专利名称：一种阿霉素缓释纳米颗粒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及以所用的非有效成分为特征的医用配制品，具体涉及持续释放型阿霉素药物。
背景技术：
阿霉素是一种蒽环类抗肿瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，从而阻止肿瘤细胞的生长，抗瘤谱较广，对多种肿瘤均有作用，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。对急性白血病、恶性淋巴瘤、乳腺癌、肉瘤、肺癌、膀胱癌等其它各种癌症都有疗效。目前临床给药多为静脉滴注，但阿霉素不能透过血脑屏障，且静注后该药迅速分布全身，有强烈的毒副作用，主要表现在心脏毒性，轻者表现为心律失常，重者出现进行性心肌病变而发生充血性心力衰竭；致白细胞和血小板减少，骨髓抑制；毛发脱落；消化道反应，恶心、食欲减退；药物溢出血管外可引起组织溃疡及坏死。这些毒副作用限制了阿霉素在临床化疗的广泛应用，尽管用药剂量很大，能达到病灶部位发挥疗效的比例却很低。为降低其毒性、提高疗效，阿霉素新剂型的研究成为亟待解决的问题。公开号CN101234205A的专利申请公开了一种“具有靶向功能的高分子阿霉素键合药纳米胶囊”，该纳米胶囊由两种聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物混合组装而成，其中一种嵌段共聚物的聚乳酸链端接有阿霉素，在纳米胶囊中的摩尔比例为98%-70%;另一种嵌段共聚物的聚乙二醇链端接有乳糖，在纳米胶囊中的摩尔比例为2-30%。上述专利申请所述方案中，连接在聚乳酸链段上的阿霉素处于胶囊内核，受聚乳酸和聚乙二醇的双重保护，具有缓释功能；连接在聚乙二醇链端的乳糖处于胶囊外层，具有靶向功能，使纳米胶囊优先进入携带乳糖受体的细胞。但是，由于所述的聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物不仅分子量较大而且是一种链状结构，因此绝大部分的链段是，一头缠绕包埋在纳米颗粒的内部，另一头显露在纳米颗粒的表面。那么，当阿霉素显露在纳米颗粒的表面时就失去了缓释作用，当乳糖基团被缠绕包埋在纳米颗粒的内部时就不具有靶向功能。此外，由于聚乳酸的乳酸分子间是由一个分子-OH与另一个分子的-COOH脱水缩合而成的，而这种酯键相连相对于阿霉素与聚乳酸之间的酰胺键连接较脆弱，在生物降解的过程容易出现断链，此时的阿霉素上往往会连着一段聚乳酸而影响药效。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种阿霉素靶向缓释纳米颗粒，该纳米颗粒具有靶向控释效果好的优点。本发明解决上述问题的技术方案如下所述一种阿霉素缓释纳米颗粒，该纳米颗粒按质量百分比包括阿霉素6-16%和黄瓜花叶病毒83-93%，其中所述的阿霉素经黄瓜花叶病毒的衣壳蛋白表面的微孔透过所述衣壳蛋白吸附在黄瓜花叶病毒的RNA上。本发明所述的阿霉素缓释纳米颗粒还可以进一步改进成具有靶向功能的缓释纳米颗粒，该改进的缓释纳米颗粒还包括质量百分比为1-2%的靶向基团叶酸，所述的叶酸键接在黄瓜花叶病毒的衣壳蛋白的表面。