NHL，高级淋巴母细胞NHL，高级小非凹陷性细胞NHL，bulky病NHL，套细胞淋巴瘤，AIDS-相关性淋巴瘤，和 Waldenstrom' s巨球蛋白血症；白血病，包括急性淋巴母细胞白血病(ALL)，慢性淋巴母细胞白血病(CLL)，毛细胞白血病和慢性髓母细胞白血病(chronic myeloblasticleukemia)； 和其它血液学恶性瘤。这些恶性瘤可以用抗B细胞表面标记，如CD20的抗体进行治疗。如本文所用的术语“非何杰金氏淋巴瘤”或“NHL”，指除了何杰金氏淋巴瘤之外的淋巴细胞的癌症。一般通过何杰金氏淋巴瘤中存在Reed-Sternberg细胞而非何杰金氏淋巴瘤中缺失所述细胞可以将何杰金氏淋巴瘤与非何杰金氏淋巴瘤区分开来。如本文所用的术语所包括的非何杰金氏淋巴瘤的实例包括任何可以由本领域技术人员(例如肿瘤学家或病理学者)按照本领域已知的分类方案来鉴定的疾病，所述分类方案如修订的欧美淋巴瘤(European-American Lymphoma) (REAL)方案，描述于 Color Atlas of ClinicalHematology, Third Edition ；A.Victor Hoffbrand and John E.Pettit(eds.) (Harcourt Publishers Limited 2000)(具体参见图 11. 57，11. 58 和 / 或 11. 59)。更具体的实例包括但不限于，复发性或难治性NHL，前线(front line)低级NHL，III/IV期NHL，化疗耐受型NHL，前体B成淋巴细胞白血病和/或淋巴瘤，小淋巴细胞淋巴瘤，B细胞慢性淋巴细胞白血病和/或前淋巴细胞(prolymhocytic)白血病和/或小淋巴细胞淋巴瘤，B细胞前淋巴细胞淋巴瘤，免疫细胞瘤和/或淋巴浆细胞淋巴瘤，边缘区B细胞淋巴瘤，脾边缘区淋巴瘤，结节外边缘区-MALT淋巴瘤，结节边缘区淋巴瘤，毛状细胞白血病，浆细胞瘤和/或浆细胞骨髓瘤，低级/滤泡淋巴瘤，中级/滤泡NHL，套细胞淋巴瘤，滤泡中心淋巴瘤(滤泡样(follicular))，中级弥散型NHL，弥散型大B细胞淋巴瘤，浸润性NHL(包括浸润性前线 NHL和浸润性复发NHL)，自体同源干细胞移植后复发性或难治性NHL，原发性纵隔大B细胞淋巴瘤，原发性渗出淋巴瘤，高级成免疫细胞NHL，高级成淋巴细胞NHL，高级小非凹陷性细胞NHL，bulky病NHL，Burkitt' s淋巴瘤，前体(外源)T细胞淋巴母细胞白血病和/或淋巴瘤，成人T细胞淋巴瘤和/或白血病，T细胞慢性淋巴细胞白血病和/或前淋巴细胞白血病，大颗粒淋巴细胞白血病，蕈样肉芽肿病和/或Sezary综合征，结节外天然杀伤/T细胞 (鼻型)淋巴瘤，肠型T细胞淋巴瘤，肝脾型T细胞淋巴瘤，皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤，皮肤淋巴瘤，间变性(anaplastic)大细胞淋巴瘤，血管中心性淋巴瘤，肠T细胞淋巴瘤，外周T细胞(未另外指定)淋巴瘤和血管免疫母细胞型T细胞淋巴瘤。 在本文中“自身免疫疾病”是源自或针对个体自身组织或其共分离物或临床表现，或缘自其病症的疾病或紊乱。自身免疫疾病或紊乱的实例包括，但不限于关节炎(类风湿性关节炎，幼年型类风湿性关节炎，骨关节炎，银屑病关节炎，和关节强硬性脊椎炎)， 银屑病，皮炎包括特应性皮炎、慢性特发性荨麻疹，包括慢性自身免疫荨麻疹，多肌炎/皮肌炎，毒性表皮坏死溶离，硬皮病(包括系统性硬皮病)，硬化症如进行性系统硬化症，炎性肠病(IBD)(例如，克罗恩氏病，溃疡性结肠炎，自身免疫炎性肠病)，坏疽性脓皮病，结节性红斑，原发性硬化性胆管炎，巩膜表层炎)，呼吸窘迫综合征，包括成人呼吸窘迫综合征 (ARDS)，脑膜炎，IgE-介导的疾病如过敏性和变应性和特应性鼻炎，脑炎如Rasmussen氏脑炎、葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎，大肠炎如显微镜结肠炎和胶原样结肠炎，血管球性肾炎(GN)如膜性GN(膜性肾病)，先天性膜性肾病，膜性增生性GN(MPGN)，包括I型和II 型，和快速进展性GN，过敏疾病，过敏反应，湿疹，哮喘，涉及T细胞和慢性炎性反应的疾病， 动脉粥样硬化，自身免疫心肌炎，白血球粘着不足，系统性红斑狼疮(SLE)如皮肤SLE，亚急性皮肤红斑狼疮，狼疮(包括肾炎型、大脑炎型、幼儿型、非肾型、平圆形、脱发型)，幼儿型(I型)糖尿病，包括幼儿胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)，成人糖尿病(II型糖尿病)，多发性硬化症(MS)如脊-眼(spino-opticaDMS，由细胞因子和T-淋巴细胞介导的与急性和延迟性过敏症相关联的免疫反应，肺结核，结节病，肉芽肿病包括淋巴瘤样肉芽肿病，韦格纳肉芽肿病，粒细胞缺乏症，脉管炎(包括大血管脉管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞 (Takayasu's)脉管炎)，中血管脉管炎(包括川崎病和多发性结节性动脉炎)，CNS脉管炎， 全身坏死性脉管炎，和ANCA-相关性脉管炎，如Churg-Mrauss脉管炎或综合征(CSS))，颞动脉炎，再生障碍性贫血，Coombs阳性贫血，Diamond Blackfan贫血，溶血性贫血或免疫性溶血性贫血包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)，恶性贫血，纯红细胞发育不全(PRCA)，因子VIII缺乏症，血友病A，自身免疫中性粒细胞减少症，全血细胞减少，白血球减少症，与白细胞渗出有关的疾病，CNS炎性疾病，多器官损伤综合症，抗原抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基膜病，抗磷脂抗体综合症，过敏性神经炎，白塞病，Castleman综合症、Goodpasture 综合征、雷诺氏综合症、干燥综合症、渗出性多形性红斑(Steven-Johnson syndrome), 类天疱疮比如大疱性类天疱疮、天疱疮(包括寻常型天疱疮(vulgaris)，落叶型天疱疮 (foliaceus)，禾口天疱疫粘膜类天疱疫(pemphigus mucus-membranepemphigoid))，自身免疫性多性发内分泌病，Reiter'氏病，免疫复合物性肾炎，慢性神经病如IgM多发性神经元炎或IgM介导的神经病，血小板减少症(例如由心肌梗塞患者发展的)，包括血栓性血小板减少性紫癜(TTP)和自身免疫性或免疫介导的血小板减少症如特发性血小板减少性紫癜(ITP)包括慢性或急性ITP，睾丸或卵巢的自身免疫疾病包括自身免疫睾丸炎和卵巢炎，原发性甲状腺功能减退，甲状旁腺机能减退，自身免疫内分泌疾病包括甲状腺炎如自身免疫甲状腺炎，慢性甲状腺炎(Hashimoto’ s甲状腺炎)，或亚急性甲状腺炎，自身免疫性甲状腺病，特发性甲状腺机能减退，阿狄森氏病，Grave氏病，多腺综合症如自身免疫性多腺综合症(或多腺内分泌综合症)，副肿瘤(paraneoplastic)综合征，包括神经学肿瘤伴随综合征如Lambert-Eaton肌无力综合征或Lambert-Eaton综合征，僵人综合症，脑脊髓炎如变态反应性脑脊髓炎，重症肌无力，小脑变性，边缘系统和/或脑干脑炎，神经性肌强直，斜视眼阵挛或斜视肌阵挛综合症(0MQ，和感觉性神经病，Sheehan综合征，自身免疫肝炎，慢性肝炎，狼疮样肝炎，慢性活动型肝炎或自身免疫性慢性活动型肝炎，淋巴样间质性肺炎(lymphoid