专利名称：一种针对人TNF-α分子的自体疫苗的构建方法
技术领域：
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及基因克隆、基因重组、外源基因在原核细胞中的表达、目的蛋白的纯化等技术领域，进一步涉及一种在体内能够诱导出针对人 TNF-α分子自身抗体的蛋白疫苗的构建方法。
背景技术：
1. TNF- α分子及抗TNF- α治疗的相关研究1.1TNF-α 分子1975年Carswell等发现，卡介苗和细菌内毒素感染的小鼠血清中有一种高活性的肿瘤细胞毒因子，可使肿瘤发生出血性坏死，但对正常组织细胞无杀伤活性，将其命名为肿瘤坏死因子——TNF- α。人TNF- α基因位于6号染色体，基因长41Λ，含4个外显子，与 MHC基因连锁，其前体由232个氨基酸组成，含有76个氨基酸的信号肽。小鼠基因位于17 号染色体，由4个外显子和3个内含子组成，前体由235个氨基酸组成。人和小鼠TNF-α前体有79%同源性，成熟型人TNF-α由157个氨基酸组成，分子量约为17KDa，较小鼠成熟型 TNF在73位多一个组氨酸残基。人和小鼠的成熟型TNF-α均含有两个半胱氨酸(人69、 101位；鼠69、100位)，可以形成分子内二硫键。从细胞株培养上清中分离纯化的TNF-α 在非还原条件下分子量大小不等，在还原条件下分子量为17KDa，与理论分子量一致。这可能是因为TNF-α以不同程度的聚合体形式存在的原因。目前已证实TNF-α活性形式是由 17KDa的亚基组成的同源三聚体。TNF-α是一种多功能的细胞因子。它除了能在体内、外杀伤肿瘤细胞外，还具有诱导炎症反应、抗病毒感染、调节机体免疫、促进细胞增殖和活化等多种功能。TNF-α对肿瘤具有直接抑制和细胞溶解作用，但不同肿瘤株对TNF-α的敏感性不同。TNF-α抗肿瘤机制不完全清楚，目前的研究结果表明TNF-α抗肿瘤的机制主要有(1)通过与肿瘤细胞TNF-α的表面受体结合而发挥细胞毒作用。目前已知的受体有两种，TNFR I和TNFR II，均为跨膜糖蛋白。TNFR I通过其胞浆区的约80个氨基酸残基的死亡区结构域(death domain, DD)介导肿瘤细胞的凋亡。(2)通过对血管内皮细胞的作用，诱导凝血因子的表达，增加纤溶酶原抑制剂的分泌，从而促进血管内凝血及血栓的形成，造成肿瘤组织的局部缺血而坏死。(3)通过介导杀瘤效应细胞的作用和诱导肿瘤局部的炎症反应，促进杀瘤效应细胞的作用。在抗病毒方面，TNF-α可以选择性的杀伤病毒感染的细胞，并对不同的病毒感染具有不同的作用。如对VSV、HSV等病毒具有抑制作用，但是对HIV具有促进作用。另外， TNF-α是重要的炎症因子，一方面它可以刺激内皮细胞表达MHC I类抗原和多种黏附分子的表达，促进IL-1、IL-6的表达，刺激内皮细胞和白细胞释放一系列炎症介质。另一方面 TNF-α可促进中性粒细胞、淋巴细胞及单核细胞黏附在内皮细胞上，从而参与炎症反应。 TNF-α还能够促进T、B细胞增殖，促进抗体产生；活化单核巨噬细胞，提高其杀伤活性；上调巨噬细胞MHC II类分子，提高抗原呈递能力等。1.2 抗 TNF-α 治疗研究发现，TNF-α在体内持续、高水平的表达时在多种疾病中发挥重要的作用， 如恶液质、胰岛素抵抗、感染性休克、炎症反应、自身免疫性疾病等。研制TNF-α拮抗药物为治疗TNF-α水平增高相关疾病提供了一条好的途径。传统的用于治疗体内TNF-α的过量表达相关疾病的药物主要有非甾类抗炎药 (NSAIDS)，缓解疾病的抗风湿药物(DMARD)，皮质留类、免疫抑制剂和止痛剂。近年来相继问世的新药有氨甲喋呤、来氟米特等。但上述药物均具有较明显的毒副作用。目前研究主要集中于TNF-α拮抗生物制剂，其疗效显著、副作用小。已发明的 TNF-α 拮抗药物有 infliximab、etanerc印t、adalimumab、CDP571 和 CDP870。前三种药物已通过FDA批准。Kanerc印t，是基因重组sTNFR75与人IgGFc段的融合蛋白，可同时抑制TNF-α和TNF-β，1998年11月被FDA批准用于治疗青少年RA和腰肌炎。Infliximab，是TNF-α中和性人鼠嵌和抗体，1999年被FDA批准用来治疗RA，后又用来治疗Crohn病。Adalimumab是完全人源化的TNF-α中和性IgGl单克隆抗体，可用于治疗RA和Crohn病。近年来的临床研究表明抗TNF- α在临床治疗RA取得了较好的疗效。2002年美国风湿病学会发布的RA治疗最新指南指出，早期RA患者和使用DMARDS治疗无效的患者对etanerc印t有效。使用足量氨甲喋呤不能控制的进行性活动性的RA患者， etanercept和infliximab联合使用有效，目前推荐单独使用infliximab或与氨甲喋呤联合治疗。TNF- α拮抗药物治疗除了可用于RA外，也可应用于其它TNF- α水平增高相关疾病的治疗，如，恶病质、克隆病、强直性脊柱炎、银屑病关节炎等。虽然，在临床上TNF- α单克隆抗体和可溶性受体具有较好的疗效，但是，这些药物存在有用药量大、需长期反复使用、易引起超敏反应的缺陷。除此之外，昂贵的药费也是阻碍此类药物广泛应用的原因。据统计，临床上每位接受etanerc印t治疗的病人平均年花费为1. 5万美元，接受Infliximab或Adalimumab治疗的病人平均年花费为9万美元，如此昂贵的药费即使在发达国家也是难以负担的。2.治疗性疫苗2.1研究进展近年来，针对人类自身蛋白的单克隆抗体在治疗急、慢性疾病的过程中显示出了良好的效果。但是，造价的昂贵和使用上的不便限制了单克隆抗体的广泛应用，因此，由被动地接受这种抗体蛋白转向寻求针对人类自身蛋白的主动免疫疫苗，即用主动免疫的治疗方式替代被动免疫，成为蛋白药物的发展方向。目前，治疗性疫苗的研究已成为一个热点， 涉及很多疾病，如慢性病毒感染、肿瘤、阿尔茨海默病、糖尿病、高血压、肥胖症以及风湿性关节炎等。治疗性疫苗使人的免疫系统发生有利于患者的反应。大部分的疫苗可以分为两大类一类是诱导机体发生体液免疫反应，产生抗体；另一类是诱导机体发生细胞免疫反应， 产生细胞毒性T细胞(CTLs)。后一类治疗性疫苗主要用于肿瘤和病毒感染性疾病的治疗。绝大多数的预防性疫苗都是通过诱导抗体的产生来保护机体的，这就证明通过诱导抗体来治疗感染性疾病是一种有效的治疗方法。与预防性疫苗相比，治疗性疫苗的发展相对缓慢，但是近几年单克隆抗体在治疗疾病方面所取得的巨大成功预示着治疗性疫苗有着广阔的发展前景。实际上，已经有动物试验表明诱导出一定水平的内源性特异性抗体来治疗疾病是可能的，如针对血管紧张素的疫苗可以治疗高血压；针对IL-9的疫苗可以治疗嗜酸性细胞增多症；针对IL-5的疫苗可以治疗哮喘；针对N-methyl-D-aspartate receptor-1 (NMDARl)的疫苗可以治疗中风。另外，针对一些性激素如人绒毛膜促性腺激素 (human chorionic gonadotro-pin HCG)的免疫可以降低妇女体内的激素水平而达到避孕效果；针对促性腺素释放激素(&iRH)的疫苗可以用于治疗晚期前列腺癌；在晚期胰腺癌病人中，利用治疗性疫苗诱导出针对胃泌素(gastrin)的抗体可以延长病人的生命。那么，治疗性疫苗的研究中存在哪些问题呢？最近在针对阿尔茨海默病的治疗性疫苗的研制过程所发生的情况似乎对这个问题做了回答。阿尔茨海默病是一种看起来非常适合用治疗性疫苗进行治疗的疾病，这种病的发病过程长达数年甚至数十年。如果能用治疗性疫苗诱导出持续时间较长的抗体的话，那么无疑是一种理想的治疗方法，尤其是这种病人经常忘记吃药。阿尔茨海默病的特征是大脑中斑块的沉积，这种斑块中含有A β -肽，这种A β -肽是从淀粉样蛋白的前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)衍生来的。在编码APP的基因发生突变导致Αβ-肽的生成增加的人群中，阿尔茨海默病在早年就开始发生了。表达这种突变的APP的转基因小鼠大脑内有大量的斑块沉积，这种斑块与阿尔茨海默病病人脑中发现的斑块相似。