上述技术方案中，所述的阿霉素可以是阿霉素同分异构体或阿霉素衍生物；所述的黄瓜花叶病可采用植物病毒学方法从感染黄瓜花叶病毒的黄瓜叶中提取得到，具体提取方法可参照 Howard Scott 所公开的方法实施(Howard Scott,Purification of Cucumber Mosaic Virus, Virology,1963，20，103-106.)。上述阿霉素缓释纳米颗粒的制备方法由以下步骤组成(1)按植物病毒学方法从感染黄瓜花叶病毒的黄瓜叶中提取黄瓜花叶病毒，然后将其加入到稳定液中，使黄瓜花叶病毒在稳定液中的重量浓度为0. 5-5mg/mL，得到含黄瓜花叶病毒缓冲液；(2)取阿霉素加水溶解，使阿霉素在水中的重量浓度为0. 10-1. 25mg/mL，得阿霉素溶液；C3)将所制得的含黄瓜花叶病毒缓冲液与阿霉素溶液按1 1的体积比混合， 2-8°C下温浴12-16小时；然后用质量浓度为10% 40%的蔗糖溶液进行密度梯度离心，用长针头吸取载有阿霉素黄瓜花叶病毒区带，最后用稳定液洗涤，离心分离，收集沉淀物，冷冻干燥即得阿霉素缓释纳米颗粒；上述步骤(1)和(3)中所述的稳定液由乙二胺四乙酸与PH6-8的缓冲液组成，且乙二胺四乙酸在稳定液中的重量浓度为1. 5-;3mg/mL。上述具有靶向功能的缓释纳米颗粒的制备方法由以下步骤组成(I)将叶酸和分别为叶酸5-10倍质量的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳酰二亚胺盐酸盐及N-羟基琥珀酰亚胺溶于反应溶剂中，并使叶酸在反应溶剂中质量浓度为 0. 5-lmg/mL，室温下反应4小时，得经活化的叶酸溶液；其中，所述的反应溶剂为体积比是稳定液DMSO = 4:1的混合溶液；(II)取上述阿霉素缓释纳米颗粒的制备方法中所制得的阿霉素缓释纳米颗粒加入稳定液重悬，使载有阿霉素的黄瓜花叶病毒在稳定液中的浓度为0. 5-5mg/mL，加入等体积的步骤⑴所制得的叶酸溶液，2-8°C下温浴反应12-16小时，用质量浓度为10% 40% 的蔗糖溶液进行密度梯度离心，用长针头吸取叶酸修饰的载有阿霉素黄瓜花叶病毒区带， 最后用稳定液洗涤，离心分离，收集沉淀物，冷冻干燥即得具有靶向功能的缓释纳米颗粒；上述步骤(I)和(II)所述的稳定液由乙二胺四乙酸与pH 6-8的缓冲液组成，且乙二胺四乙酸在稳定液中的浓度为1. 5-;3mg/mL。本发明所述的阿霉素缓释纳米颗粒可按常规的方法制成注射剂和各种口服制剂， 以治疗恶性肿瘤。当将本发明所述的具有靶向功能的缓释纳米颗粒制备成注射剂时，治疗恶性腹水可采用腹腔内注射给药，治疗实体肿瘤可局部注射给药。由于黄瓜花叶病毒的衣壳蛋白为一种具有一定的刚性的自然分子支架，平均粒径 29nm(粒径分布观_30歷)，其表面还密布有微孔，因此利用正负电荷的吸引作用，阿霉素很容易透过所述的衣壳蛋白物理吸附或嵌合在黄瓜花叶病毒的RNA上。在所述正负电荷的吸引和衣壳蛋白保护的双重作用下，不仅阿霉素不会在黄瓜花叶病毒的RNA上脱落，而且大大延缓了阿霉素的释放速度。此外，相较与现有技术，不会出现键接药物粘连断链的高分子聚合载体的技术问题，因此可完全保持阿霉素的药理活性不受损。