interstitial pneumonitis)、闭塞性细支气管炎(非移植物)相对于NSIP，Guillain-Barre综合症，Berger氏病(IgA肾病)，原发性胆汁性肝硬变、口炎性腹泻(麸质肠病)，顽固性口炎性腹泻、疱疹样皮炎、冷球蛋白血症、肌萎缩性侧索硬化(ALS;Lou Gehrig氏病)，冠状动脉病，自身免疫性内耳疾病(AIED)，或自身免疫性听力损失、眼肌阵挛综合症(opsoclonus myoclonus syndrome) (OMS)，多发性软骨炎如顽固性多软骨炎，肺泡蛋白沉积症，淀粉样变性，巨细胞性肝炎，巩膜炎，非癌性淋巴细胞增多， 原发性淋巴细胞增多，其包括单克隆B细胞性淋巴细胞增多(例如，良性单克隆丙种球蛋白病和意义未确定的单克隆丙种球蛋白病，MGUS)，外周神经病，副肿瘤综合征，神经通路疾病(charmelopathies)如癫痫症，偏头痛，心律不齐，肌肉紊乱，聋，盲，周期性麻痹， 和中枢神经系统神经通路疾病，孤独症，炎性肌病，局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)，内分泌性眼病，葡萄膜视网膜炎(uveoretinitis)，自身免疫性肝病，纤维肌痛，多发性内分泌失调，Schmidt氏综合症，肾上腺炎，胃萎缩，老年性痴呆，脱髓鞘病，心肌梗塞后综合征 (Dressier，s syndrome)，脱发(alopecia) areata, CREST 综合症(钙质沉着，雷诺现象， 食管动力障碍(dysmotility)，指端硬化，和毛细血管扩张)，男性和女性自身免疫性不育， 强直性脊柱炎，混合结缔组织病，南美洲锥虫病，风湿热，反复流产，农民肺，多形性红斑，心脏切开后综合征，Cushing综合征，鸟类爱好者(bird-fancier' s)肺，阿尔波特氏综合征、肺泡炎如过敏性肺泡炎和纤维性肺泡炎，间质性肺病，输血反应，麻风病，疟疾，利什曼病，kypanosomiasis，血吸虫病，蛔虫病，曲菌病，Sampter氏综合症，Caplan综合征，登革热，心内膜炎，心内膜心肌纤维化，内眼炎，erythema elevatumet diutinum，胎儿成红细胞增多症(erythroblastosis fetalis)，嗜酸性粒细胞筋膜炎(eosinophilic faciitis), Shulman综合症，Felty综合征，flariasis,睫状体炎比如慢性睫状体炎，异时性睫状体炎， 或Fuch睫状体炎，Henoch-Schonlein紫癜，人免疫缺陷病毒(HIV)感染，埃可病毒感染， 心肌病，阿尔茨海默氏病，细小病毒感染，风疹病毒感染，免疫接种后综合症，先天性风疹感染，Epstein-Barr病毒感染，腮腺炎，Evan氏综合症，自身免疫性腺功能不良，Sydenham 舞蹈病，链球菌感染后肾炎，闭塞性血栓性脉管炎，甲状腺毒症(thyrotoxicosis)，脊髓痨 (tabes dorsalis)，和巨细胞多肌痛。 本文的“肿瘤坏死因子受体超家族”或“TNF受体超家族”指被TNF家族的细胞因子结合的受体多肽。一般，这些受体是在其细胞外结构域中具有一个或多个半胱氨酸富集重复序列的I型跨膜受体。TNF受体超家族可以进一步细分成(1)死亡受体；( 诱饵 (decoy)受体；和( 缺失死亡结构域的信号受体。“死亡受体”在其细胞质或细胞内区中包含“死亡结构域”，即作用来在细胞中转导能够导致凋亡或某些基因的诱导的信号的区域或序列。“诱饵受体”缺失功能性死亡结构域并且不能转导导致凋亡的信号。TNF基因家族中的细胞因子的实例包括肿瘤坏死因子-a (TNF-α )，肿瘤坏死因子-β (TNF_beta或淋巴毒素)，⑶30配体，⑶27配体，⑶40配体，0X-40配体，4-1BB配体，Apo-I配体(也称作 Fas配体或CD95配体)，Apo-2配体(也称作TRAIL)，Apo-3配体(也称作TWEAK)，护骨蛋白(osteoprotegerin) (OPG) ,APRIL, RANK 配体(也称作 TRANCE)，和 TALL-I (也称作 BlyS， BAFF或THANK)。TNF受体超家族中的受体的实例包括1型肿瘤坏死因子受体(TNFRl)，2 型肿瘤坏死因子受体(TNFR2)，p75神经生长因子受体(NGFR)，B细胞表面抗原⑶40，T细胞抗原0X-40，Apo-I受体(也称作Fas或CD95)，Apo-3受体(也称作DR3，swl-1, TRAMP和 LARD)，称作“跨膜激活剂和CAML-互作剂”或“TACI ”的受体，BCMA蛋白质，DR4，DR5 (或者称作 Apo-2 ；TRAIL-R2, TR6, Tango-63，hAP08, TRICK2 或 KILLER)，DR6, DcRl (也称作 TRID， LIT 或 TRAIL-R3)，DcR2 (也称作 TRAIL-R4 或 TRUNDD)，OPG, DcR3 (也称作 TR6 或 M68)，CARl， HVEM (也称作 ATAR 或 TR2)，GITR, ZTNFR-5, NTR-I，TNFLl，CD30，淋巴毒素 β 受体(LTBr)， 4-1ΒΒ 受体和 TR9 (ΕΡ988, 371Α1)。术语“Apo-2配体”，1口0-21/，，1口021/，^口0-2 配体/TRAIL”和“TRAIL”在本文中可以互换使用，指包括图M (SEQ ID No. 46)中所示氨基酸序列的氨基酸残基114-281的多肽序列，包括95-281，包括残基92-281，包括残基91-281，包括残基41-281，包括残基39-281， 包括残基15-281，或包括残基1481，以及以上序列的生物学活性片段，删除，插入，和/或取代变体。在一个实施方案中，所述多肽序列包含图24 (SEQ ID No. 46)的残基114481。任选地，所述多肽序列包含图M (SEQ ID No. 46)的残基92-281或残基91-281。Apo-2L多肽可以由图M(SEQ ID No. 45)中所示的天然核苷酸序列编码。任选地，编码残基(图M ； SEQ ID No. 45)的密码子可以是“CCT”或“CCG”。任选地，所述片段或变体是具有生物学活性的并且具有与任一种以上序列至少大约80%氨基酸序列同一性，或至少大约90%序列同一性，或至少95 %，96 %，97 %，98 %，或99 %序列同一性。该定义包括Apo_2配体的取代变体，其中它的天然氨基酸中的至少一个被其它氨基酸如丙氨酸残基所取代。该定义还包括分离自Apo-2配体来源或通过重组和/或合成方法制备的天然序列Apo-2配体。本发明的 Apo-2 配体包括在 1997-01-16 公布的 W097/01633，1997-07-17 公布的 W097/25428，公布的 July 22，1999-07-22 公布的 WO 99/365；35，2001-01-04 公布的 WO 01/00832，2002-02-07 公布的WO 02/09755，2000-12-14公布的WO 00/75191，和2000-02-29发布的美国专利号 6，030，945中公开的称作Apo-2配体或TRAIL的多肽。该术语一般用来指包括多肽的单体， 二聚体，三聚体，六聚体或高度寡聚体形式。除非另外特别声明，所用提及Apo-2L序列的氨基酸残基的编号都使用根据图M(SEQ ID No. 46)的编号。"Apo-2配体受体”包括本领域称作“DR4”和“DR5”的受体。Pan等人描述了称作〃 DR4"的TNF受体家族成员(Pan等人，Science，276 :111-113(1997)；还参见 1998-07-30 公开的 W098/32856 ； 1999-07-29 公开的 WO 99/37684 ；2000-12-07 公开的 WO 00/73349 ;2002-08-13 发布的 US 6，433，147 ;2002-10_08 发布的 US 6，461，823，和 2002-01-29 发布的 US 6,342,383) Sheridan 等人，Science, 277 :818-821(1997)和 Pan 等人，Science, 277 :815-818 (1997)描述了 Apo2L/TRAIL 的另一种受体(还参见，