用Αβ -肽加上强免疫佐剂来免疫这种转基因小鼠会使小鼠脑中的斑块减少，小鼠的精神表现明显好转。随后，一种针对阿尔茨海默病的治疗性疫苗开始了临床试验，在临床I期试验证明其有良好的耐受性后，包括300多名病人的临床II期紧跟着开始了，但是没有想到的是6 %的试验对象由于产生无菌性脑炎而被迫停止试验。随后研究证实，这种副作用与抗体的滴度没有关系，实际上，一名没有产生抗体反应的受试病人也得了无菌性脑炎。另外，在一名病人的大脑中发现有大量的淋巴细胞浸润。这些研究结果与一种假说相一致，那就是在病人中发现的副作用是由于Αβ-肽特异性的T淋巴细胞引起的，而不是由于抗体引起的。这就要求能够研制出不引起T淋巴细胞介导的自身免疫的第二代疫苗。那么，这种针对阿尔茨海默病的治疗性疫苗的效果如何呢？在前面提到的临床II期试验中，在诱导出抗A β -肽抗体的病人中有一部分认知力的减弱确实推迟了，有一些病人甚至在接受治疗的这一年中意识状态有了好转。如果在疫苗设计时能够解决其安全性问题， 那么在不久的将来，针对阿尔茨海默病的治疗性疫苗就会出现。另一类稍有不同的疫苗对安全性的要求更低一些，那就是针对上瘾药物的疫苗。 在动物试验中针对可卡因和尼古丁的疫苗降低了这些药物在大脑中的水平，消除了它们的成瘾症状，试验动物在接受了免疫后对药物不再依赖。在临床I期试验中，可卡因疫苗被证明有良好的耐受性，并且可以诱导出良好的抗体反应，目前正在进行有效性验证。2. 2诱导自身抗体的理论研究针对自身蛋白的治疗性疫苗是如何诱导自身免疫系统产生针对自身蛋白的抗体呢？要产生足够高的滴度的特异性抗体以治疗相关疾病，治疗性疫苗必须克服三个障碍Τ 细胞耐受、B细胞耐受、在没有佐剂和抗原长效制剂的情况下诱导出抗体。众所周知，人体免疫系统主要是对外来入侵者发动攻击的，而对机体本身是不攻击的，这可能是由于机体具有能够识别“非我”与“自我”的能力。免疫系统的这种特性通常被称为耐受或无反应性。耐受发生在B细胞和T细胞水平。一般来说，T细胞耐受更严格一些。对许多抗原来说，在发生T细胞耐受的同时，正常的B细胞株却在体内存在。实际上，有三种机制导致了免疫耐受细胞株剔除，即特异性的淋巴细胞从淋巴细胞群中被彻底剔除；免疫无能，即特异性的淋巴细胞存在，但其功能不能被激活；免疫忽略，即具有免疫功能的淋巴细胞存在，但是由于没有遇到以抗原形式存在的自身抗原，所以不能被激活。对T细胞来说，诱导耐受和无能的主要器官是胸腺(中心耐受)，但诱导耐受也可以在外周进行。B细胞耐受主要在骨髓中诱导，但也可在外周诱导。通常，对于普遍表达的丰富抗原的免疫耐受更容易阐明。在针对外来抗原的免疫反应中，T细胞和B细胞互相配合才能有效地产生抗体当受到外来抗原免疫时，特异性的B细胞结合抗原，产生起始的激活信号。另外，B细胞内吞抗原，在其表面呈现抗原肽和MHC II类分子的复合物。通常，B细胞不能激活TH细胞。要激活TH细胞，树突状细胞是必不可少的，树突状细胞摄取抗原，并在其细胞表面呈递抗原肽和MHC II类分子的复合物，激活TH细胞。激活后的TH细胞识别B细胞表面呈现的抗原肽和MHC II类分子的复合物，引起B细胞增殖、抗体的产生以及抗体类别的转换。如果因为免疫耐受而缺乏TH细胞的协同作用，那么就不会产生抗体。在针对自身蛋白的疫苗的设计过程中，如果将自身抗原与外源蛋白或多肽载体融合或偶联在一起，就有可能绕过TH细胞耐受自身抗原特异性的B细胞就能够摄取该自身抗原以及与其相连的载体蛋白，并在其表面呈现载体肽与MHC II类分子的复合物，由于TH细胞对载体蛋白没有免疫耐受，所以能够被激活，从而协同自抗原特异性的B细胞产生针对自身抗原的特异性抗体。与T细胞耐受相比，B细胞耐受要宽松得多。实际上，在许多情况下，自身特异性 B细胞在体内以正常的频率出现，如果受到抗原和TH细胞的共同作用就会被激活。所以对许多可溶性自身蛋白来讲，体内存在其特异性B细胞株，尤其当这种蛋白不是非常富余表达的时候更是这样。对于这类蛋白或多肽，将其与载体蛋白相连，绕过T细胞耐受，就有可能产生有效的疫苗。实际上，利用这种策略，针对多种自身激素的抗体反应已经被诱导出来了。3. TNF- α自体疫苗的研究进展目前，TNF-α疫苗研究主要集中在筛选TNF-α抗原表位、融合蛋白疫苗和DNA疫苗几个方面。Sioud等用人TNF纯化类风湿关节炎病人的抗血清，得到具有TNF-α中和活性的TNF-α自身抗体，用此抗体筛选噬菌体随机九肽库，用筛选得到的噬菌体颗粒免疫小鼠，诱发了鼠抗人TNF-α抗体，研究表明重组噬菌体可作为疫苗研究的有效工具。Dalum等用T辅助细胞表位和TNF- α融合表达的蛋白免疫二型胶原诱导的关节炎小鼠模型，结果小鼠的症状得到了缓解，为类风湿关节炎和慢性感染疾病的治疗开辟了一条新途径。Blank 等用编码TNF-α的DNA免疫抗磷脂综合症的小鼠，在小鼠体内诱发了抗TNF-α抗体，这些抗体可以阻滞TNF-α引起的内皮细胞活性，抑制了单核细胞对活化的内皮细胞的黏附，与对照组相比可以明显的改善抗磷脂综合症小鼠的症状。Waterston等比较了 TNF-α单克隆抗体和TNF-α自体疫苗在治疗肿瘤转移的效果，结果表明两者在小鼠体内都可成功的减少肺肿瘤的转移。近来Waterston等通过一期临床试验评估了 TNF-α自体疫苗的免疫原性和安全性，不幸的是尽管疫苗诱发的血清抗体可以识别变性的人TNF-α分子，但是却不能中和天然状态的人TNF-α分子，分析原因可能是因为抗原的纯化过程中使抗原变性的原因。
以上研究表明，虽然TNF-α自体疫苗也是一种治疗TNF-α表达过高相关疾病的好方法，但是，筛选有效的T细胞辅助表位，适合的表位插入位置以及适合纯化方法都成为 TNF-α自体疫苗研究的关键性问题。针对以上问题，我们在前期的工作中以小鼠为模型，针对小鼠的TNF-α分子筛选了外源T细胞辅助表位的在小鼠TNF- α分子中的插入位置，并且筛选比对了不同的T细胞辅助表位。结果发现小鼠TNF-α分子128-140位氨基酸为最佳的外源分子的插入位置， PADRE为最为有效的插入表位。针对以上研究基础，本发明主要针对其对应的人TNF-α分子的自体疫苗进行构建、表达、纯化研究，旨在获得一种有效的针对人TNF-α分子的自体疫苗。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种制备人TNF-α自体疫苗分子的方法，此分子能够诱导出针对人TNF-α分子的特异性抗体，为TNF-α表达过高的相关疾病提供一种新的治疗药物。为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是一种体内诱导出针对人 TNF-α分子的自身抗体的蛋白疫苗的构建方法，其特征在于，将融合基因(TNF-ai_⑽一 PADRE-TNF-α 142_157)克隆入原核表达载体ρΕΤ2^的Nde I和Ml I多克隆位点之间，将获得的重组表达载体转化大肠杆菌BL21，诱导后表达产物为包涵体，经包涵体洗涤，凝胶过滤柱层析，透析复性，即可获得纯化的目的融合蛋白，将该一种体内诱导出针对人TNF-α分子的自身抗体的蛋白疫苗，在不使用佐剂的情况下免疫小鼠可产生高滴度抗人TNF-α自身抗体，其中所述融合基因序列为5 ’ -CATATGGTCAGATCATCTTCTCGAACCCCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGAGATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGCCTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTGCTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCCGTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGAGACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTCCA
GCTGCAATTGGCTAAATTCGTTGCTGCATGGACTCTGAAAGCTGCAGCTCTCGACTTTGCCGAGAGTGGGCAGGTCTACTTTGGGATCATTGCCCTGTGAGTCGAC-3’其基因的构建按以下步骤完成根据人TNF- α氨基酸序列以及PADRE氨基酸序列(AKFVAAWTLKA)，设计 hTNF-PADRE基因序列，基因序列中PADRE的插入位点为TNF-α的1 位后面，即用PADRE 编码序列取代人TNF129_141位氨基酸的编码序列；其中TNF- α的1-1 位氨基酸编码序列通过PCR扩增获得，并且在上游引入Nde I酶切位点(CATATG)，其中含有翻译起始密码子；下游引入Mim I酶切位点(CAATTG)；人工合成PADRE-TNF- α 142_157的编码序列，上下游分别引入Mun I和Sal I (GTCGAC)酶切位点， 另外在合成片段中将基因进行了两个点突变(Τ439 — A、C440 — G)；两段基因通过Mun I酶切位点进行连接，融合基因克隆入载体pET22b的Nde I和 Sal I酶切位点之间；
将上述表达载体转化大肠杆菌BL21，测序正确的质粒命名为pET22b-hTNF_PADRE， 工程菌命名为pET2^-hTNF-PADRE/BL21 ；其所述基因序列如下5 ’ -CATATGGTCAGATCATCTTCTCGAACCCCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAANde ICCCTCAAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGAGATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGCCTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTGCTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCCGTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGAGACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTCCAGCTGCAATTGGCTAAATTCGTTGCTGCATGGACTCTGAAAGCTGCAGCTCTCGACTTTGCCGAGMun IPADREAGTGGGCAGGTCTACTTTGGGATCATTGCCCTGTGAGTCGAC-3’。突变位点Sal I所述基因构建的工程菌的蛋白表达，按以下步骤完成挑取工程菌单菌落接种于 5mL新鲜LB培养基中，所述的LB培养液含Ampl00mg/L，37°C摇床培养过夜，次日以1 100 的比例再次转接到LB培养液中，在37°C摇床培养3h，至对数生长中期0D_为0. 4 0. 6， 加入ImM IPTG诱导，继续培养4h，离心收集菌体。所表达的融合蛋白的纯化复性，按以下步骤完成取含pET22b-hTNF-PADRE重组质粒的菌株大量诱导菌液，5000rpm离心lOmin，收菌，超声裂菌；4°C，12000rpm，离心20min，分别收集上清液和沉淀；取IOg发酵菌体，按Ig湿重对7ml的比例，将菌体彻底重悬于IOOmM Tris-HCl (7. 0), ImM EDTA 中，加入 1. 5mg/mL 溶菌酶，10ug/mL DNaseI, 20mM MgCl2 悬进行裂解；加入1. 5M NaCI,2% Triton X_100、20mM EDTA至初体积3倍，室温洗涤30min， 离心后再分别用 3 倍体积的 4M Urea, 2 % Triton X-100,20mM EDTA，0. IM Tris，和 8 倍体积的20mM EDTA，0. IM Tris洗涤；经洗涤的包涵体以Ig湿重对IOml的比例，溶于 50mmol/LTris. Cl pH 7. 0,5mmol/L β -巯基乙醇，lmmol/L EDTA，7mol/L 盐酸胍的缓冲液中，4°C搅拌过夜，12000r/min离心30min,收集上清，即为目的蛋白粗提液；Sephacryl S-100 (1.6cmX 100cm)凝胶层析，以工作液(7mol/L 盐酸胍，50mmol/L Tris. Cl pH 7.0， lmmol/L EDTA, 100mmol/L NaCl)充分平衡后，目的蛋白粗提液2ml上柱，以工作液洗脱， 流速lml/min，分部收集，测定蛋白质含量，并以SDS-PAGE确定目的蛋白所在位置，收集纯度较高的洗脱组分；将纯化目的蛋白组分对尿素进行梯度透析复性，梯度为，4M尿素，2M尿素，IM尿素，最后透析到双蒸水，离心留上清，冻干；HPLC检测复性后蛋白纯度。所述方法获取的融合蛋白，在不使用佐剂的情况下免疫小鼠可产生高滴度抗人 TNF-α自身中和性多克隆抗体。该抗体对于II型胶原诱导的类风湿性关节炎、LPS诱导的恶液质等小鼠模型具有良好的保护和治疗作用。该疫苗产生的抗体有望用于预防和治疗类风湿性关节炎和恶液质等。构建一种hTNF-α自体蛋白疫苗，其特征在于，制得的该疫苗含有hTNF_ α全序列，其中1四-141位氨基酸的编码序列被增强疫苗免疫原性的TT83ch844 (QYIKANSKFIGITEL)、 HEL46_61 (NTDGSTDYGILQ INSR)和 PADRE (AKFVAAWTLKA)等 T 辅助细胞表位肽所替换。
该疫苗能诱导机体产生高滴度的hTNF-α特异性的抗体，该抗血清在体外可以中和人TNF-α对细胞的杀伤作用。可以诱发高滴度抗人TNF-α自身抗体，为TNF-α 表达过高的相关疾病的免疫治疗提供一种新的蛋白质药物。上述hTNF-α自体多肽疫苗的制备方法，其特征在于，根据计算机软件辅助和hTNF-α截短体表达分析hTNF-α的表位肽结构域，最终以人TNF-α为模板，扩增 TNF- α ^128 位氨基酸的编码序列；人工合成 TT83Q_844-、HEL46_61_、PADRE-和 TNF-α 142_157 基因片段，扩增片段和合成片段之间通过引入Mim I (使得TNF-α的129-141位氨基酸被 PADRE等替代之外没有引入任何外源氨基酸)酶切位点进行连接并克隆入原核表达载体 pET22b的Nde I和Ml I多克隆位点之间。由于野生型基因不表达，所以我们通过分析转录后mRNA的二级结构，引入了一个同义突变(两个点突变)，使得原本不表达的目的基因的表达水平可高至菌体总蛋白的20%。表达产物为包涵体，经包涵体洗涤，凝胶柱层析，透析复性和纯化，即可获得纯化的目的蛋白PADRE-hTNF- α，该疫苗能诱导机体产生高滴度的 hTNF-α特异性的抗体，该抗体可以中和天然hTNF-a对于细胞的杀伤活性，当用于动物时对于恶液质以及类风湿性关节炎小鼠模型具有良好的保护作用。制备的具体内容是(以h TNF-PADRE为例)1.合成 TNF- a ^128-PADRE-TNf- a 142_157 基因序列其氨基酸序列为VRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQG CPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEK⑶RLSAEINRPDYLDF AESGQVYFGIIAL按照Gene-bank公布的hTNF- α的基因序列，5，端插入Nde I酶切位点，3，端并插入Mim I酶切位点，依据大肠杆菌偏爱的密码子，合成引物扩增获得目的基因hTNF-α H28155 ’ -CATATGGTCAGATCATCTTCTCGAACCCCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGAGATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGCCTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTGCTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCCGTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGAGACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTCCAGCTGCAATTG-3，合成PADRE-TNF- α 142_157的基因序列如下(两端分别加入Mun I和Ml I酶切位点)，3’端引进终止密码子TGA:5' -AATTGGCTAAATTCGTTGCTGCATGGACTCTGAAAGCTGCAGCTCTCGACTTTGCCGAGTCT