由于叶酸的分子体积小且叶酸受体的亲和力高，而肿瘤组织上叶酸受体密度又显著高于正常组织，因此，本发明的进一步改进方案将叶酸键合在所述缓释纳米颗粒表面，赋予了所述缓释纳米颗粒的靶向功能，通过叶酸受体介导的内吞通路，叶酸键合的缓释纳米颗粒内的阿霉素被肿瘤选择性地吸收，显著降低了阿霉素的毒副作用。尤其是，本发明所述的黄瓜花叶病毒的衣壳蛋白为一种具有一定的刚性的自然分子支架，且其球状的三维空间结构的表面密布有氨基基团，因此，当叶酸分子的羧基基团被活化后，便很容易密集且均勻地键接于黄瓜花叶病毒的衣壳蛋白的表面，在“集束效应”的作用下，所述缓释纳米颗粒在肿瘤组织上的富集效果得以进一步提高。以下通过释药实验和疗效及毒性对比实验来进一步说明本发明所述阿霉素缓释纳米颗粒所能达到的技术效果。一、释药实验1、实验药品样品取实施例1所得阿霉素缓释纳米颗粒，加水使阿霉素在水中的浓度为 100μ g/mL0对照品取阿霉素用水稀释成100 μ g/mL。2、实验方法取样品50 μ L置于透析管中；取25mL pH为7. 4的PBS溶液为透析介质，将透析管放入透析介质中，于37°C下以100转/分钟搅拌透析；以1-8小时的时间间隔，每次定时取 200uL透析液，采用荧光分光光度法测定透析液中所释放的阿霉素含量。取对照品50 μ L采用上述相同透析和测定方法进行释药实验。上述样品和对照品的阿霉素释放曲线如图3所示。由图3可见，所述对照品在4小时内就爆性发释放50%，持续释放仅为M小时，而所述样品的持续释放时间长达5天以上，疗效持久，不需要频繁间断给药。二、心肌细胞毒性实验1、实验药品样品取实施例1所得阿霉素缓释纳米颗粒，加水使阿霉素在水中的浓度为 100 μ g/mLO对照品取阿霉素用水稀释成100 μ g/mL。2、实验方法取小鼠心肌细胞加入到20%胎牛血清的DMEM培养液中，调整小鼠心肌细胞至 1. 5X IO4个/mL ；将所配制的小鼠心肌细胞培养液接种于共聚焦培养皿中，每孔2mL，于 37°C,5% CO2及饱和湿度下培养M小时。将共聚焦培养皿的加样孔分成样品组和对照组， 每组设5个复孔；往样品组的每个加样孔中加入IOOuL样品，于37°C、5% CO2及饱和湿度下继续培养3小时。同样，往对照组的每个加样孔中加入50 μ L对照品，以同样的条件继续培养3小时。细胞培养3小时后，移除细胞培养液，用PBS液洗涤细胞三次后，用90%乙醇固定20分钟，再用PBS液洗涤细胞三次，接着用DAPI液染细胞核，再用PBS液洗涤细胞三次， 置于共聚焦显微镜下观察，实验结果见图4。由图4可见，对照品中游离阿霉素大量进入小鼠心肌细胞核中(左图)，与DAPI的蓝色荧光叠加使细胞核呈紫色；与对照品相比，样品中的黄瓜花叶病毒纳米颗粒(右图)显著减少了阿霉素在心肌细胞核中的聚集，从而减少了心脏毒性。
三、药效学实验1、实验药品样品取实施实例4所得具有靶向功能的缓释纳米颗粒，加水稀释至阿霉素在水中的的浓度为450-550ug/mL。对照品市售的阿霉素注射剂。2、实验方法取体重为18-22g/只的小鼠18只，将含0VCAR-3瘤细胞数为5*106个/mL的无菌生理盐水200 μ L注射至裸鼠腹腔进行接种，构建恶性卵巢癌腹水瘤模型，18天后腹水瘤便形成。将18只上述恶性卵巢癌腹水瘤小鼠随机均分为阴性对照组、治疗组和对照组；其中， 阴性对照组，不给药，治疗组按5mg/kg给以样品，对照组按5mg/kg给以阿霉素注射液剂。给药间隔为5天后，定期测量小鼠腹围，结果如图6所示。由图6可见，样品对卵巢癌细胞0VCAR-3细胞系腹水瘤模型有较好抑瘤作用。