1998-11-19公开的 W098/51793 ；1998-09-24 公开的 W098/41629)。这种受体称作 DR5 (或者该受体还被称作 Apo-2 ；TRAIL-R, TR6, Tango-63, hAP08, TRICK2 或 KILLER ；Screaton 等人，Curr. Biol.，7 :693-696(1997) ；Walczak 等人，EMBO J.，16 :5386-5387(1997) ；Wu 等人，Nature Genetics, 17 :141-143(1997) ；1998-08-20 公开的 W098/35986 ；1998-10-14 公开的 EP870, 827 ； 1998-10-22 公开的 W098/46643 ； 1999-01-21 公开的 W099/02653 ；
1999-02-25公开的 W099/09165 ； 1999-03-11 公开的 W099/11791 ；2002-08-13 公开的 US 2002/0072091 ；2001-12-07 公开的 US 2002/0098550 ；2001-12-06 发布的 US 6，313，269 ； 2001-08-02 公开的 US 2001/0010924 ；2003-07-03 公开的 US 2003/01255540 ；2002-10-31 公开的 US 2002/0160446, 2002-04—25 公开的 US 2002/0048785 ；2003-05—27 发布的 US6，569，642，2000-06-06 发布的 US 6，072，047，2003-11-04 发布的 US6, 642，358)。如上所述，Apo-2L的其它受体包括DcRl，DcR2，和0PG。当在本文中使用时术语“Apo_2L受体”包括天然序列受体和受体变体。这些术语包括在许多哺乳动物，包括人中表达的Apo-2L受体。Apo-2L受体可以如在许多人组织种系中天然发生的那样进行内源表达，或者可以通过重组或合成方法进行表达。“天然序列Apo-2L受体”包含具有与衍生自天然的Apo-2L受体相同的氨基酸序列的多肽。因而，天然序列Apo-2L受体可以具有来自任何哺乳动物，包括人的天然发生的Apo-2L受体的氨基酸序列。这种天然序列Apo-2L受体可以分离自天然或者能够通过重组或合成方法产生。术语“天然序列Apo-2L受体”具体包括天然发生的截短或分泌形式的受体(例如，包含，例如，细胞外结构域序列可溶形式)，天然发生的变体形式 (例如，其它剪切形式)和天然发生的等位基因变体。受体变体可以包括天然序列Apo-2L 受体的片段或删除突变体。图25A-C显示1998-11-19在W098/51793中公开的人DR5受体的411氨基酸序列，及其核苷酸序列(SEQ IDNos. 47和4 。人DR5受体的转录剪切变体是本领域已知的。这种剪切变体编码图26A-C中所示的人DR5受体的440氨基酸序列，及其核苷酸序歹Ij (SEQ ID Nos. 49and 50)，如 1998-08-20 在 WO 98/35986 中所公开的。本文中所用的“死亡受体抗体”一般指针对肿瘤坏死因子受体超家族中的受体，并且包含能够产生凋亡信号的死亡结构域的抗体，这类抗体包括DR5抗体和DR4抗体。以宽泛的意义使用“DR5受体抗体”，“DR5抗体”，或“抗DR5抗体”来意指结合至少一种形式的DR5受体或其细胞外结构域的抗体。任选地DR5抗体融合或连接到异源序列或分子上。优选地所述异源序列允许或有助于抗体形成较高级或寡聚复合物。任选地，DR5抗体结合DR5受体但不结合或与任何其它Apo-2L受体(例如DR4，DcRl，或DcR2)交叉反应。 任选地抗体是DR5信号活性的激动剂。任选地，如在BIAcore结合测定中所测量的，本发明的DR5抗体在大约0. InM到大约20mM的浓度范围上结合DR5受体。任选地，如在BIAcore结合测定中所测量的，本发明的DR5抗体显示大约0. 6nM到大约18mM的IC50值。仅仅对于本文的目的而言，术语“Apomab”指结合DR5并且包含SEQ IDNos. 55和 56的可变重和可变轻氨基酸序列的激动剂抗体。优选地Apomab分别包含SEQ ID Nos. 51 和52的重和轻链。II.抗体的生产可以根据本发明配制的抗体的生产技术如下。(i)抗原筛选和制备优选地，抗体结合的抗原是生物学上重要的糖蛋白并且将抗体施用给患疾病或病症的哺乳动物可以带来哺乳动物的治疗益处。不过，也考虑了针对非多肽抗原(如肿瘤相关糖脂抗原，见美国专利5，091，178)的抗体。在抗原是多肽时，其可以是跨膜分子(例如受体)或配体例如生长因子等。抗原的实例包括如肾素等分子；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子； 甲状旁腺激素；甲状腺刺激激素；脂蛋白；α "I"抗胰蛋白酶；胰岛素A-链；胰岛素-B链； 前胰岛素；卵泡刺激激素；降钙素；黄体激素；胰高血糖素；因子VIIIC、因子IX、组织因子 (TF)和vonWiIlebrands因子等凝血因子；蛋白C等抗凝血因子；心房利钠因子；肺表面活性物质；纤溶酶原激活剂，例如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)；蛙皮素；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子α和β ；脑啡肽酶；RANTES (调节对T细胞表达和分泌的正常激活)；人巨噬细胞炎症蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白，例如人血清白蛋白；苗勒管 (Muellerian)抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；前松弛素；小鼠绒毛膜促性腺激素相关肽；微生物蛋白，例如β内酰胺酶；DNase ；IgE ；细胞毒T淋巴细胞相关抗原(CTLA)，例如 CTLA-4;抑制素(inhibin)；激活素(activin)；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；蛋白A或D ；类风湿因子；神经营养因子，例如骨衍生神经营养因子(BDNF)，神经营养素_3、_4、-5或6 (NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)或神经生长因子，例如NGF- β ；血小板衍生的生长因子(PDGF)；纤维母细胞生长因子，例如aFGF和bFGF;表皮生长因子(EGF)；转化型生长因子(TGF)，例如 TGF- α 和 TGF- β，包括 TGF- β 1、TGF- β 2、TGF- β 3、TGF- β 4 或 TGF-β 5 ；胰岛素样生长因子 I 和 IKIGF-I 和 IGF-II) ；des (1-3)-IGF-I (脑 IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白；⑶蛋白，例如⑶3、⑶4、⑶8、⑶19和⑶20 ；促红细胞生成素；骨诱导因子(osteoinductivefactor)；免疫毒素；骨形态发生(morphogenetic)蛋白(BMP)；干扰素，例如干扰素-α、- β和γ ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF ；白细胞介素(IL)，例如IL-I到IL-10 ；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变(decay) 加速因子；病毒抗原，例如AIDS包膜的一部分；转运蛋白；归巢受体；粘着素；调节蛋白；整合素，例如 CDlla、CDllb、CDllc、CD18、ICAM、VLA-4 和 VCAM ；肿瘤相关抗原，例如 HER2、HER3 或HER4受体；以及上述任何多肽的片段。本发明所包含的抗体的例示性分子靶标包括⑶蛋白质如⑶3，⑶4，⑶8，⑶19， CD20, CD22, CD34和CD40 ；ErbB受体家族的成员如EGF受体，HER2，HER3或HER4受体；B 细胞表面抗原，如CD20或BR3 ；肿瘤坏死受体超家族的成员，包括DR5 ；前列腺干细胞抗原 (PSCA)；细胞粘附分子如 LFA-I，Macl，pl50. 95，VLA-4, ICAM-1，VCAM, α 4/β 7 整合素，和 α ν/β 3整合素包括其α或β亚基(例如抗⑶11a，抗⑶18或抗⑶lib抗体)；生长因子如VEGF及其受体；组织因子(TF)；肿瘤坏死因子(TNF)如TNF-α或TNF-β，α干扰素 (α-IFN)；白介素，如IL-8;IgE;血液组抗原；flk2/flt3受体；肥胖症(OB)受体;mpl受体；CTLA-4;蛋白质C等等。可以将可溶性抗原或其片段，任选地偶联到其它分子上，用作产生抗体的免疫原。 对于跨膜分子，如受体，可以将这些的片段(例如受体的细胞外结构域)用作免疫原。或者， 可以将表达跨膜分子的细胞用作免疫原。这类细胞可以来自天然来源(例如癌细胞系)或者可以是通过重组技术进行转化来表达跨膜分子的细胞。可以用于制备抗体的其它抗原及其各种形式对于本领域技术人员来说将是显而易见的。为产生HER2抗体，用于其生产的HER2抗原可以是，例如，HER2或其部分的细胞外结构域的可溶形式，其包含所需的表位。或者，可以使用在其细胞表面表达HER2的细胞(例如过表达HER2的经转化的NIH-3T3细胞；或癌细胞系如SK-BR-3细胞，参见Mancovski等人 PNAS (USA) 88 :8691-8695(1991))来生成抗体。(ii)单克隆抗体单克隆抗体获自一群基本上同质的抗体，S卩，包含该群的单个抗体是相同的和/ 或结合相同的表位，除了可以在单克隆抗体生产期间生成的可能的变体。因而，修饰语“单克隆”表明抗体并非不同抗体组合物的特性。例如，可以利用Kohler，自然256 :495(1975)首次描述的杂交瘤方法或者可以通过重组DNA方法(美国专利号4816567)制备单克隆抗体。在杂交瘤方法中，按上述方法免疫小鼠或其它适当的宿主动物，例如仓鼠，来诱导出产生或能够产生抗体的淋巴细胞，所述抗体可与免疫中应用的蛋白特异性结合。或者，可以将淋巴细胞在体外进行免疫，然后，用聚乙二醇等适当的融合剂将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞(Goding，单克隆抗体原理与应用，pp. 59-103 (Academic Press, 1986))。在适当的培养基中接种并培养如此制备的杂交瘤细胞，所述培养基优选包括一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺少次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，那么用于杂交瘤的所述培养基通常包括次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶核苷(HAT培养基)，这些物质可防止HGPRT缺陷型细胞的生长。优选的骨髓瘤细胞是那些可有效融合、支持所选抗体产生细胞稳定产生高水平抗体、并且对HAT等培养基敏感的骨髓瘤细胞。其中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，例如来源于M0PC-21和MPC-Il小鼠肿瘤的细胞系(得自Salk Institute Cell Distribution Center，圣迭戈，加利福尼亚，美国)和SP-2或)(63-Ag8-653细胞(美国典型培养物保藏中心，Rockville，马里兰，美国)。还有报道将人杂交瘤细胞和小鼠-人异质性杂交瘤细胞系用于制备人单克隆抗体(Kozbor，免疫学杂志，133 =3001(1984) ；Brodeur等， 单克隆抗体制备技术和应用，51-63页(Marcel Dekker，he.，纽约，1987))。测定杂交瘤细胞生长培养基中针对所述抗原的单克隆抗体的产生。优选地，通过免疫沉淀或体外结合试验，例如放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附试验(ELISA)，测定由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。单克隆抗体的结合亲和性可以，例如，通过Munson等人，Anal. Biochem.，107 220(1980)的katchard分析进行测定。在产生具有所需的特异性、亲和力和/或活性之抗体的杂交瘤细胞被鉴定之后， 可以通过有限稀释方法将所述克隆进行亚克隆，并通过标准方法进行培养(Goding，单克隆抗体原理和应用，pp. 59-103，Academic Press，1986))。用于此目的的适当培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可以在动物体内生长形成腹水瘤。通过常规免疫球蛋白纯化方法，例如蛋白A-kpharose，羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中适当分离。用传统的方法可容易地分离编码单克隆抗体的DNA并测定其序列(例如，利用能够与编码单克隆抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。所述杂交瘤细胞可作为此类DNA的优选来源。所述DNA —经分离，将其连接入表达载体，然后将载体转化入宿主细胞，例如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。