GGGCAGGTCTACTTTGGGATCATTGCCCTGTGAG-3’同时合成T细胞辅助表位PADRE的基因序列并在两端引入EcoR I和BamHI酶切位点，在5’端引入起始密码子ATG。合成的序列如下2.构建重组质粒 pET22b-PADRE_TNF-α以Nde I和Ml I两个限制性内切酶消化pET22b载体，1. 0 %琼脂糖凝胶电泳分离回收酶切大片段，并与经过Nde I和Mim I酶切的hTNF-α H28PCR产物以及合成 PADRE-TNF- α 142_157的退火产物进行连接，Τ4连接酶在16°C连接过夜，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，铺板、培养，挑取单克隆，进行酶切鉴定。得到含有目的基因片断的阳性克隆，称为 pET22b-TPT。3.重组蛋白的诱导表达、纯化与鉴定3. lpET-22b-PADRE-TNF- α /BL21 工程菌的诱导表达挑取工程菌单菌落接种于5mL LB培养液(含Ampl00mg/L)中，37°C摇床培养过夜， 次日以1 100的比例转接到含Amp的LB培养液中，在37°C摇床培养池至对数生长中期 (OD600为0. 4 0. 6)，加入ImM IPTG诱导表达后分别lh、2h、3h、4h、5h、6h收集菌体，以确定合适的诱导后时间，小规模培养及诱导后离心收集菌体，用SDS-PAGE检测目的蛋白的表达和存在形式。3. 2pET-22b-PADRE-TNF- α /BL21 工程菌的发酵从活化的LB平板上挑选单菌落接种于含LB的试管中，37°C培养10h，然后转种至含200ml LB的三角瓶中，37°C培养过夜。次日，将种子液接种于5L发酵罐。控制发酵温度 37°C、转速250 450rpm/min、通气量3 5L/min、ρΗ7· 3。培养至OD600 = 8左右时，加入 3mM IPTG进行诱导，继续培养4h，终止发酵，收集菌体、称重，-20°C冰箱保存备用。取少量菌体处理后，用SDS-PAGE检测目的蛋白的表达。3. 3目的蛋白包涵体的分离和洗涤取IOg发酵菌体，按Ig湿重对7ml的比例，将菌体彻底重悬于IOOmM Tris-HCl (7. 0), ImM EDTA 中，加入 1. 5mg/mL 溶菌酶，10ug/mL DNaseI, 20mM MgCl2 悬进行裂解；加入1. 5M NaCl,2% Triton X_100、20mM EDTA至初体积3倍，室温洗涤30min，离心后再分别用3倍体积的4M Urea, 2% Triton X_100，20mM EDTA，0. IM Tris，和8倍体积的 20mM EDTA，0. IM Tris洗涤。离心后的包涵体用7M盐酸胍进行溶解(加入20mM的β -巯基乙醇)。最终的包涵体通过kphacryl-100凝胶过滤层析进行纯化，纯化后的蛋白质进行尿素梯度离心复性已获得天然结构，从而可诱导高亲和力的中和抗体。3. 4表达产物变性条件下的纯化和复性经洗涤的包涵体以Ig湿重对IOml的比例，溶于5(toimol/L Tris. Cl pH 7.0， 5mmol/L3 -巯基乙醇，lmmol/L EDTA，7mol/L盐酸胍的缓冲液中，4°C搅拌过夜，12000r/min 离心30min,收集上清，即为目的蛋白粗提液。S印hacrylS-100 (1. 6cmX 100cm)凝胶层析， 以工作液(7mol/L 盐酸胍，50mmol/L Tris. Cl pH 7. 0, lmmol/L EDTA, 1 OOmmo 1/L NaCl)充分平衡后，目的蛋白粗提液2ml上柱，以工作液洗脱，流速lml/min，分部收集，测定蛋白质含量，并以SDS-PAGE确定目的蛋白所在位置，收集纯度较高的洗脱组分。将纯化目的蛋白组分对尿素进行梯度透析复性，梯度为，4M尿素，2M尿素，IM尿素，最后透析到双蒸水，离心留上清，冻干。HPLC检测复性后蛋白纯度。3. 5重组蛋白的鉴定3. 5. 1免疫原性及纯度的鉴定纯化的蛋白样品经15% SDS-PAGE，然后从凝胶电转移至硝酸纤维膜，BSA封闭后， 用一抗(小鼠抗人TNF-α单克隆抗体)结合lh，二抗(山羊抗小鼠IgG-HRP)结合30min， 最后用ECL系统显色，蒸馏水冲洗终止反应。结果显示hTNF-TT，hTNF-HEL, hTNF-PADRE可以特异的和小鼠抗人TNF-α单克隆抗体结合。纯化得到的TNF-TT、TNF-HEL, TNF-PADRE进行纯度鉴定。色谱柱为排阻色谱柱(7. 5mmX 300mm G2000SW column (TOSOH))，流动相液为 PBS，流速为 0. 5ml/min，检测波长为 ^Onm。结果纯度均大于95%。3. 5. 2残留天然TNF- α细胞杀伤活性实验将生长状态良好的小鼠细胞调至106/ml的细胞悬液，96孔培养板中每孔加入ΙΟΟμ 1细胞悬液，50ml/lC02、37°C培养过夜，弃上清，每孔加入系列稀释的复性后的 TNF-TT,5% C02、37°C培养16h，弃上清，每孔加入30 μ L的浓度为500 μ g/mL结晶紫染色 3-5min,用流水小心冲去结晶紫，甩干残余水分，每孔加入脱色液100 μ L，酶标仪570nm处测定吸光值。人TNF-α作为阳性对照，纯化的GST蛋白作为阴性对照。结果显示TNF-TT、 TNF-HEL, TNF-PADRE均无天然人TNF- α的细胞毒性。3. 5. 3动物免疫3. 5. 3. IBalb/c小鼠分组与免疫方案分组将25只雄性Balb/c小鼠分成5组，分别为佐剂组，hTNF组，hTNF-TT组， hTNF-HEL组和hTNF-PADRE组。在第4次免疫后10天摘眼球采血，测定血清中hTNF抗体效价。免疫方案背部皮下多点注射；30 μ g抗原/只；第1次使用完全佐剂，第2、3次和第4 次使用不完全佐剂，佐剂溶液总体积为200 μ L/只，分别隔周注射。3. 5. 3. 2 抗血清 ELISA 鉴定在第4次免疫后10天采血，收集抗血清，通过间接ELISA测定血清抗hTNF抗体效价。3. 5. 4TNF-PADRE对TNF- α诱导的恶病质模型的治疗3. 5.4. 1分组并免疫小鼠Balb/c小鼠，雄性，共30只，体重18_20g，按体重随机分两组，每10只一组，组间体重统计学无差异。A组TNF-PADRE组，抗原溶解于生理盐水中，50 μ g/ml，200 μ 1/只。B 组生理盐水组。免疫方案前三次背部皮下多点免疫，第4次腹腔免疫，免疫溶液体积为 200 μ 1/只，分别隔周注射。3. 5.4. 2模型的诱导免疫的小鼠按体重每组各取5只，体重27_28g，组间体重无统计学差异，每天腹腔注射小鼠TNF- α 1 X IO5IU/只，每天称量小鼠体重。免疫的小鼠按体重每组各取10只，体重27-30g，组间体重无统计学差异，每天腹腔注射小鼠TNF- α 2 X IO5IU/只，统计小鼠的生存期。3. 5. 5TNF-PADRE对II型胶原诱导的类风湿性关节炎小鼠模型的治疗3. 5.5. 1诱导剂的制备将II型胶原溶于0. IM醋酸制成^^/!!^的溶液，与等体积的完全弗氏佐剂(弗氏不完全佐剂加入终浓度ang/mL的卡介苗)混合后以注射器反复推吸乳化，配制成II型胶原终浓度为ang/mL的乳剂。3. 5. 5. 2动物的免疫从上海斯莱克动物中心购买5周龄的DBA-I近交系小鼠40只，随机分为四组， 每组10只。