图1为用黄瓜花叶病毒构建靶向控释体系示意图。图2为蔗糖密度梯度离心对照图，其中，左图为黄瓜花叶病毒，右图为包裹阿霉素的黄瓜花叶病毒。图3为用透析法测定本发明所述阿霉素缓释纳米颗粒释放的曲线图。图4为小鼠心肌细胞毒性实验的共聚焦显微照片，其中，左图为阿霉素的毒性实验结果，右图为阿霉素缓释纳米颗粒的毒性实验结果。图5为飞行时间质谱图，其中，A图为黄瓜花叶病毒的飞行时间质谱图，B图为本发明所具有靶向功能的缓释纳米颗粒的飞行时间质谱图。图6本发明所具有靶向功能的缓释纳米颗粒抑制裸鼠0VCAR-3腹水瘤的效果曲线图。
具体实施例方式实施例1 首先将乙二胺四乙酸溶于IOmM pH 7. 4的Tris缓冲液中，准备好乙二胺四乙酸浓度为2. 8mg/mL的稳定液后按以下步骤进行操作(1)按公知的植物病毒学方法从感染黄瓜花叶病毒的黄瓜叶中提取黄瓜花叶病毒，然后将其加入到稳定液中，使黄瓜花叶病毒在稳定液中的浓度为5mg/mL，得到含黄瓜花叶病毒缓冲液；(2)取阿霉素加水溶解，使阿霉素在水中的浓度为1. 25mg/m L，得阿霉素溶液；(3)将含黄瓜花叶病毒缓冲液和阿霉素溶液各ImL在4°C下混合温浴14小时；然后用质量浓度为10% 40%的蔗糖溶液进行密度梯度离心，用长针头吸取载有阿霉素黄瓜花叶病毒区带，最后稳定液洗涤，离心分离，收集沉淀物，冷冻干燥即得阿霉素缓释纳米颗粒。为了使公众进一步理解上述步骤(3)中所述蔗糖溶液进行密度梯度离心的作用和效果，本发明人将上述步骤(3)的离心管与采用同样的方法密度梯度离心黄瓜花叶病毒溶液的离心管放在一起拍摄了一张照片(见图2)。实施例2 首先将乙二胺四乙酸溶于IOmM pH6的磷酸盐缓冲液中，准备好乙二胺四乙酸浓度为ang/mL的稳定液后按以下步骤进行操作(1)按公知的按植物病毒学方法从感染黄瓜花叶病毒的黄瓜叶中提取黄瓜花叶病毒，然后将其加入到稳定液中，使黄瓜花叶病毒在稳定液中的浓度为^ig/mL，得到含黄瓜花叶病毒缓冲液；(2)取阿霉素加水溶解，使阿霉素在水中的浓度为0. 5mg/mL,得阿霉素溶液；(3)将含黄瓜花叶病毒缓冲液和阿霉素溶液各2mL在2°C下混合温浴16小时；然后用质量浓度为10% 40%的蔗糖溶液进行密度梯度离心，用长针头吸取载有阿霉素黄瓜花叶病毒区带，最后用稳定液洗涤，离心分离，收集沉淀物，冷冻干燥即得阿霉素缓释纳米颗粒。实施例3 首先将乙二胺四乙酸溶于IOmM pH8. 0的Tris缓冲液中，准备好乙二胺四乙酸浓度为1. 6mg/mL的稳定液后按以下步骤进行操作(1)按按公知的植物病毒学方法从感染黄瓜花叶病毒的黄瓜叶中提取黄瓜花叶病毒，然后将其加入到稳定液中，使黄瓜花叶病毒在稳定液中的浓度为2. %ig/mL，得到含黄瓜花叶病毒缓冲液；(2)取阿霉素加水溶解，使阿霉素在水中的浓度为0. ang/mL，得阿霉素溶液；(3)将含黄瓜花叶病毒缓冲液和阿霉素溶液各ImL在8°C下混合温浴12小时。