有关在细菌中重组表达编码抗体的 DNA 的综述性论文包括 Skerra 等人，Curr. Opinion in Immunol.，5 :256-262(1993)和 Pluckthun, Immunol. Revs.，130 151—188(1992)。在另一个实施方案中，单克隆抗体或抗体片段可以从抗体噬菌体文库中分离，所述抗体噬菌体文库用在McCafferty等，自然348 =552-554中所述技术制备。Clackson等， 自然352 =624-628(1991)和Marks等，生物化学杂志222 :581-597(1991)分别叙述了利用噬菌体文库对鼠和人的抗体的分离。随后的文献叙述了高亲和力(nM范围)人抗体的产生，其通过链改组(chainshuffling) (Marks等，生物/技术，10 :779-783(1992))以及组合感染和体内重组作为构建很大的噬菌体文库的策略(Waterhouse等，核酸研究，21 2265-2^6(1993))。因此，对于单克隆抗体的分离，这些技术是传统的单克隆抗体杂交瘤技术的可替代方法。也可以对DNA进行修饰，例如，用编码人重链和轻链恒定区的序列取代其鼠同源序列(美国专利号4816567 ；Morrison等，美国国家科学院院刊81 :6851 (1984))，或通过将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价连接至免疫球蛋白的编码序列。通常这类免疫球蛋白多肽取代抗体恒定区，或取代抗体的一个抗原结合位点的可变区已产生嵌合型二价抗体，其包括一个特异性针对一种抗原的抗原结合位点，和具有针对不同抗原的特异性的另一个抗原结合位点。(iii)人源化抗体本领域已经描述了人源化非人抗体的方法。优选地，人源化抗体具有一个或多个被引入的非人类来源的氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基通常是“引入”的残基，其典型地来源于“引入”可变区。根据Winter和其同事的方法(Jones等，自然， 321 :522-525(1986) ；Riechmann 等，自然 332 :323-327(1988) ；Verhoeyen 等，科学 239 1534-1536 (1988))，通过用人抗体的相应序列取代鼠类⑶R或⑶R序列，可以基本上进行人源化。因此，这类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4816567)，其中基本上少于完整的人可变区的序列被来源于非人类物种的相应序列代替。实际上，人源化抗体一般是人抗体，其中一些⑶R残基和一些FR残基被噬齿类抗体中类似位点的残基代替。在制备人源化抗体中应用的人重链和轻链可变区的选择对于降低抗原性非常重要。根据所谓的“最适”方法，可在已知人可变区序列的完整文库中筛选啮齿类抗体的可变区序列。然后，将与啮齿类序列最相近的人的序列作为人源化抗体的框架(FR) (Sims等，免疫学杂志· 151 2296 (1993) ；Chothia等，分子生物学杂志· 196 :901 (1987))。另一种方法应用来源于特定亚组轻链或重链之所有人类抗体共同序列的特定框架。相同的框架可以用于若干不同的人源化抗体(Carter等，美国国家科学院院刊89 :4观5 (1992) ；I^esta等，免疫学杂志·，151 :2623(1993))。更为重要的是抗体被人源化且保留对抗原的高亲和力和其它良好的生物学活性。 为了达到此目的，根据优选的方法，利用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念上的人源化产物，通过此方法制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型为公众可获得且为本领域技术人员所熟知。已有能说明并显示所选候选免疫球蛋白序列可能的三维构象结构的计算机程序。观察这些显示结果可以分析所述残基在候选免疫球蛋白序列的功能中可能的作用，即分析能影响候选免疫球蛋白与抗原结合能力的残基。这样，可以从受体筛选 FR残基，并将其与重要的序列组合，以得到所需抗体特性，例如对靶抗原的亲和力增强。通常，CDR残基直接并且主要涉及对抗原结合的影响。WO 01/00245描述了结合HER2并且阻抑HER受体的配体激活的例示性人源化 HER2抗体的生产。本文的特定目标人源化抗体基本上与鼠单克隆抗体2C4 (或其Fab片段) 同样有效地阻抑EGF，TGF- α和/或HRG介导的MAPK的激活，和/或与鼠单克隆抗体2C4 (或其Fab片段)同样有效地结合HER2。本文的人源化抗体可以，例如，包含并入人可变重结构域的非人高度可变区残基，并且可以进一步包含选自69H，71H和73H位置上的框架区(FR) 取代，上述操作利用在Kabat 等人，Sequence of Protein of Immunologicallnterest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991) ψ^b 出的可变结构域编号系统。在一个实施方案中，人源化抗体包含在位置69Η，71Η和73Η位置中的两个或全部位置上的FR取代。本文的例示性的目标人源化抗体包含可变重结构域互补决定残基GFTFTDYTMX， 其中 X优选为 D 或 S (SEQ ID No. 7) ； DVNPNSGGSIYNQRFKG (SEQ ID No. 8)；和 / 或 NLGPSFYFDY (SEQ ID No. 9)，任选地包含那些⑶R残基的氨基酸修饰，例如其中所述修饰基本上保留或提高抗体的亲和性。例如，目标抗体变体可以在以上可变重CDR序列中具有从大约一个到大约七个或大约五个氨基酸取代。这类抗体变体可以通过，例如，如下所述的亲和性成熟来制备。最优选的人源化抗体包含SEQ IDNo. 4中的可变重结构域氨基酸序列。除了前段中的那些可变重结构域CDR残基之外，人源化抗体可以包含例如可变轻结构域互补决定残基KASQDVSIGVA(SEQ ID No. 10) ；SASYXXX，其中位置5上的X优选是R或 L，其中位置6上的X优选是Y或E，而位置7上的X优选是T或S(SEQ ID No. 11)；和/或 QQYYIYPYT(SEQID No. 1 。这类人源化抗体任选地包含以上⑶R残基的氨基酸修饰，例如其中所述修饰基本上保持或增强抗体的亲和性。例如，目标抗体变体可以在以上可变轻CDR 序列中具有从大约一个到大约七个或大约五个氨基酸取代。这类抗体变体可以通过，例如， 如下所述的亲和性成熟来制备。最优选的人源化抗体包含SEQ ID No. 3中的可变轻结构域氨基酸序列。本申请还涉及结合HER2并阻抑HER受体的配体激活的亲和性成熟抗体。亲本抗体可以是人抗体或人源化抗体，例如，分别包含SEQ ID Nos. 3和4的可变轻和/或重序列的抗体(即变体574)。亲和性成熟抗体优选地以优于鼠2C4或变体574(例如从大约两倍或大约四个倍，到大约100倍或大约1000倍增强亲和性，例如，如利用HER2-细胞外结构域 (E⑶)ELISA所评估的)的亲和性结合HER2受体。例示性的进行取代的可变重⑶R残基包括H28，H30, H34，H35，H64，H96，H99，或两个或多个的组合(例如这些残基的两个，三个，四个，五个，六个，或七个)。