第一组免疫方法为皮下多点免疫，免疫剂量为100 μ L生理盐水/只，隔周免疫一次，共免疫四次。第二组免疫方法与第一组相同。第三组免疫方法为皮下多点免疫 hTNF-PADRE，免疫剂量为50ug/只。第四组为模型诱导当日免疫用于研究疫苗的治疗效果。隔周免疫一次，共免疫四次。3. 5. 5. 3模型的诱导和治疗免疫后10天，第一组小鼠每只尾根部皮内注射100 μ L生理盐水；其余三组小鼠每只尾根部皮内注射100 μ L诱导剂。诱导21天后第一组小鼠每只尾根部皮内再次注射50 μ L 生理盐水；其余三组小鼠每只尾根部皮内再次注射50 μ L相同的诱导剂。小鼠发病率统计第二次诱导后次日即开始统计II型胶原诱导的小鼠类风湿关节炎的发病率。结果如图8所示，与对照相比TNF-PADRE可以降低II型胶原诱导的小鼠类风湿关节炎的发病率。小鼠关节炎病变评分标准第二次诱导后次日即开始开始观察前后足肿胀程度并评分，以每只鼠前后关节病变评分为急性关节炎分数。关节炎指数(arthritis index,Al) 评分标准如下0分-无红肿；1分-关节稍肿；2分-关节轻度红、肿、热；3分-关节中度红、肿、热，轻度功能障碍；4分-关节重度红、肿、热，严重功能障碍，无法负重，晚期畸形。 累积4个踝关节的得分即为每只小鼠的关节评分。双尾T检验检验组间差异。结果如图8 所示，与对照相比TNF-PADRE可以降低II型胶原诱导的小鼠类风湿关节炎的小鼠关节炎病变评分。4.本发明的效果经实验证实本发明的效果如下(1)筛选并构建了人TNF-PADRE融合蛋白疫苗。(2)该疫苗保持了 TNF的免疫原性，去除了 TNF的天然生物活性。(3)获得了该疫苗的纯化工艺。(4)通过动物实验证实该融合蛋白能够在小鼠体内诱导出高滴度抗体。(5)初步证明了该蛋白作为肿瘤疫苗可在一定程度上可以减轻TNF诱导的恶病质小鼠模型的症状，减轻二型胶原诱导的类风湿性关节炎小鼠的症状。
图Ia是天然TNF的mRNA结构(部分复杂结构进行了放大)。图Ib是引入两个点突变优化后的mRNA结构。图加是PADRE_hTNF142_157基因合成，其中，“ 1，，是克隆载体酶切图，其中的小片段为目的序列，“ 2 ”是DNAMarker。图沘是MNF1M8扩增图，其中，“ 1 ”是DL2000DNA marker，“ 2 ”是阴性对照，“ 3 ”是
MNF1^8阳性扩增条带(箭头所示)。图3是pET22b-hTNF-TT/HEL/PADRE表达载体质粒酶切图，其中，“1”是 DL2000DNAmarker, “2” “4” 是 pET22b-hTNF_TT/HEL/PADRE 质粒 Nde I 和I 酶切结^ ο图 4 是 pET22b-hTNF-TT/BL21， pET22b-hTNF_HEL/BL21 和 pET22b_hTNF_PADRE/ BL21诱导表达结果，其中，“ 1 ”、“ 3 ”、“ 5 ”是未诱导菌体总蛋白，“ 2 ”、“ 4 ”是pET22b_hTNF_TT/ BL21 和 pET22b-hTNF-HEL/BL21 诱导，“6” “8” 是 pET22b_hTNF_PADRE/BL21 诱导 1 3 小时。图5是hTNF-PADRE的纯化结果，其中，“1”、“3”、“5”泳道为包涵体洗涤以后的结果，“ 2 ”、“ 4 ”、“ 6 ”泳道为纯化后结果。图 6 是 hTNF-TT、hTNF-HEL、hTNF-PADRE 纯化蛋白的 Western-blot 鉴定，其中，“Μ，， 是蛋白质标准分子量marker，“ 1 ”、“2”、“3”是hTNF_TT/HEL/PADRE诱导后菌体总蛋白。图7是hTNF-TT、hTNF-HEL、hTNF-PADRE的残存天然生物活性鉴定。图8是hTNF-PADRE对恶液质模型小鼠的保护作用。图9是hTNF-PADRE自体疫苗分子对二型胶原诱导的类风湿性关节炎小鼠的保护作用，其中，TNF-PADRE1为疫苗提前免疫的预防RA的效果，TNF-PADRE2是在诱导RA模型后给予疫苗的治疗效果。以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细描述。
具体实施例方式依照本发明的技术方案制备的人TNF治疗性自体疫苗，用编码 TT830-S44 (QYIKANSKFIGITEL), HEL46^61 (NTDGSTDYGILQINSR)和 PADRE (AKFVAAWTLKA)氨基酸的核酸序列替换人TNF-α 129位至141位氨基酸的核酸序列，从而获得hTNF_TT、hTNF_HEL、 hTNF-PADRE融合蛋白，纯化后免疫小鼠，比较这三种分子诱导针对hTNF- α抗体的滴度和中和hTNF- α活性的能力，筛选出hTNF-PADRE具有最好的免疫效果。用hTNF-PADRE重组蛋白免疫小鼠不仅可以减少天然TNF-α诱导的恶病质小鼠体重的减轻，同时还可以延长 mTNF-α诱导的恶病质小鼠的生存期；延长LPS诱导的急性肺损伤小鼠的生存期；减轻II 型胶原诱导的类风湿性关节炎的症状。其次重组人TNF-PADRE融合蛋白从而有可能在人体内产生抗人TNF-a自身抗体，为TNF-a表达过高的相关疾病的免疫治疗提供一种新的蛋白质药物。实现本发明疫苗的筛选，疫苗构建和纯化，免疫动物，抗体检定以及动物实验工作，按以下步骤完成1.疫苗的制备和筛选我们在前期的工作中以小鼠为模型，针对小鼠的TNF- α分子筛选了外源T细胞辅助表位的在小鼠TNF-α分子中的插入位置，并且筛选比对了不同的T细胞辅助表位。结果发现小鼠TNF-a分子128-141位氨基酸为最佳的外源分子的插入位置，PADRE 为最为有效的插入表位。针对以上研究基础我们用编码TT83ch844 (QYIKANSKFIGITEL)， HEL46^61 (NTDGSTDYGILQINSR)和 PADRE (AKFVAAWTLKA)氨基酸的核酸序列替换人 TNF-a 129 位至141位氨基酸的核酸序列，并在人TNF基因的439、440位引入两个点突变(图Ia是天然TNF的mRNA结构，图Ib是引入两个点突变优化后的mRNA结构)，从而获得hTNF-TT、 hTNF-HEL、hTNF-PADRE融合蛋白，具体方法如下1. lpET22b-TNF-TT、TNF-HEL, TNF-PADRE/BL21 工程菌的构建1. 1. 1TNF-TT, TNF-HEL, TNF-PADRE 基因的扩增和合成根据计算机软件辅助和hTNF- α截短体表达分析hTNF- α的表位肽结构域，最终以人TNF- α为模板，扩增TNF- a ^128位氨基酸的编码序列；人工合成TT83(1_844_、HEL46_61_、 PADRE-(替代TNF-a 129_141)和TNF-a 142_157基因片段，扩增片段和合成片段之间引入Mim I 酶切位点(使得TNF-α的129-141位氨基酸被PADRE等替代之外没有引入任何外源氨基酸)。最后获得的重组疫苗融合基因(TNF-a H28-PADRE-TNF-α 142_157)克隆入原核表达载体pET22b的Nde I和Ml I多克隆位点之间。由于野生型基因转录后的mRNA 二级结构比较复杂，不利于重组疫苗的表达，所以我们通过分析转录后mRNA的二级结构，引入了一个同义突变(两个点突变1^439 — A、C440 — G)，使得目的基因的mRNA结构更趋于简化和低能量状态(图Ia是天然TNF的mRNA结构，图Ib是引入两个点突变优化后的mRNA结构)。 基因序列见1. 1.4。1. 1. 2BL21感受态细胞的制备取BL21甘油菌种按1 100的比例接种入的LB培养基中，37 °C振荡培养过夜，次日转接一次，继续培养至0D_约0. 4左右。(无菌操作)将菌液冰浴lOmin，离心 (3000rpmX5min,4°C )后弃去上清，加入1/2体积预冷的IOOmmol/L CaCl2，轻轻吹起沉淀，冰浴40min，离心(3000rpmX5min，4°C )，弃上清后加入1/25体积的含25%甘油的 IOOmmol/L CaCl2，吹起沉淀，分装入Eppendorf管中，_70°C保存备用。