专利名称：抑制黑色素生成的siRNA分子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种siRNA分子及其应用，尤其是抑制黑色素生成的siRNA分子及其应用。
背景技术：
小眼 畸形相关转录因子(microphthalmia-associatedtranscription factor,MITF)，又称小眼球相关转录因子，在黑色素细胞的发育、分化和功能调节上起着重要作用。MITF具有基本-螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链(basic-helix-loop-helix-leucine zipper,bHLHZip)结构(Hodgkinson CA 等，1993, Cell, 744:395_404)。人类的 MITF 基因定位于人类第三条染色体3P141-3P12 3。研究证实其在色素细胞的发育、分化和功能调节中发挥关键性作用。MITF基因突变导致色素细胞的发育缺陷与功能障碍，同时MITF与其他信号分子发生复杂的相互作用。MITF可调控酪氨酸基因家族的表达，从而参与黑素生成的调控(Shibahara，S等，Pigment Cell Res，1998，11:329_336)。酪氨酸酶基因家族的三个成员:酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白-1 (TRP-1)，酪氨酸酶相关蛋白-2 (TRP-2)，基因的启动子都含有一个“M box”的结构，M box的核心结构为“CATGTG”，MITF可以与该结构结合，从而反式激活相应的基因表达。MITF通过与酪氨酸酶基因家族启动子的作用，一方面指导它们在黑素细胞中特异性表达，另一方面参与外界刺激对黑素细胞黑素生成的调控。根据人酪氨酸基因缺失和突变分析，发现在酪氨酸启动子有三个结构:TDE、M box和E box，这三个结构均含有“CATGTG”核心模色，它们对于酪氨酸在色素细胞中有效表达是必须的，而在非色素细胞中具有同样结构的启动子仅有微弱表达，进一步研究发现MITF与这些结构结合，刺激启动子的转录活性。MITF本身也具有细胞特异性，MITF在酪氨酸酶的黑素细胞特异性表达中起着关键作用。TRP-1和TRP-2也具有M-box结构，该结构在酪氨酸家族高度保守，MITF可与TRP-1基因M-box结合而活化其表达，并指导其在黑素细胞中特异性表达。(Aksan I等，Mol CellBiol,1998，18(12):6930_8)。黑色素细胞是皮肤的重要组成细胞之一，起源于胚胎神经嵴，具有树状突起，属于腺细胞，合成的黑素经由树状突起分泌进入角质形成细胞，随角质形成细胞的脱落而排出体外，存在于表皮基底层。黑色素细胞通过合成黑色素形成皮肤颜色，同时可吸收紫外线，使机体免遭紫外线的损害。哺乳动物皮肤和毛发的颜色主要是由黑色素细胞产生的黑色素的相对数量和分布情况决定的(Sturm RA等，Bioessays, 1998, 20:712)0黑色素又分为真黑色素(Eu-melanin)(棕/黑)和假黑色素(Pheo-melanin)(红/黄色)(Newton JM等,Mamma Genome, 2000,11:24)。黑色素细胞的发育、分化与黑色素的合成调节是一个复杂的过程，其中有多种信号分子参与该过程的调控，构成复杂的信号网络，其中MITF在其中扮演重要的角色。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是生物界中一种既古老且在进化上又高度保守的现象，是由双链RNA (double-stranded RNA, dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的基因转录后沉默(Andrew Fire 等，Nature，1998，391:806_811)。小干扰 RNA (siRNA)是RNAi的效应分子，由两条互补的RNA单链构成，长2广23个核苷酸(nt)。由于RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以技术广泛地应用于功能基因组学研究、传染性疾病以及抗病毒、抗肿瘤治疗的研究中。有研究报道，通过RNAi调节抑制MITF基因，可以调控下游酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)基因和酪氨酸酶相关蛋白I (tyrosinase relatedprotein-1，TRP-1)基因(Busca B 等，J Cell Biol，2005，49)，从而调控黑色素的生成。
发明内容
本发明的 目的在于提供一种通过siRNA分子库技术筛选出的高效靶向MITF基因的双链siRNA分子，其下述正义链和反义链组成:
正义链:5’-GGGACACUGAGGAAAGGAGUGGANn-3’ (SEQ ID NO: 3)
反义链:5’ -UCCACUCCUUUCCUCAGUGUCCCNn-3’ (SEQ ID NO: 4)
其中，N为胞嘧啶核苷C、鸟嘌呤核苷G、腺嘌呤核苷A、尿嘧啶核苷U ;脱氧胞嘧啶核苷dC、脱氧鸟嘌呤核苷dG、脱氧腺嘌呤核苷dA或脱氧胸腺嘧啶核苷dT。换句话说，该双链siRNA分子的主干序列为:
正义链:5’ -GGGACACUGAGGAAAGGAGUGGA-3’(SEQ ID NO: 5)
反义链:5’ -UCCACUCCUUUCCUCAGUGUCCC-3’(SEQ ID NO: 6)
在一个优选的实施方式中，上述序列中3’端的“Nn”是两个脱氧胸腺嘧啶dTdT。本发明的另一目的在于提供上述siRNA分子在制备美白祛斑化妆品和治疗高黑色素相关疾病药物中的应用。本发明针对参与黑色素形成调控的MITF基因的构建siRNA分子库，通过高通量筛选的方法筛选出能有效抑制黑色素生成的siRNA，通过RNAi调节抑制MITF基因，从而调控黑色素的生成。本发明筛选到的靶向MITF基因的siRNA可以作为药物制剂或化妆品的一种有效成份，用于下调皮肤中黑色素基因的表达，以减少色素的含量和沉着，祛除皮肤上的斑点，如老年斑、痘印、色素斑、雀斑、妊娠斑或其它由阳光、炎症、药物等因素引起的色素变化，从而使人体肌肤变白。体外实验证明，本发明的SiRNA分子的反义链可特异性地与MITF基因的mRNA结合，降解mRNA，从而干扰转录后翻译过程，下调黑色素相关基因的表达，最终抑制黑色素的生成，无明显毒副作用。
图1是合成的MITF基因保守区开放阅读框琼脂糖凝胶电泳检测图，制备得到的DNA片段大小为1563bp。左侧条带是DNA分子量Marker (标准参照)。图2是siRNA分子库构建流程示意图。图3是“U6_siRNA转录模板-H1”表达框结构示意图。图4是PCR制备的“U6_siRNA转录模板-H1”表达框纯化后琼脂糖凝胶电泳检测图(部分)。图中，最右侧条带是DNA分子量Marker (标准参照)。图5是“U6_siRNA转录模板-H1”表达框转染细胞后实时定量PCR检测MITF基因的mRNA表达量柱形图，横坐标表示各处理实验组,纵坐标表示MITF相对于GAPDH的mRNA表达水平，其中箭头所指是M001-24转染组，“正常组”为正常培养细胞未转染组。图6是化学合成的siRNA转染细胞后实时定量PCR检测MITF基因的mRNA表达量柱形图，横坐标表示各处理实验组，纵坐标表示MITF相对于GAPDH的mRNA表达水平，其中M001-24为M001-24转染组，“正常组”为正常培养细胞未转染组，“阴性对照组”为阴性对照siRNA转染组。图7是siRNA转染 细胞后细胞生长曲线图。横坐标表示各处理实验组，纵坐标表示各实验组所测得的OD值(A45tl值)，其中M001-24为M001-24转染组，“正常组”为正常培养细胞未转染组，“阴性对照组”为阴性对照siRNA转染组。图8是siRNA转染细胞后细胞中黑色素含量相对于正常组的柱形图。横坐标表示各处理实验组，纵坐标表示黑色素相对于正常组百分含量，其中M001-24为M001-24转染组，“正常组”为正常培养细胞未转染组，“阴性对照组”为阴性对照siRNA转染组。
具体实施例方式本发明的siRNA分子来源于针对MITF基因开放阅读框的保守区而制备的siRNA分子库，本发明所用siRNA分子库技术是百奥迈科生物技术有限公司的专利技术(中国发明专利申请号为:200710024217.6，专利名称:PCR高通量构建siRNA全位点分子库制备方法)，其优点在于所制备得到的siRNA随机分布于MITF开放阅读框区段，长度可控性分布于19-23 bp，可以提高有效靶位点的命中率。siRNA的制备可采用多种方法，比如:化学合成法、体外转录、酶切长链dsRNA、载体表达siRNA、PCR合成siRNA表达元件等，这些方法的出现为研究者提供了可选择的空间，可以更好地获得基因沉默效率。在细胞中，作为该siRNA分子的另一种表达形式，可将其制备成DNA表达框形式，比如:U6启动子-siRNA转录模板-Hl启动子。本发明的siRNA分子可以作为美白祛斑化妆品中的有效成份，也可以作为治疗高黑色素相关疾病的有效成份。出于应用目的，可将SiRNA分子作为药物直接给药于受药者身上特定部位，比如色素斑块。优选地，本发明的siRNA作为美白祛斑化妆品中的有效成份。出于应用目的，siRNA分子可以与其它辅助剂制成适当剂型，只要其适合于应用、并且能恰当地保持siRNA分子的活性。任选地，上述药物剂型中可以包含任何药学可接受的辅助剂，只要其适合于相应的给药体系、并且恰当地保持siRNA分子的活性。为了实现本发明的设计思想并验证筛选得到的siRNA的抑制黑色素生成的效果，设计了如下实验方案:
(I)构建凋亡抑制因子MITF基因开放阅读框的siRNA分子库，该分子库中包含靶向至MITF基因的siRNA效应分子，长度分布于19-23 bp。(2)制备具有相应效应的siRNA表达框，其结构为“U6启动子-siRNA转录模板-Hl启动子”，使其更易于体外筛选。
(3 )运用实时定量PCR检测方法，检测上述siRNA表达框在细胞中转录出的效应siRNA分子对MITF基因的抑制作用。(4)化学 合成上述方法筛选得到的siRNA，在体外细胞实验中进一步运用实时定量PCR检测方法检测MITF基因的mRNA表达水平。(5)用CCK8法检测上述筛选到的siRNA对细胞的毒性。(6)用已有报道的方法，检测上述筛选到的siRNA对细胞黑色素生成的影响。下述实施例仅用于阐明本发明，并非是对本发明进行限制。实施例1 siRNA分子库的制备
1.MITF基因靶序列的获得:美国NCBI数据库中MITF基因共有八种转录变异体(transcript variant)序列,选择有代表性的转录变异体1(NCBI数据库号:NM_198159)开放阅读框(Open Reading Frame, 0RF)进行合成，由百奥迈科生物技术(Biomics Biotech)有限公司全基因合成长度为1563bp的MITF的ORF序列(全长基因琼脂糖凝胶电泳检测图如图1所示)。用PCR的方法制备MITF基因的两段保守区，分别用引物:
保守区 I 上游引物:5’ -AGGTGCAGACCCACCTCGAAA-3’ (SEQ ID NO: 7)；
保守区 I 下游引物:5’ -TGTGAGCTCCCTTTTTATGTTG-3’ (SEQ ID NO: 8)；
保守区 2 上游引物:5’ -AGTCTGAAGCAAGAGCACTGG-3’ (SEQ ID NO: 9)；
保守区 2 下游引物:5’-CTAACAAGTGTGCTCCGTCTC-3’ (SEQ ID NO: 10)，
扩增其保守区作为靶序列合成构建siRNA分子库，扩增长度分别为527bp(SEQ ID NO:1)和 683bp (SEQ ID NO: 2)。保守区1:527bp
481aggtg cagacccacc tcgaaaaccc
541 caccaagtac cacatacagc aagcccaacg gcagcaggta aagcagtacc tttctaccac 601 tttagcaaat aaacatgcca accaagtcct gagcttgcca tgtccaaacc agcctggcga 661 tcatgtcatg ccaccggtgc cggggagcag cgcacccaac agccccatgg ctatgcttac 721 gcttaactcc aactgtgaaa aagagggatt ttataagttt gaagagcaaa acagggcaga 781 gagcgagtgc ccaggcatga acacacattc acgagcgtcc tgtatgcaga tggatgatgt 841 aatcgatgac atcattagcc tagaatcaag ttataatgag gaaatcttgg gcttgatgga 901 tcctgctttg caaatggcaa atacgttgcc tgtctcggga aacttgattg atctttatgg 961 aaaccaaggt ctgcccccac caggcctcac catcagcaac tcctgtccag ccaaccttcc 1021 caacataaaa agggagctca ca(SEQ ID NO:1)
保守区2:683bp
1021agtctga agcaagagca ctggccaaag agaggcagaa
1081 aaaggacaat cacaacctga ttgaacgaag aagaagattt aacataaatg accgcattaa 1141 agaactaggt actttgattc ccaagtcaaa tgatccagac atgcgctgga acaagggaac 1201 catcttaaaa gcatccgtgg actatatccg aaagttgcaa cgagaacagc aacgcgcaaa 1261 agaacttgaa aaccgacaga agaaactgga gcacgccaac cggcatttgt tgctcagaat 1321 acaggaactt gaaatgcagg ctcgagctca tggactttcc cttattccat ccacgggtct1381 ctgctctcca gatttggtga atcggatcat caagcaagaa