然后用质量浓度为10% 40%的蔗糖溶液进行密度梯度离心，用长针头吸取载有阿霉素黄瓜花叶病毒区带，最后稳定液洗涤，离心分离，收集沉淀物，冷冻干燥即得阿霉素缓释纳米颗粒。实施例4 1.具有靶向功能的缓释纳米颗粒的制备将乙二胺四乙酸溶于10mM，pH7. 4的Tris缓冲液中，制得乙二胺四乙酸浓度为 2. 8mg/mL的稳定液，备用；取稳定液，加入1/4稳定液体积的DMSO得到反应溶剂，备用；将5mg叶酸和50mg 1_(3_ 二甲基氨基丙基)_3_乙基碳酰二亚胺盐酸盐及50mg N-羟基琥珀酰亚胺溶于5mL反应溶剂中，室温下反应4小时，得经活化的叶酸溶液；取实施例1所制得的阿霉素缓释纳米颗粒4. 56mg加入稳定液4mL重悬，加入上述活化的叶酸溶液4mL，5°C下温浴反应14小时后，用质量浓度为10% 40%的蔗糖溶液进行密度梯度离心，用长针头吸取叶酸修饰的载有阿霉素黄瓜花叶病毒区带，最后用稳定液洗涤，离心分离，收集沉淀物，冷冻干燥即得具有靶向功能的缓释纳米颗粒。2.具有靶向功能的缓释纳米颗粒中叶酸、阿霉素和黄瓜花叶病毒含量的测定(1)叶酸含量测定精密称取0. 0020g叶酸对照品，在IOmL容量瓶中用IOmM pH6. 8磷酸盐缓冲液溶解并定容至刻度，配制成200 μ g/ml的叶酸对照品贮备液。分别取上述对照品储备液0. ImL, 0. 2mL、0. 3mL、0. 4mL、0. 5mL、0. 75mL、lmL 置 IOmL 容量瓶中，用 10mM，pH6. 8 磷酸盐缓冲液定容摇勻，配成浓度分别为1、2、4、6、8、10、15、20μβ/πι1的对照品溶液。以10mM，pH6. 8磷酸盐缓冲液为参比，用1厘米石英池在360nm处分别测定每一份对照品溶液的吸光度，然后以吸光度Y对浓度X进行线性回归，得回归直线方程为Y = O. 0120X+0. 0521，R2 = 0. 9962。取所得具有靶向功能的缓释纳米颗粒^ig为样品，溶于4mL IOmM pH6. 8的磷酸盐缓冲液中，用1厘米石英池在360nm处测得其吸光度值为0. M41，再根据回归直线方程计算出样品中的叶酸含量为16μ g/mg。(2)阿霉素含量测定精密称取0. 0020g阿霉素对照品，在IOmL容量瓶中用IOmM pH6. 8磷酸盐缓冲液溶解并定容至刻度，配制成200 μ g/ml的阿霉素对照品贮备液。分别取上述对照品储备液
0.ImL,0. 2mL、0. 3mL、0. 4mL、0. 5mL、0. 75mL、lmL 置 IOmL 容量瓶中，用 IOmM pH6. 8 磷酸盐缓冲液定容摇勻，配成1、2、4、6、8、10、15、20μβ/πι1的对照品溶液。以10mM，pH6. 8磷酸盐缓冲液为参比，用1厘米石英池在495nm处分别测定每一份对照品溶液的吸光度，然后以吸光度Y对浓度X进行线性回归，得回归直线方程为Y = O. 0134X+0. 0696，R2 = 0. 9916。取所得具有靶向功能的缓释纳米颗粒Img为样品，溶于IOmL 10mMpH6. 8磷酸盐缓冲液中，用1厘米石英池在495nm处测得吸光度值为0. 2572，再根据回归直线方程计算出样品中的阿霉素含量为140 μ g/mg。