1. 1. 3感受态细胞的转化、培养将大肠杆菌感受态细胞从-70°C中取出，冰浴融解5-10分钟，加入含有目的基因的pET22b，轻微混勻，继续冰浴30min，然后42°C热休克45s，最后再冰浴5min。然后铺板， 37 °C培养过夜。1. 1.4质粒的提取和鉴定在质粒转化后37°C过夜培养的培养皿上挑取边缘整齐，生长状态良好的克隆，接种到IOml含Amp的LB培养基中，37°C、200rpm培养他，用质粒提取试剂盒提取质粒，用Nde I和Mi I双酶切后，行琼脂糖凝胶电泳观察是否有插入片断以及插入的片断是否与预期的长度一致(图2a、图2b是质粒的构建，为了获得目的蛋白hTNF-PADRE，首先按照大肠杆菌偏爱密码子合成PADRE与hTNF142_156位氨基酸的编码序列 < 图加>，然后合成引物扩增 MWV128位氨基酸的编码序列 < 图2b> ；两个片段克隆入pET22b载体获得重组疫苗的表达质粒。图3是原核非融合表达质粒pET22b-hTNF-PADRE的酶切图谱。图2a、图2b中的两个片段与经过Nde I和Ml I酶切的pET22b载体连接，转化BL21感受态细胞后挑取阳性克隆提取质粒。重组质粒经限制性内切酶Nde I和Ml I酶切鉴定，得到相应的片断与预期大小相一致)，将酶切鉴定阳性的克隆送上海博亚公司进行DNA测序。相应的阳性工程菌分别命名为 pET22b-hTNF-TT/BL21，pET22b-hTNF_HEL/BL21 和 pET22b_hTNF_PADRE/BL21。全长人TNF-TT的基因序列(划线部分为TT表位的核酸序列，加粗部分分别为 NdeI、Mun I禾口 Nde I酶切位点)5’ -CATATGTGGTCAGATCATCTTCTCGAACCCCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGAGATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGCCTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTGCTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCCGTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGAGACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTCCAGCTGCAATTGCAGTACATCAAAGCTAACTCCAAATTCATCGGTATCACTCGAACTTCTCGACTTTGCCGAGAGTGGGCAGGTCTACTTTGGGATCATTGCCCTGTGAGTCGAC-3’全长人TNF-HEL的基因序列为(划线部分为HEL表位的核酸序列，加粗部分分别为Nde I、Mun I和Nde I酶切位点)
5，-CATATGGTCAGATCATCTTCTCGAACCCCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGAGATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGCCTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTGCTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCCGTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGAGACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTCCAGCTGCAATTGAACACTGACGGTTCCACCGATTACGGCATTCTGCAGATCAACTCCCGCCTCGACTTTGCCGAGAGTGGGCAGGTCTACTTTGGGATCATTGCCCTGTGAGTCGAC-3’全长人TNF-PADRE的基因序列为(划线部分为PADRE表位的核酸序列，加粗部分分别为Nde I、Mun I和Nde I酶切位点)5 ’ -CATATGGTCAGATCATCTTCTCGAACCCCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGAGATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGCCTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTGCTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCCGTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGAGACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTCCAGCTGCAATTGGCTAAATTCGTTGCTGCATGGACTCTGAAAGCTGCAGCTCTCGACTTTGCCGAGAGTGGGCAGGTCTACTTTGGGATCATTGCCCTGTGAGTCGAC-3’1.2重组疫苗蛋白表达、纯化和鉴定1. 2. lpET-22b-PADRE-hTNF α /BL21 工程菌的诱导表达含重组表达质粒的大肠杆菌BL21单菌落接种于5ml新鲜LB培养液(含氨苄青霉素100mg/L)中，摇床37°C培养过夜，次日以1 100的比例接种于新鲜LB培养液(含氨苄青霉素100mg/L)中，37°C继续培养至细菌密度达到OD6tltl = 0. 4 0. 6，加入ImMIPTG，诱导表达后分别lh、au3h、4h收集菌体，以确定合适的诱导时间，小规模培养及诱导后离心收集菌体，用SDS-PAGE检测目的蛋白的表达和存在形式，结果表明在理论分子量位置有新生蛋白质条带(图4)。1. 2. 2pET-22b-PADRE-hTNF α /BL21 工程菌的发酵从活化的LB平板上挑选单菌落接种于含LB的试管中，37°C培养10h，然后转种至含200ml LB的三角瓶中，37°C培养过夜。次日，将种子液接种于5L发酵罐。控制发酵温度 37°C、转速250 450rpm/min、通气量3 5L/min、ρΗ7· 3。培养至OD600 = 8左右时，加入 ImM IPTG进行诱导，继续培养4h，终止发酵，收集菌体、称重、-20°C冰箱保存备用。取少量菌体处理后，用SDS-PAGE检测目的蛋白的表达。结果表明蛋白质以包涵体形式表达。1.2.3重组包涵体蛋白的纯化和复性取IOg发酵菌体，按Ig湿重对7ml的比例，将菌体彻底重悬于IOOmM Tris-HCl (7. 0), ImM EDTA 中，加入 1. 5mg/mL溶菌酶，10ug/mL DNaseI, 20mM MgCl2;!:进行裂解；加入1.5M NaCl,2% Triton X_100、20mM EDTA至初体积3倍，室温洗涤30min，离心后再分别用 3 倍体积的 4M Urea, 2% Triton X_100，20mM EDTA，0. IM Tris，和 8 倍体积的 20mM EDTA，0. IM Tris洗涤。经洗涤的包涵体以Ig湿重对IOml的比例，溶于50mmol/LTris. Cl pH 7.0,5mmol/L β -巯基乙醇，lmmol/L EDTA，7mol/L盐酸胍的缓冲液中，4°C搅拌过夜，12000r/min离心30min，收集上清，即为目的蛋白粗提液。S印hacryl S-100 (1. 6cmX 100cm) 凝胶层析，以工作液(7mol/L盐酸胍，50mmol/L Tris. Cl pH 7. 