cccgttcttg agaactgcag 1441 ccaagacctc cttcagcatc atgcagacct aacctgtaca acaactctcg atctcacgga 1501 tggcaccatc accttcaaca acaacctcgg aactgggact gaggccaacc aagcctatag 1561 tgtccccaca aaaatgggat ccaaactgga agacatcctg atggacgaca ccctttctcc 1621 cgtcggtgtc actgatccac tcctttcctc agtgtccccc ggagcttcca aaacaagcag 1681 ccggaggagc agtatgagca tggaagagac ggagcacact tgttag (SEQ ID NO: 2)
2.siRNA分子库构建:用百奥迈科生物技术有限公司的专利技术构建siRNA分子库(专利申请号为:200710024217.6，专利名称:PCR高通量构建siRNA全位点分子库制备方法)，构建流程示意图如图2所示。成功构建MITF保守区的siRNA分子库，随机挑取克隆进行测序，其序列长度可控性分布在19-23 bp之间，显示出位点及长度的多样性。实施例2
siRNA表达框的制备与靶点筛选 1.主要仪器、试剂和材料
1.1仪器:PCR仪(ABI公司)；实时定量PCR仪(BiO-Rad公司)；琼脂糖凝胶电泳系统(北京六一)；细胞培养箱(Thermo公司)等。1.2 材料和试剂:lkb plus DNA Ladder (Invitrogen 公司)；Pfu DNA 聚合酶(Biomics Biotech) ；Agarose (BBI公司)；dNTP (上海生工)；琼脂糖凝胶纯化试剂盒(Biomics Biotech), Lipofectamin 2000 (Invitrogen 公司)，DMEM 培养基(Gibco 公司),TurboCapture mRNA kit(QIAGEN 公司)，EzOmics One-Step qPCR kit(Biomics Biotech)等。其他生化试剂均购于上海生工，由百奥迈科生物技术有限公司配置成工作溶液。1.3 PCR 引物(Biomics Biotech 合成)序列如下:
5’ U6 启动子引物:5’ -AAGGTCGGGCAGGAAGAGGGC-3’ (SEQ ID NO: 11)；
3’ Hl 启动子引物:5’ -TATTTGCATGTCGCTATGTGTTCT-3’ (SEQ ID NO: 12)；
MITF 基因正向引物:5’ -CATCACCTTCAACAACAAC-3’ (SEQ ID NO: 13)；
MITF 基因反向引物:5’ -ATGCTCATACTGCTCCTC-3’ (SEQ ID NO: 14)；
GAPDH 基因正向引物:5’ -GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’ (SEQ ID NO: 15)；
GAPDH 基因反向引物:5’ -GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’ (SEQ ID NO: 16)。2.siRNA表达框的制备
2.1 PCR扩增制备siRNA表达框“U6_siRNA转录模板-Hl，，:用MITF siRNA阳性克隆质粒为模板，用高保真酶Pfu DNA聚合酶通过PCR的方法扩增制备(表达框示意图如图3所示)。各PCR 反应体系为(50 μ I 反应体系):0.5μ I 模板 DNA (10-50ng)，ly I 5’U6启动子引物(10 μ M)，I μ I 3，Hl 启动子引物(10 μ Μ)，I μ I dNTP (10mM),0.5μ I Pfu DNA聚合酶，用ddH20补足到50 μ 1，反应条件为:95°C预变性lmin，95°C变性15sec，58 °C退火30sec, 72°C延伸30seC，20个循环。1.0 %琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增得到的表达框，并用琼脂糖凝胶纯化试剂盒纯化。经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物条带单一，片段大小为约为380 384bp，符合设计要求(琼脂糖凝胶电泳检测图如图4所示)。3.靶点筛选3.1细胞培养:黑色素瘤细胞A375在含10% 83的01^11培养基中，371:、5% CO2培养