(3) Lowry法黄瓜花叶病毒含量测定用美国Pierce公司的改良Lowry蛋白定量试剂盒中的标准蛋白为对照品，并其按照说明书进行实验操作配制标准蛋白浓度范围为10-1500yg/ml的一系列浓度不同的对照品溶液，用1厘米石英池在750nm处分别测定每一份对照品溶液的吸光度，然后以吸光度 Y对浓度X进行线性回归，得回归直线方程为Y = O. 0016X+0. 1871，R2 = 0. 9807。取所得具有靶向功能的缓释纳米颗粒Ojrng溶于0.4mL IOmM pH6. 8磷酸盐缓冲液中，加入2mL试剂盒中的改性Lowry试剂后混勻，室温下静置10分钟；接着加入0. ImL试剂盒中1. ON酚试剂混勻，室温下静置30分钟；用1厘米石英池在750nm处测得吸光度值
1.5311，再根据回归直线方程计算出样品中的黄瓜花叶病毒含量为840μ g/mg.。将上述质量比折算成质量百分含量可见本例中所得具有靶向功能的缓释纳米颗粒中，阿霉素的质量含量为14%，叶酸的质量含量为1.6%，黄瓜花叶病毒的质量含量为 84%。3.飞行时间质谱分析为进一步确证叶酸键接在黄瓜花叶病毒上，本例按下述方法进行黄瓜花叶病毒飞行时间质谱分析将具有靶向功能的缓释纳米颗粒重悬于水中，调节其中黄瓜花叶病毒的浓度为lmg/mL，取M μ L与6 μ L6M的盐酸胍水溶液混勻，用Ziptipei8脱盐后直接用质谱基质液洗脱，进行质谱分析，所得谱图见图5。由图5可见，黄瓜花叶病毒衣壳蛋白亚基的质荷比m/z为M140(见A曲线)，而叶酸修饰后黄瓜花叶病毒衣壳蛋白亚基质荷比m/z为 M563(见B曲线)，确证叶酸键接在黄瓜花叶病毒衣壳蛋白亚基上。实施例5 将乙二胺四乙酸溶于pH6. O的磷酸盐缓冲液中，制得乙二胺四乙酸浓度为2mg/mL的稳定液，备用；取稳定液，加入1/4稳定液体积的DMSO得到反应溶剂，备用；将％^叶酸和32mg 1_(3_ 二甲基氨基丙基)_3_乙基碳酰二亚胺盐酸盐及32mg N-羟基琥珀酰亚胺溶于5mL反应溶剂中，室温下反应4小时，得经活化的叶酸溶液；取实施例2所制得的阿霉素缓释纳米颗粒6mg加入稳定液3mL重悬，加入上述活化的叶酸溶液中加入3mL，2°C下温浴反应16小时后，用质量浓度为10% 40%的蔗糖溶液进行密度梯度离心，用长针头吸取叶酸修饰的载有阿霉素黄瓜花叶病毒区带，最后用稳定液洗涤，离心分离，收集沉淀物，冷冻干燥即得具有靶向功能的缓释纳米颗粒。将所得到的具有靶向功能的缓释纳米颗粒采用与实施例4同样的方法进行进行紫外-可见分光光度分析，测得其中，含阿霉素11%，黄瓜花叶病毒87 %，叶酸1. 3 %。实施例6 将乙二胺四乙酸溶于pH8. 0的Tris缓冲液中，制得乙二胺四乙酸浓度为1. 6mg/mL 的稳定液，备用；取稳定液，加入1/4稳定液体积的DMSO得到反应溶剂，备用；将3mg叶酸和15mg 1_(3_ 二甲基氨基丙基)_3_乙基碳酰二亚胺盐酸盐及15mg N-羟基琥珀酰亚胺溶于5mL反应溶剂中，室温下反应4小时，得经活化的叶酸溶液；取实施例3所制得的阿霉素缓释纳米颗粒^ig加入稳定液ImL重悬，加入上述活化的叶酸溶液中加入lmL，8°C下反应12小时后，用质量浓度为10% 40%的蔗糖溶液进行密度梯度离心，用长针头吸取叶酸修饰的载有阿霉素黄瓜花叶病毒区带，最后用稳定液洗涤，离心分离，收集沉淀物，冷冻干燥即得具有靶向功能的缓释纳米颗粒。将所得到的具有靶向功能的缓释纳米颗粒采用与实施例4同样的方法进行进行紫外-可见分光光度分析，测得其中，含阿霉素7 %，黄瓜花叶病毒92 %，叶酸1. 1 %。