进行改变的可变轻⑶R残基的实例包括L28，L50, L53，L56，L91， L92，L93，L94，L96，L97或两个或多个(例如这些残基的两个，三个，四个，五个，高达大约十个)的组合。要求保护各种形式的人源化抗体或亲和性成熟抗体。例如，人源化抗体或亲和性成熟抗体可以是抗体片段，如Fab，其任选地与一种或多种细胞毒性剂偶联，以便生成免疫偶联物。或者，人源化抗体或亲和性成熟抗体可以是全长抗体，如全长IgGl抗体。(iv)人抗体除了进行人源化以外还可制备人类抗体。例如现在已能产生如下转基因动物 (如小鼠)，它们通过免疫能产生人类抗体的所有成分而不产生内源免疫球蛋白。例如， 有报道称，嵌合及种系(germ-line)突变小鼠中抗体重链连接区(Jh)基因的纯合缺失导致内源抗体的产生被完全抑制。将人类种系免疫球蛋白基因阵列转移到这类种系突变小鼠中将导致因抗原攻击而产生人类抗体。见，例如，Jakobovits等，美国国家科学院学报，90 :2551(1993) Jakobovits 等，自然，362 :255-258 (1993) ；Bruggermann 等，Year in Immuno. 7 :33(1993)；和美国专利号 5591669,5589369 和 5545807。
或者，可用噬菌体展示技术(McCafferty等，自然348 :552-553(1990))从未免疫供者的免疫球蛋白可变(V)区基因的所有组成而体外产生人类抗体和抗体片段。依据此技术，将抗体V区基因克隆在与丝状噬菌体(如M13或fd)主要或次要衣壳蛋白基因相同的框架内，并在噬菌体颗粒的表面展示为功能性抗体片段。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，根据抗体的功能特点进行的选择也导致对显示这些性质的抗体的编码基因进行选择。因此，噬菌体模仿了 B细胞的部分特点。噬菌体展示可以以多种形式进行；其综述见，例如，Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，结构生物学的最新观点(Current Opinion in Structural Biology) 3 :564-571 (1993)。可使用若干来源的 V 基因片段进行噬菌体展示。Clackson等，自然，352 =624-628(1991)从免疫小鼠脾脏来源的V基因的随机组合小文库中分离了抗-恶唑酮抗体的一个多样性阵列。可基本如Marks等，分子生物学杂志 222 :581-597 (1991)，或 Griffith 等，EMBO J. 12 :725-734(1993)所述构建未经免疫的人类供者V基因的所有组成，并分离针对抗原多样性阵列(包括自身抗原)的抗体。亦参见美国专利号5565332和5573905。如上所述，人类抗体也可通过体外活化的B细胞而产生(见美国专利5，567，610 和 5，229，275)。人类抗HER2抗体在1998年6月30日公布的美国专利577四97和1997年1月3 日公开的W097/00271中叙述。(ν)抗体片段已开发了生成抗体片段的多种技术。传统上，这些片段通过对完整抗体的蛋白水解性消化获得(见Morimoto等，生物化学和生物物理学方法杂志(Journal ofBiochemical and Biophysical Methods) 24 107-117 (1992))和 Brennan 等，科学，2 :81 (1985))。但现在可直接通过重组宿主细胞产生这些片段。例如，可从上述抗体噬菌体库分离抗体片段。或者，可从大肠杆菌直接回收Fab’_SH片段，并经化学连接形成F(ab’)2片段(Carter 等，生物/技术10 :163-167(1992)) 0依据另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养中分离 F(ab’)2片段。其它产生抗体片段的技术对本领域技术人员是显而易见的。在其它实施方案中，所选抗体是单链Fv片段(scFv) 0见W093/16185 ；美国专利5，571，894 ；和美国专利 5，587，458。抗体片段也可以是“线性化抗体”，如美国专利5，641，870所述。这类线性化抗体片段可以是单特异性或双特异性的。(vi)双特异性抗体双特异性抗体是具有针对至少两种不同表位的结合特异性的抗体。例示性的双特异性抗体可以与HER2蛋白的两种不同表位结合。其它这种抗体可将HER2结合位点与针对EGFR、HER3和/或HER4的结合位点组合。或者，可将抗HER2臂与结合白细胞上引发分子的臂结合，从而集中针对HER2表达细胞的细胞防御机制，所述引发分子如T细胞受体分子(例如 CD2 或 CD3)，或 IgG Fc 受体(Fe y R)如 Fc y RI (CD64)、Fc y RII (CD32)禾口 Fc Y RIII (⑶16)。双特异性抗体还可用于将细胞毒制剂定位至表达HER2的细胞。这些抗体具有HER2结合臂和结合细胞毒制剂(例如皂草素，抗INF-α，长春花生物碱，蓖麻毒蛋白A 链，氨甲蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。双特异性抗体可制备成全长抗体或抗体片段 (如F(ab，)2双特异性抗体)。WO 96/16673描述了双特异性HER2/Fc y RIII抗体，而在美国专利5837234中公开了双特异性ErbB2/Fc γ RI 抗体 IDMl (Osidem)。双特异性HER2/Fc α 抗体见W098/0M63。 美国专利5821337中教导了双特异性HER2/CD3抗体。MDX-210是双特异性HER2_Fc y RIII Ab。制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。完整双特异性抗体的传统制备方法是基于两种免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中这两条链具有不同特异性(Millstein 等，自然，305 :537-539(1983)).由于免疫球蛋白重链轻链随机分配，这些杂交瘤(细胞杂交瘤(quadroma))可能产生10种不同抗体分子的混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。对所述正确分子的纯化(通常通过亲和层析步骤来进行)非常复杂，且产量很低。 类似的方法见 W093/08^9 和 Traunecker 等，EMBO J, 10 :3655-3659 (1991)。依据不同的方法，将具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变区与免疫球蛋白恒定区序列融合。该融合优选与包含铰链区的至少一部分、CH2及CH3区的免疫球蛋白重链恒定区融合。优选使含有轻链结合所需位点的第一重链恒定区(CHl)出现在至少在一种融合中。可将编码免疫球蛋白重链融合体，以及必要时，编码免疫球蛋白轻链的DNA插入不同表达载体，共转染至适当宿主生物。这使得在使用非等比的三种多肽链进行构建的实施方案中，能较灵活地调整三种多肽片段的相互比例，以获得最佳产量。但也可在至少两种多肽链以等比例表达而获得高产时或所述比例无特别意义时，将两种或所有三种多肽链的编码序列插入一个表达载体中。