箱培养。3.2细胞 铺板并转染:将细胞按IX IO5/孔接种到96孔细胞培养板中，用无抗含10% FBS的DMEM培养基中，37°C、5% CO2培养箱培养过夜。转染按照Lipofectamin 2000的说明书操作，“U6-siRNA转录模板-H1”表达框DNA量按0.2 μ g/孔加入。3.3实时定量PCR检测MITF基因mRNA水平:用mRNA提取纯化试剂盒TurboCapture mRNA kit提取纯化细胞RNA,操作按试剂盒说明书进行,按80 μ I无RNase水/孔溶解RNA，取4 μ I RNA为模板进行实时定量PCR反应。用基因特异性引物检测样本中MITF基因的mRNA表达水平，同时扩增看家基因GAPDH作为内参对照。每个反应做3个平行实验。建立如下25μ I反应体系:4μ I模板RNA，
12.5μ I 2 X Master Mix, I μ I 正向引物(6 μ Μ)，I μ I 反向引物(6 μ Μ)，0.5 μ I 50 X SYBRGreen I,用无RNase水补足体系至25 μ I。反应条件:40°C反转录30min, 95°C预变性7min,95°C变性20sec，60°C退火30sec，72°C延伸30sec，循环45次，并测定溶解曲线。3.4结果分析:用2_Λ 法分析实验结果，并作出柱状图，如图5所示，结果显示MITF多个位点的siRNA均呈现较好的沉默效果，尤其是Μ001-24，相对于未转染组其沉默效果达到81%。尤其须需要说明的是，Μ001-24正义链序列与MITF基因保守区的第1636-1658位(下划线部分 tccactcctttcctcagtgtccc)相对应。实施例3
化学合成siRNA验证沉默效果 1.主要仪器、试剂和材料
1.1仪器:核酸合成仪(GE公司)、PCR仪(ABI公司);实时定量PCR仪(Bio-Rad公司)；细胞培养箱(Thermo公司)等。1.2 材料和试剂:Lipofectamin 2000 (Invitrogen 公司)，DMEM 培养基(Gibco公司)，TurboCapture mRNA kit (QIAGEN 公司)，EzOmics One-Step qPCR kit (BiomicsBiotech)等。其他生化试剂均购于上海生工，由百奥迈科生物技术有限公司配置成工作溶液。1.3实时定量PCR引物(Biomics Biotech合成)序列如下:
MITF 基因正向引物:5’ - CATCACCTTCAACAACAAC-3’ (SEQ ID NO: 13)；
MITF 基因反向引物:5’ -ATGCTCATACTGCTCCTC-3’ (SEQ ID NO: 14)；
GAPDH 基因正向引物:5’ -GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’ (SEQ ID NO: 15)；
GAPDH 基因反向引物:5’ -GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’ (SEQ ID NO: 16)。2.化学合成制备siRNA
利用百奥迈科生 物技术有限公司拥有的核酸合成仪(AKTA Oligo Pilot)分别合成M001-24的正义链(sense strand)和反义链(antisense strand)的RNA。并进行纯化，将正义链和对应的反义链退火成siRNA双链(duplex)，分装10D/管，最后冷冻干燥，转染前用无RNase水溶解至20 μ Μ。其中阴性对照组的siRNA序列为(5，-3’ ):
正义链:UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT (SEQ ID NO: 17)，反义链:ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT (SEQ ID NO: 18)。3.沉默效率验证
3.1细胞培养:黑色素瘤细胞A375在含10% FBS的DMEM培养基中，37°C、5% CO2培养箱培养。3.2细胞 铺板并转染:将细胞按IX IO5/孔接种到96孔细胞培养板中，用无抗含10% FBS的DMEM培养基中，37°C、5% CO2培养箱培养过夜。转染按照Lipofectamin 2000的说明书转染，RNA按IOnM/孔加入。3.3实时定量PCR检测MITF基因mRNA水平:用mRNA提取纯化试剂盒TurboCapture mRNA kit提取纯化细胞RNA,操作按试剂盒说明书进行,按80 μ I无RNase水/孔溶解RNA，取4 μ I RNA为模板进行实时定量PCR反应。用基因特异性引物检测样本中MITF mRNA表达水平，同时扩增看家基因GAPDH作为内参对照。每个反应做3个平行。建立如下25 μ I反应体系:4 μ I模板RNA，12.5μ12XMaster Mix, I μ I 正向引物(6 μ M)，I μ I 反向引物(6 μ Μ)，0.5 μ I 50XSYBR GreenI，用无RNase水补足体系至25 μ I。反应条件:40°C反转录30min, 95°C预变性7min, 95°C变性 20sec，60°C退火 30sec，72°C延伸 30sec，循环 45 次。3.4结果分析:用法分析实验结果，并作柱状图，如图6所示，结果显示靶向至MITF基因的M001-24沉默效果达到87%。实施例4 细胞毒性检测