权利要求
1.一种阿霉素缓释纳米颗粒，该纳米颗粒按质量百分比包括阿霉素6-16%和黄瓜花叶病毒83-93%，其中所述的阿霉素经黄瓜花叶病毒的衣壳蛋白表面的微孔透过所述衣壳蛋白吸附在黄瓜花叶病毒的RNA上。
2.根据权利要求1所述的一种阿霉素缓释纳米颗粒，其特征在于，所述的缓释纳米颗粒还包括质量百分比为1-2%的靶向基团叶酸，所述的叶酸键接在黄瓜花叶病毒的衣壳蛋白的表面。
3.一种制备权利要求1所述阿霉素缓释纳米颗粒的方法，该方法由以下步骤组成(1)按植物病毒学方法从感染黄瓜花叶病毒的黄瓜叶中提取黄瓜花叶病毒，然后将其加入到稳定液中，使黄瓜花叶病毒在稳定液中的重量浓度为0. 5-5mg/mL，得到含黄瓜花叶病毒缓冲液；(2)取阿霉素加水溶解，使阿霉素在水中的重量浓度为0.10-1. 25mg/m L，得阿霉素溶液；(3)将所制得的含黄瓜花叶病毒缓冲液与阿霉素溶液按1 1的体积比混合，2-8°C下温浴12-16小时；然后用质量浓度为10% 40%的蔗糖溶液进行密度梯度离心，用长针头吸取载有阿霉素黄瓜花叶病毒区带，最后用稳定液洗涤，离心分离，收集沉淀物，冷冻干燥即得阿霉素缓释纳米颗粒；上述步骤(1)和(3)中所述的稳定液由乙二胺四乙酸与pH6-8的缓冲液组成，且乙二胺四乙酸在稳定液中的重量浓度为1. 5-;3mg/mL。
4.一种制备权利要求2所述阿霉素缓释纳米颗粒的方法，该方法由以下步骤组成(I)将叶酸和分别为叶酸5-10倍质量的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳酰二亚胺盐酸盐及N-羟基琥珀酰亚胺溶于反应溶剂中，并使叶酸在反应溶剂中质量浓度为 0. 5-lmg/mL，室温下反应4小时，得经活化的叶酸溶液；其中，所述的反应溶剂为体积比是稳定液DMSO = 4:1的混合溶液；(II)取权利要求3所制得的阿霉素缓释纳米颗粒加入稳定液重悬，使载有阿霉素的黄瓜花叶病毒在稳定液中的浓度为0. 5-5mg/mL，加入等体积的步骤(I)所制得的叶酸溶液， 2-8°C下温浴反应12-16小时，用质量浓度为10% 40%的蔗糖溶液进行密度梯度离心，用长针头吸取叶酸修饰的载有阿霉素黄瓜花叶病毒区带，最后用稳定液洗涤，离心分离，收集沉淀物，冷冻干燥即得具有靶向功能的缓释纳米颗粒；上述步骤(I)和(II)所述的稳定液由乙二胺四乙酸与PH6-8的缓冲液组成，且乙二胺四乙酸在稳定液中的浓度为1. 5-;3mg/mL。
全文摘要
本发明涉及一种阿霉素缓释纳米颗粒，该纳米颗粒按质量百分比包括阿霉素6-16％和黄瓜花叶病毒83-93％，其中所述的阿霉素经黄瓜花叶病毒的衣壳蛋白表面的微孔透过所述衣壳蛋白吸附在黄瓜花叶病毒的RNA上。本发明所述的阿霉素缓释纳米颗粒不仅大大延缓了阿霉素的释放速度，而且键接靶向基团叶酸后可进一步提高所述缓释纳米颗粒在肿瘤组织上的富集效果。
文档编号A61K31/704GK102335139SQ20111030397
公开日2012年2月1日 申请日期2011年10月8日 优先权日2011年10月8日
发明者曾庆冰 申请人:南方医科大学