在该方法的优选实施方案中，所述双特异性抗体由一条臂上的带有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和另一条臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。已发现这种不对称结构有利于从非必要免疫球蛋白链的混合中分离出所需双特异性化合物，因为只有该双特异性分子的一半上存在免疫球蛋白轻链，这使得分离更加容易。此方法公开于W094/04690中。制备双特异性抗体的进一步细节，见Suresh等，酶学方法，121 :210 (1986)。根据美国专利5，731，168所述的另一种方法，可改造一对抗体分子之间的界面， 使得从重组细胞培养中获得的异源二聚体的百分比最大。优选的界面包括抗体恒定区CH3 结构域的至少一部分。在该方法中，源于第一抗体分子界面上的一条或多条氨基酸小侧链被较大侧链(如酪氨酸或色氨酸)取代。与所述大侧链大小相同或相近的互补“沟”可通过将氨基酸大侧链用小侧链(如丙氨酸或苏氨酸)取代而在第二抗体分子的界面上形成。 这使得异二聚体的产量比不想要的终产物如同型二聚体的高。双特异性抗体包括交联抗体或“异源偶联的”抗体。例如，可使异源偶联物中的抗体之一与抗生物素蛋白偶联，使另一抗体与生物素偶联。有观点认为，这类抗体可用于将免疫细胞导向不想要的细胞(美国专利号4676980)，也可用于治疗HIV感染(W091/00360， W092/200373，EP03089)。异源偶联抗体可通过任何适当的交联方法制备。适当的交联制剂和多种交联技术为本领域已知，公开于美国专利号4676980中。从抗体片段制备双特异性抗体的技术也已有文献描述。例如，双特异性抗体可利用化学连接制备。Brerman等，科学229 :81(198 中描述了将完整抗体经蛋白水解制备 F(ab' )2片段的方法。这些片段在二巯基复合剂亚砷酸钠存在时被还原，从而稳定相邻的巯基，并阻止分子间二硫键的形成。生成的Fab'片段被转化为硫硝基苯甲酸盐(TM)衍生物。其中一种Fab' -TNB衍生物经巯基乙胺还原成Fab'-硫醇，再与等分子量的其它Fab' -TNB衍生物混合形成双特异性抗体。如此产生的双特异性抗体可作为酶的选择性固相化中所用的试剂。近期的进展促进了 Fab' _SH片段从大肠杆菌的直接回收，该片段可经化学偶联形成双特异性抗体。Sialaby等，实验医学杂志，175 :217-225(199 描述了完全人源化双特异性抗体F (ab' )2分子的产生。每一 Fab'片段分别从大肠杆菌中分泌出来，体外直接化学偶联形成双特异性抗体。如此制备的双特异性抗体能与过度表达HER2受体的细胞和正常人T细胞结合，还能引发人类细胞毒淋巴细胞对人乳腺肿瘤细胞的裂解活性。直接从重组细胞培养中制备并分离双特异性抗体片段的多种技术也已有描述。例如，可用亮氨酸拉链制备双特异性抗体。Kostelny等，免疫学杂志，148 (5) :1547-1553 (1992))。将来自Fos 和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽与两种不同抗体的Fab'部分通过基因融合而连接。使抗体的同型二聚体在铰链区被还原成单体，然后被再氧化形成抗体的异二聚体。该方法也可用于制备抗体同型二聚体。由Hollinger等，美国国家科学院学报，90 :6444-6448(1993))描述的“二价抗体”技术提供了另一种制备双特异性抗体片段的方法。所述片段中含有重链可变区(Vh)，其通过接头与轻链可变区相连，该接头非常短，使得同一链的两个结构域之间无法配对。因此，同一片段上的Vh和\结构域被迫与另一片段上的互补\和Vh结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。还报道了另一种用单链Fv (sFv) 二聚体来制备双特异性抗体的策略。见Gruber等，免疫学杂志，152 :5368 (1994)。考虑二价以上的抗体。如可制备三特异性抗体。Tutt等，免疫学杂志，147 60(1991)。(vii)其它氨基酸序列修饰考虑本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能需要改进抗体的结合亲和力和/ 或其它生物学特点。抗体的氨基酸序列变体可通过在抗体核酸中引入适当的核苷酸变化或通过肽合成制备。这类修饰包括例如抗体的氨基酸序列内残基的缺失、和/或插入和/或取代。可进行缺失、插入和取代的任何组合以获得最终的构建体，只要最终的构建体具有所需的特性。所述氨基酸变化还可改变抗体的翻译后加工过程，例如改变糖基化位点的数目或位置。一种鉴别抗体中处于诱变优选位置的某些残基或区域的有用方法是Cunningham 和ffells，科学M4 :1081-1085(1989)所述的“丙氨酸扫描诱变”。这里，鉴定一个残基或一组靶残基(例如，带电的残基如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸)并用中性或带负电的氨基酸取代(最优选丙氨酸或多聚丙氨酸)取代，以便影响氨基酸与抗原的相互作用。那些证实对取代具有功能敏感性的氨基酸位置通过在取代点引入进一步的或其他的变体而改进。因而，尽管引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，但突变本身的性质不必是预定的。例如，为分析在指定位点处突变的作用，在所述靶密码子或区域实行丙氨酸扫描或随机诱变，并筛选所表达的具有预期活性的抗体变体。氨基酸序列插入包括氨基-和/或羧基-端的融合(其长度从一个残基至包括 100个或更多残基的多肽)，以及序列内单个或多个氨基酸残基的插入。末端插入的例子包括带有N-末端甲硫氨酰残基的抗体或与细胞毒性多肽融合的该抗体。抗体分子的其它插入变体包括使该抗体的N-或C-末端与能增加该抗体的血清半衰期的酶或多肽融合。另一类变体是氨基酸取代变体。这些变体使抗体分子中至少一个氨基酸残基被不同残基取代。最有兴趣进行取代诱变的位点包括高变区，也可以考虑FR的改变。保守取代见表1的“优选取代”栏。如果这些取代引起生物学活性的改变，则可引入表1中“取代举例”栏的更实质性改变，或进一步在下文的氨基酸分类中所述的更实质性改变，并筛选产物。表 权利要求
1.一种稳定的药物制剂，其包括在组氨酸-醋酸盐缓冲液、PH 5. 5-6. 5中的单克隆抗体。
2.权利要求1的制剂，其中所述pH为从5.8到6. 2。
3.权利要求1的制剂，其中所述组氨酸-醋酸盐缓冲液浓度为从大约ImM到大约 200mMo
4.权利要求3的制剂，其中所述组氨酸-醋酸盐缓冲液浓度为从大约IOmM到大约 40mM。
5.权利要求1的制剂，其中所述抗体浓度为从大约lOmg/mL到大约250mg/mL。
6.权利要求5的制剂，其中所述单克隆抗体浓度为从大约20mg/mL到大约40mg/mL。
7.权利要求5的制剂，其中所述单克隆抗体浓度为从大约80mg/mL到大约250mg/mL。
8.权利要求1的制剂，其还包括糖。
9.权利要求8的制剂，其中所述糖是二糖。
10.权利要求8的制剂，其中所述糖是海藻糖。
11.权利要求8的制剂，其中所述糖是蔗糖。
12.权利要求8的制剂，其中所述糖浓度是从大约IOmM到大约1M。