1.主要仪器、试剂和材料
1.1仪器:细胞培养箱(Thermo公司)；酶标仪(Bio-Rad公司)等。1.2 材料和试剂:Lipofectamin 2000 (Invitrogen 公司),DMEM 培养基(Gibco 公司)，CCK8试剂盒(同仁化学)等。其他生化试剂均购于上海生工，由百奥迈科生物技术有限公司配置成工作溶液。2.细胞毒性检测
2.1细胞培养:黑色素瘤细胞A375在含10% FBS的DMEM培养基中，37°C、5 % C02培养箱培养。2.2细胞铺板并转染:将细胞按IX IO5/孔接种到96孔细胞培养板中，在无抗含10% FBS的DMEM培养基中，37°C、5% CO2培养箱培养过夜。转染按Lipofectamin 2000(Invitrogen公司)的操作步骤进行，实验的不同RNA分子按浓度为10 nM/孔加入。2.3 CCK-8测定:在不同时间点测定。在细胞板每孔加入1/10培养基体积的CCK-8溶液。在细胞培养箱内继续孵育0.5 4 h。用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度。2.4结果分析:根据所测得的A45tl值(( 值)，作生长曲线图，如图7所示，与正常组相比，M001-24对黑色素瘤细胞有一定的生长抑制用，但无明显的毒性作用。实施例5 黑色素含量的测定
1.主要仪器、试剂和材料
1.1仪器:细胞培养箱(Thermo公司)；酶标仪(Bio-Rad公司)等。1.2 材料和试剂:Lipofectamin 2000 (Invitrogen 公司),DMEM 培养基(Gibco 公司)，胰蛋白酶(Gibco公司)，CCK8试剂盒(同仁化学)等。其他生化试剂均购于上海生工，由百奥迈科生物技术有限公司配置成工作溶液。2.细胞毒性检测
2.1细胞培养:黑色 素瘤细胞A375在含10% FBS的DMEM培养基中，37°C、5 % C02培
养箱培养。2.2细胞铺板并转染:将细胞按1X IO5/孔接种到96孔细胞培养板中，在无抗含10% FBS的DMEM培养基中，37°C、5% CO2培养箱培养过夜。转染按Lipofectamin 2000(Invitrogen公司)的操作步骤进行，实验的不同RNA分子按浓度为10 nM/孔加入。2.3 黑色素含量测定:参照 Jones K 等人(Jones K et al.Pigment Cell Res2002;15:335-40)的方法，经改进后进行黑色素含量测定。A375细胞转染72 h后，用PBS洗涤两次，用0.25%胰蛋白酶消化，并用完全培养基终止消化，1，OOOrpm离心5 min，弃上清液，每孔加I ml PBS重悬细胞,用血球计数板计数,然后1，OOOrpm离心5min,弃上清液，细胞沉淀在超净工作台中干燥，每IO6个细胞溶于500 μ I的I N含1 % DMSO的NaOH溶液。经80°C加热1 h后冷却。用酶标仪在475 nm波长处测定吸光度。2.4结果分析:根据所测得的A475值(0D值)，作柱状图，如图8所示，与正常组相比，M001-24处理组的细胞中黑色素含量下降了约43%，明显抑制了黑色素的生成。
权利要求
1.种双链SiRNA分子，其具有如下序列结构:正义链:5’ -GGGACACUGAGGAAAGGAGUGGANn-3’(SEQ ID NO: 3)反义链:5’ -UCCACUCCUUUCCUCAGUGUCCCNn-3’(SEQ ID NO: 4)，其中，N为脱氧胸腺嘧啶核苷dT ;n为O或2。
2.权利要求1所述的siRNA分子在美白祛斑化妆品中的应用。
3.权利要求1所 述的siRNA分子在制备治疗高黑色素相关疾病药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种靶向MITF基因的双链siRNA分子及其在美白祛斑化妆品或制备治疗黑色素基因相关疾病药物中的应用。该siRNA分子正义链为SEQIDNO:3，反义链为SEQIDNO:4，其中，反义链可特异性地与MITF基因的mRNA结合，降解mRNA，从而干扰转录后翻译过程，达到降低黑色素的目的。
文档编号A61P17/00GK103088020SQ20111033147
公开日2013年5月8日 申请日期2011年10月27日 优先权日2011年10月27日
发明者朱远源, 李铁军 申请人:江苏吉康生物技术有限公司