0, lmmol/L EDTA, 1 OOmmo 1/L NaCl)充分平衡后，目的蛋白粗提液2ml上柱，以工作液洗脱，流速lml/min，分部收集，测定蛋白质含量，并以SDS-PAGE确定目的蛋白所在位置，收集纯度较高的洗脱组分。将纯化目的蛋白组分对尿素进行梯度透析复性，梯度为，4M尿素，2M尿素，IM尿素，最后透析到双蒸水，离心留上清，冻干。SDS-PAGE和HPLC检测复性后蛋白纯度(图5)。2.重组蛋白质的鉴定2. 1免疫原性(Western blot)及纯度(HPLC)的鉴定纯化的蛋白样品经15%聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后拆下凝胶，按照 Bio-Rad产品说明，将凝胶靠近阴极一侧、PVDF膜靠近阳极一侧，在预冷的转移缓冲液 (25mmol/L Tris-HCl, 192mmol/L Glycine，20% 甲醇)中 100V 恒压转移 lh，将蛋白转移至 PVDF 膜上。转移结束后，取出 PVDF 膜，洗涤液 TBSTQOmmol/L Tris .HCl pH7. 5,150mmol/ LNaCl,0. 05% Tween20)清洗后浸入封闭液(含2% BSA的TBST)中室温孵育lh。用一抗 (小鼠抗人TNF-α单克隆抗体，1 5000稀释)室温孵育lh，TBST洗膜3次，每次5min;再以二抗(山羊抗小鼠IgG_HRP，l 2000稀释)室温孵育30min，TBST洗膜3次，每次5min， TBS (不含有Tween20)洗膜3次，每次5min。最后用ECL系统显色，蒸馏水冲洗终止反应。 结果显示hTNF-TT，hTNF-HEL, hTNF-PADRE可以特异的和小鼠抗人TNF- α单克隆抗体结合 (图 6)。对纯化得到的TNF-TT、TNF-HEL, TNF-PADRE进行纯度鉴定。色谱柱为排阻色谱柱 (7. 5mmX 300mm G2000SW column (TOSOH)),流动相为 PBS，流速为 0. 5ml/min,检测波长为 ^Onm。结果纯度均大于95%。2. 2残留天然TNF- α细胞杀伤活性实验将生长状态良好的小鼠细胞调至106/ml的细胞悬液，96孔培养板中每孔加入100μ 1细胞悬液，50ml/lC02、37°C培养过夜，弃上清，每孔加入系列稀释的复性后的 TNF-TT,5% C02、37°C培养16h，弃上清，每孔加入30 μ L的浓度为500 μ g/mL结晶紫染色 3-5min,用流水小心冲去结晶紫，甩干残余水分，每孔加入脱色液100 μ L，酶标仪570nm处测定吸光值。人TNF-α作为阳性对照，纯化的GST蛋白作为阴性对照。结果显示TNF-TT、 TNF-HEL, TNF-PADRE均无天然人TNF- α的细胞毒性(图7)。3.动物免疫3. IBalb/c小鼠分组与免疫方案及抗血清ELISA鉴定分组将25只雄性Balb/c小鼠分成5组，分别为佐剂组，hTNF组，hTNF-TT组， hTNF-HEL组和hTNF-PADRE组。在第4次免疫后10天摘眼球采血，测定血清中hTNF抗体效价。免疫方案背部皮下多点注射；30 μ g抗原/只；第1次使用完全佐剂，第2、3次和第4 次使用不完全佐剂，佐剂溶液总体积为200 μ L/只，分别隔周注射。在第4次免疫后10天采血，收集抗血清，通过间接ELISA测定血清抗hTNF抗体效价。所需溶液的配制包被缓冲液碳酸盐缓冲液Na2CO3 0. 32g (终浓度 0. 015mol/L)
NaHCO3 0. 59g (终浓度 0. 035mol/L)纯水定容至200ml (pH 9. 6) 有效期两周
洗涤液含 0. 05 % Tween-20 的 PBS (pH 7. 4)封闭液含1 % BSA的洗涤液稀释液含0. 5 % BSA的洗涤液底物缓冲液Nei2HP04.12H20 1. 84g柠檬酸0. 51g纯水定容至 100ml (pH 5. 0)底物显色液0PD8mg30% H2O230 U 1底物缓冲液IOml终止液^2SO4lmol/L操作方法包被取96孔ELISA板，将抗原溶解于包被缓冲液中U g/ml)，加入板孔中 (IOOiil/孔)，4°C包被过夜。ヰ倒掉包被液，加入封闭液，37°C封闭池；ヰ弃去封闭液，用洗 涤液洗6次，毎次aiiin ；ヰ加入10倍倍比稀释的抗血清(从100倍起)，100 ii 1/孔，37°C孵 Ih ；ヰ弃去抗血清，用洗涤液洗6次，毎次aiiin ；ヰ加入HRP标记的抗小鼠的ニ抗，100 U 1/ 孔，37°C孵育Ih ；ヰ弃去ニ抗，用洗涤液洗6次，毎次aiiin;ヰ加入底物显色液，IOOiU/ 孔，37°C，显色10-20min ；—加入终止液，100 yl/孔，终止反应广酶标仪读数，測定每孔在 490nm的吸光值。3. 2TNF-PADRE对TNF- a诱导的恶病质模型的治疗3. 2.1分组并免疫小鼠Balb/c小鼠，雄性，共30只，体重18_20g，按体重随机分两组，每10只一組，组间 体重统计学无差异。A组TNF-PADRE组，抗原溶解于生理盐水中，50 u g/ml，200 U 1/只。B 组生理盐水組。免疫方案前三次背部皮下多点免疫，第4次腹腔免疫，免疫溶液体积为 200 iil/只，分别隔周注射。3. 2. 2模型的诱导免疫的小鼠按体重每组各取5只，体重27_28g，组间体重无统计学差异，每天腹腔 注射小鼠TNF- a 1 X IO5IU/只，每天称量小鼠体重。免疫的小鼠按体重每组各取10只，体重27_30g，组间体重无统计学差异，每天腹 腔注射小鼠TNF-a2X105IU/只，统计小鼠的生存期(图8)，与生理盐水组相比较，该重组 疫苗对于TNF诱导的DBA小鼠的恶液质模型具有显著的保护作用。小鼠的体重没有显著性 变化(阴性对照组体重减轻)；生存率明显优于生理盐水組。3. 3TNF-PADRE对II型胶原诱导的类风湿性关节炎小鼠模型的治疗3. 3. 1诱导剂的制备将II型胶原溶于0. IM醋酸制成％ig/mL的溶液，与等体积的完全弗氏佐剂(弗氏 不完全佐剂加入终浓度ang/mL的卡介苗)混合后以注射器反复推吸乳化，配制成II型胶 原终浓度为ang/mL的乳剤。3. 3. 2动物的免疫
从上海斯莱克动物中心购买5周龄的DBA-I近交系小鼠40只，随机分为四组， 每组10只。第一组免疫方法为皮下多点免疫，免疫剂量为100 μ L生理盐水/只，隔周免疫一次，共免疫四次。第二组免疫方法与第一组相同。第三组免疫方法为皮下多点免疫 hTNF-PADRE，免疫剂量为50ug/只。第四组为模型诱导当日免疫用于研究疫苗的治疗效果。 隔周免疫一次，共免疫四次。3. 3. 3模型的诱导和治疗免疫后10天，第一组小鼠每只尾根部皮内注射100 μ L生理盐水；其余三组小鼠每只尾根部皮内注射100 μ L诱导剂。诱导21天后第一组小鼠每只尾根部皮内再次注射50 μ L 生理盐水；其余三组小鼠每只尾根部皮内再次注射50 μ L相同的诱导剂。小鼠发病率统计第二次诱导后次日即开始统计II型胶原诱导的小鼠类风湿关节炎的发病率。结果如图9所示，与对照相比TNF-PADRE可以降低II型胶原诱导的小鼠类风湿关节炎的发病率。小鼠关节炎病变评分标准第二次诱导后次日即开始观察前后足肿胀程度并评分 (图9)，以每只鼠前后关节病变评分为急性关节炎分数。关节炎指数(arthritis index, Al)评分标准如下0分-无红肿；1分-关节稍肿；2分-关节轻度红、肿、热；3分-关节中度红、肿、热，轻度功能障碍；4分-关节重度红、肿、热，严重功能障碍，无法负重，晚期畸形。 累积4个踝关节的得分即为每只小鼠的关节评分。双尾T检验检验组间差异。结果如图9 所示，与对照相比TNF-PADRE可以降低II型胶原诱导的小鼠类风湿关节炎的小鼠关节炎病变评分。
权利要求