13.权利要求12的制剂，其中所述糖浓度是从大约60mM到大约250mM。
14.权利要求1的制剂，其还包括表面活性剂。
15.权利要求14的制剂，其中所述表面活性剂是聚山梨醇酯。
16.权利要求15的制剂，其中所述表面活性剂是聚山梨醇酯20。
17.权利要求14的制剂，其中所述表面活性剂的浓度是从大约0.0001%到大约1. 0%o
18.权利要求17的制剂，其中所述表面活性剂的浓度是从大约0.01%到大约0. 1%。
19.权利要求1的制剂，其中所述单克隆抗体是全长抗体。
20.权利要求19的制剂，其中所述单克隆抗体是IgGl抗体。
21.权利要求1的制剂，其中所述单克隆抗体是人源化抗体。
22.权利要求1的制剂，其中所述单克隆抗体是包括抗原-结合区的抗体片段。
23.权利要求22的制剂，其中所述抗体片段是Fab或F(ab’)2片段。
24.权利要求1的制剂，其是无菌的。
25.权利要求1的制剂，其中所述单克隆抗体结合选自HER2，⑶20，DR5，BR3,IgE和 VEGF的抗原。
26.权利要求25的制剂，其中所述抗原是CD20而单克隆抗体是人源化的2H7。
27.权利要求25的制剂，其中所述抗原是VEGF而所述单克隆抗体是Bevacizumab。
28.权利要求1的制剂，其中所述单克隆抗体易于发生脱酰胺或聚集。
29.权利要求1的制剂，其在大约40°C保存至少4周的情况下是稳定的。
30.权利要求1的制剂，其在于大约5°C或大约15°C保存至少3个月的情况下是稳定的。
31.权利要求1的制剂，其在于大约_20°C保存至少3个月的情况下是稳定的。
32.权利要求1的制剂，其在冻融的情况下是稳定的。
33.权利要求1的制剂，其是水性的。
34.权利要求1的制剂，其是冷冻的。
35.权利要求1的制剂，其不是冻干的并且先前未对其进行过冻干。
36.权利要求35的制剂，其是水性的并可施用于受试者。
37.权利要求36的制剂，其中所述制剂用于经静脉内(IV)，皮下(SQ)或肌肉内(IM)给药。
38.权利要求37的制剂，其用于经IV给药，所述抗体浓度为从大约20mg/mL到大约 40mg/mLo
39.权利要求37的制剂，其用于SQ给药，所述抗体浓度为从大约80mg/mL到大约 250mg/mLo
40.一种带可被注射器穿透的塞子的小瓶，该小瓶中包含权利要求1的制剂。
41.权利要求40的小瓶，其保存于大约2-8°C。
42.权利要求40的小瓶，其是20cc或50cc的小瓶。
43.一种不锈钢罐，在罐中包含权利要求1的制剂。
44.权利要求43的罐，其中的制剂是冷冻的。
45.一种治疗受试者中的疾病或病症的方法，包括向受试者施用可有效治疗所述疾病或病症的量的权利要求1所述的制剂。
46.一种药物制剂，其包括(a)易于发生脱酰胺或聚集的全长IgGl抗体，其量为大约lOmg/mL到大约250mg/mL；(b)组氨酸-醋酸盐缓冲液，pH5. 5-6. 5 ；(c)选自海藻糖和蔗糖组成的组的糖，其量为大约60mM到大约250mM；知(d)聚山梨醇酯20，其量为大约0.01%到大约0.1%。
47.一种减少治疗性单克隆抗体的脱酰胺或聚集的方法，包括在组氨酸-醋酸盐缓冲液，pH 5. 5-6. 5中配制抗体。
48.权利要求47的方法，包括在抗体的配制之前或之后评估任何抗体脱酰胺或聚集。
49.一种药物制剂，其包含在pH大约5. 5到大约6. 5的组氨酸缓冲液中的结合HER2的结构域II的抗体，糖和表面活性剂。
50.权利要求49的制剂，其中缓冲液是组氨酸-醋酸盐。
51.权利要求49的制剂，其中HER2抗体包含分别在SEQID Nos. 3和4中的可变轻链氨基酸序列和可变重链氨基酸序列。
52.权利要求51的制剂，其中HER2抗体包含选自SEQID No. 15和23的轻链氨基酸序列，和选自SEQ ID No. 16和24的重链氨基酸序列。
53.权利要求49的制剂，其中制剂的pH为大约5.8到大约6. 2。
54.权利要求49的制剂，其中抗体结合HER2的结构域I、II和III之间的接合部。
55.权利要求49的制剂，其中抗体是全长抗体。
56.权利要求49的制剂，其中抗体浓度为大约20mg/mL到大约40mg/mL。
57.一种药物制剂，其包含大约20mg/mL到大约40mg/mL的量的Pertuzumab，组氨酸-醋酸盐缓冲液，蔗糖和聚山梨醇酯20，其中所述制剂的pH从大约5. 5到大约6. 5。
58.权利要求57的制剂，其包含大约30mg/mL的Pertuzumab，大约20mM的组氨酸-醋酸盐，大约120mM的蔗糖，和大约0. 02%的聚山梨醇酯20，其中所述制剂的pH为大约6. O。
59.一种带可被注射器穿透的塞子的小瓶，其中包含权利要求49的制剂。
60.一种不锈钢罐，在该罐中包含权利要求49的制剂。
61.一种治疗受试者中的HER2表达型癌症的方法，包括向受试者施用有效治疗所述癌症的量的权利要求49的药物制剂。
62.权利要求61的方法，其中将所述制剂经静脉内、皮下，或肌肉内施用给受试者。
63.制备药物制剂的方法，包括(a)制备权利要求1的制剂；和(b)评估该制剂中单克隆抗体的物理稳定性，化学稳定性或生物学活性。
64.一种药物制剂，其包括在pH大约5. 5到大约6. 5的组氨酸缓冲液中的DR5抗体，糖和表面活性剂。
65.权利要求64的制剂，其中所述缓冲液是组氨酸-醋酸盐。
66.权利要求64的制剂，其中DR5抗体是激动剂抗体。
67.权利要求64的制剂，其中DR5抗体是Apomab。
68.权利要求67的制剂，其中DR5抗体包含SEQID No. 51的重链氨基酸序列和SEQ ID No. 52的轻链氨基酸序列。
69.权利要求64的制剂，其中所述制剂的pH为大约5.8到大约6. 2。
70.权利要求64的制剂，其中所述抗体是全长抗体。
71.权利要求64的制剂，其中所述抗体浓度为大约lOmg/mL到大约30mg/mL。
72.一种药物制剂，其包含从大约lOmg/mL到大约30mg/mL的量的Apomab，组氨酸-醋酸盐缓冲液，海藻糖和聚山梨醇酯20，其中所述制剂的pH为大约5. 5到大约6. 5。
73.权利要求72的制剂，其包括大约20mg/mL的Apomab，大约20mM的组氨酸醋酸盐， 大约MOmM的海藻糖，和大约0. 02%的聚山梨醇酯20，其中所述制剂的pH为大约6. 0。
74.—种带可被注射器穿透的塞子的小瓶，其中包含权利要求64的制剂。
75.—种不锈钢罐，在该罐中包含权利要求64的制剂。
76.一种治疗受试者中癌症的方法，包括向受试者施用有效治疗所述癌症的量的权利要求64的药物制剂。
77.权利要求76的方法，其中所述癌症是实体肿瘤。
78.权利要求76的方法，其中所述癌症是非何杰金氏淋巴瘤。
79.权利要求76的方法，其中将所述制剂经静脉内、皮下，或肌肉内施用给受试者。
全文摘要
本发明涉及组氨酸-醋酸盐缓冲液中的抗体制剂，更具体地，本发明描述了抗体制剂，其包含在组氨酸-醋酸盐缓冲液中配制的单克隆抗体，以及包含结合HER2的结构域II的抗体(例如，Pertuzumab)的制剂，和包含结合DR5的抗体(例如，Apomab)的制剂。
文档编号A61K47/26GK102319430SQ20111004245
公开日2012年1月18日 申请日期2005年10月19日 优先权日2004年10月20日
发明者刘骏, 沈晔, 詹姆斯.D.安迪亚, 魏俊湘 申请人:健泰科生物技术公司