1.一种体内诱导出针对人TNF-α分子的自身抗体的蛋白疫苗的构建方法，其特征在于，将融合基因(TNF- α H28-PADRE-TNf- α 142_157)克隆入原核表达载体pET22b的Nde I和 Sal I多克隆位点之间，将获得的重组表达载体转化大肠杆菌BL21，诱导后表达产物为包涵体，经包涵体洗涤，凝胶过滤柱层析，透析复性，即可获得纯化的目的融合蛋白，将该一种体内诱导出针对人TNF-α分子的自身抗体的蛋白疫苗，在不使用佐剂的情况下免疫小鼠可产生高滴度抗人TNF-α自身抗体，其中所述融合基因序列为5’ -CATATGGTCAGATCATCTTCTCGAACCCCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGAGATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGCCTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTGCTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCCGTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGAGACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTCCAGCTGCAATTGGCTAAATTCGTTGGTGCATGGACTCTGAAAGCTGCAGCTCTCGACTTTGCCGAGAGTGGGCAGGTCTACTTTGGGATCATTGCCCTGTGAGTCGAC-3’
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其基因的构建按以下步骤完成根据人TNF- α氨基酸序列以及PADRE氨基酸序列(AKFVAAWTLKA)，设计hTNF-PADRE基因序列，基因序列中PADRE的插入位点为TNF-α的1 位后面，即用PADRE编码序列取代人TNF129_141位氨基酸的编码序列；其中TNF-α的1-1 位氨基酸编码序列通过PCR扩增获得，并且在上游引入Nde I酶切位点(CATATG)，其中含有翻译起始密码子；下游引入Mim I酶切位点(CAATTG)；人工合成PADRE-TNF- α 142_157的编码序列，上下游分别引入Mun I和Sal I (GTCGAC)酶切位点，另外在合成片段中将基因进行了两个点突变(Τ439 — A、C440 — G)；两段基因通过Mun I酶切位点进行连接，融合基因克隆入载体pET22b的Nde I和Sal I酶切位点之间；将上述表达载体转化大肠杆菌BL21，测序正确的质粒命名为pET22b-hTNF-PADRE，工程菌命名为pET2^-hTNF-PADRE/BL21 ；其所述基因序列如下5 ’ -CATATGGTCAGATCATCTTCTCGAACCCCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAA Nde ICCCTCAAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTCCTGGCCAATGG CGTGGAGCTGAGAGATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGCCTGTACCTCATCTACTCCCAG GTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTGCTCCTCACCCACACCATCAGCCGCA TCGCCGTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGA GACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTCCA GCTGCAATTGGCTAAATTCGTTGCTGCATGGACTCTGAAAGCTGCAGCTCTCGACTTTGCCGAG MunIPADREAGTGGGCAGGTCTACTTTGGGATCATTGCCCTGTGAGTCGAC-3’。 突变位点Sal I
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，按权利要求2所述基因构建的工程菌的蛋白表达，按以下步骤完成挑取工程菌单菌落接种于5mL新鲜LB培养基中，所述的LB培养液含Ampl00mg/L，37°C摇床培养过夜，次日以1 100的比例再次转接到LB培养液中，在 37°C摇床培养3h，至对数生长中期OD6tltl为0. 4 0. 6，加入ImM IPTG诱导，继续培养4h，离心收集菌体。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，按权利要求3所表达的融合蛋白的纯化复性，按以下步骤完成取含pET2^-hTNF-PADRE重组质粒的菌株大量诱导菌液，5000rpm离心lOmin，收菌，超声裂菌；4°C，12000rpm，离心20min，分别收集上清液和沉淀；取IOg发酵菌体，按Ig湿重对7ml的比例，将菌体彻底重悬于IOOmM Tris-HCl (7. 0), ImM EDTA 中，加入 1. 5mg/mL 溶菌酶，10ug/mL DNaseI，20mM MgCl2 悬进行裂解；加入 1. 5M NaCl,2% Triton X_100、20mM EDTA至初体积3倍，室温洗涤30min，离心后再分别用3倍体积的 4M Urea, 2% Triton X_100，20mM EDTA，0. IM Tris，和 8 倍体积的 20mM EDTA，0. IM iTris洗涤；经洗涤的包涵体以Ig湿重对IOml的比例，溶于50mmol/LTris. Cl pH 7.0， 5mmol/L β -巯基乙醇，lmmol/L EDTA, 7mol/L盐酸胍的缓冲液中，4°C搅拌过夜，12000r/ min离心30min，收集上清，即为目的蛋白粗提液；Sephacryl S-100 (1. 6cmX 100cm)凝胶层析，以工作液(7mol/L盐酸胍，50mmol/L Tris. Cl pH 7. 0, lmmol/L EDTA, 1 OOmmo 1/L NaCl) 充分平衡后，目的蛋白粗提液2ml上柱，以工作液洗脱，流速lml/min，分部收集，测定蛋白质含量，并以SDS-PAGE确定目的蛋白所在位置，收集纯度较高的洗脱组分；将纯化目的蛋白组分对尿素进行梯度透析复性，梯度为，4M尿素，2M尿素，IM尿素，最后透析到双蒸水，离心留上清，冻干；HPLC检测复性后蛋白纯度。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，按权利要求4所述方法获取的融合蛋白，在不使用佐剂的情况下免疫小鼠可产生高滴度抗人TNF-α自身中和性多克隆抗体。该抗体对于II型胶原诱导的类风湿性关节炎、LPS诱导的恶液质等小鼠模型具有良好的保护和治疗作用。该疫苗产生的抗体有望用于预防和治疗类风湿性关节炎和恶液质等。
全文摘要
本发明公开了一种体内诱导出针对人TNF-α分子的自身抗体的蛋白疫苗的构建方法，采用分步克隆方法构建hTNF-TT830-844，hTNF-HEL46-61，hTNF-PADRE的融合基因，并通过在天然人TNF基因中引入点突变(T439→A、C440→G)优化mRNA二级结构，融合基因克隆入pET22b原核表达载体，在大肠杆菌BL21菌株中获得高效表达。通过计算机辅助分析在hTNF的表位肽结构域之间引入三种T辅助细胞表位肽与hTNF-α融合而克服机体对于自体蛋白的免疫耐受，使得机体发生高水平的体液免疫反应，产生的高水平hTNF-α中和性多克隆抗体在体外可以中和hTNF-α对L929细胞的杀伤活性；其中hTNF-PADRE的免疫原性最强，在不使用免疫佐剂的情况下即可诱发高水平的抗体，该疫苗对于II型胶原诱导的类风湿性关节炎、LPS诱导的恶病质等小鼠模型具有良好的保护和治疗作用。
文档编号A61K39/395GK102370979SQ20111030394
公开日2012年3月14日 申请日期2011年10月10日 优先权日2011年10月10日
发明者万一, 张英起, 王增禄, 薛晓畅, 赵宁 申请人:中国人民解放军第四军医大学