专利名称：一种制备具有抗肿瘤活性鼎湖鳞伞多糖的方法
技术领域：
本发明涉及以鼎湖鳞伞为菌种发酵并提取得到菌丝体多糖的的技术领域，具体涉及一种制备具有抗肿瘤活性鼎湖鳞伞多糖的方法。
背景技术：
几千年来，大型真菌(如蘑菇等)在中国已被长期作为作为食用和医药用的重要来源。最近半个世纪，一些具有各种特殊生物活性的物质已经从蘑菇中分离得到。特别是含有生物活性多糖的真菌(蘑菇)子实体，菌丝体及其发酵液受到越来越多的重视。近年来，各种多糖的抗肿瘤活性以及应用受到了极大的关注。
伞菌是担子菌在家庭中的一小属肉质蘑菇，在温带地区广泛分布。据报道，伞菌含有丰富的纤维，维生素，氨基酸，微量元素，脂类和多糖。其中，许多生物活性物质具有抗炎， 抗氧化，抗肿瘤及降血脂等多方面的作用。鼎湖鳞伞(Pholiota dinghuensis Bi)是中国特有种，1985年发现于广东省。目前关于鼎湖鳞伞的研究仅仅涉及到它的发现以及分类鉴定， 关于采用发酵法生产鼎湖鳞伞的菌丝体以及菌丝体提取物的生物活性的报道尚未发现。发明内容
本发明目的旨在提供一种快速、高效的制备具有生物活性鼎湖鳞伞多糖的方法， 实现本发明的具体方案如下
(1)从土豆斜面培养基上取出菌丝体块，接种于种子培养基上，于25°C静止培养 12h，摇床转速调为140rpm继续培养96小时。种子培养基(g/L):葡萄糖20，蛋白胨3，酵母膏4，磷酸二氢钾1，硫酸镁1. 5，装液量为100mL/250mL。
(2)将步骤(1)制得种子无菌破碎，并进行二级扩大培养。培养基配方同(1)，培养条件为于25°C，摇床转速为140rpm，培养96小时，装液量为100mL/250mL。
(3)取步骤(2)中的种子液接种到发酵培养基中，接种量为15% (V/V)。发酵培养基配方(g/L):葡萄糖36，玉米粉11. 8，蛋白胨3，酵母膏5. 4，磷酸二氢钾1. 0，硫酸镁1. 5 ； 培养条件为25°C，144小时，摇床转速为140rpm，装液量为100mL/250mL。
(4)过滤得到步骤(3)中菌丝体，用去离子水冲洗菌丝体，55°C烘干至恒重，粉碎， 过60目筛。
(5)将步骤(4)制得的菌丝体粉中加入去离子水浸提，提取温度90°C，时间池，提取次数3次，得提取液；
(6)将步骤(5)所得提取液离心分离(离心分离条件5000rpm，15min)，取上清液；减压浓缩至合适的体积，在浓缩液中加3倍无水乙醇，4°C沉淀过夜，离心取沉淀，离心分离条件:5000rpm, 15min ；
(7)将步骤(6)所得沉淀物依次用丙酮、乙醚洗涤2次，55°C烘干至恒重，即为鼎湖鳞伞多糖。
(8)将步骤(7)所得多糖用DMEM培养基分别配制成一系列浓度溶液，MethyleneBlue法测定其对人乳腺细胞MCF-10A、乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231、胃癌BGC-823以及肝癌 HepG2细胞体外增殖的抑制能力。
2、根据专利要求1所述的一种生物活性鼎湖鳞伞多糖的制备方法，其特征在于 所述步骤(3)的优化后的发酵培养基配方(g/L)葡萄糖36，玉米粉11.8，酵母膏5.4(如图1)。
制备的鼎湖鳞伞多糖为灰色粉末，其中多糖含量86. 95%，容易吸潮。该多糖对人乳腺细胞MCF-10A没有显著的抑制作用，对人乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231、胃癌BGC-823细胞增殖的抑制作用呈现剂量和时间依赖关系。当多糖浓度为62. 5 μ g/mL,作用时，最大抑制率为67. 5% (如图2)。同时在52. 1 μ g/mL时，该多糖能显著诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡(如图3)。
图1培养基配方对鼎湖鳞伞多糖得率的影响
图2鼎湖鳞伞多糖对人乳腺癌MCF-7细胞株增值抑制作用
图3鼎湖鳞伞多糖诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡具体实施方式
下面通过实施例，对本发明作进一步描述。
实施例1
(1)从土豆斜面培养基上取出菌丝体块，接种于种子培养基上，于25°C静止培养 12h，摇床转速调为140rpm继续培养96小时。种子培养基(g/L):葡萄糖20，蛋白胨3，酵母膏4，磷酸二氢钾1，硫酸镁1. 5，装液量为100mL/250mL。
(2)将步骤(1)制得种子无菌破碎，并进行二级扩大培养。培养基配方同(1)，培养条件为于25°C，摇床转速为140rpm，培养96小时，装液量为100mL/250mL。
(3)取步骤(2)中的种子液接种到发酵培养基中，接种量为15% (V/V)。发酵培养基配方(g/L):葡萄糖36，玉米粉11. 8，蛋白胨3，酵母膏5. 4，磷酸二氢钾1. 0，硫酸镁1. 5 ； 培养条件为25°C，144小时，摇床转速为140rpm，装液量为100mL/250mL。
(4)过滤得到步骤(3)中菌丝体，用去离子水冲洗菌丝体，55°C烘干，粉碎，过60目筛。
(5)将步骤(4)制得的菌丝体粉中加入去离子水浸提，提取温度90°C，时间2h，提取次数3次，得提取液；
(6)将步骤(5)所得提取液离心分离(离心分离条件5000rpm，15min)，取上清液；减压浓缩至合适的体积，在浓缩液中加3倍无水乙醇，4°C沉淀过夜，离心取沉淀，离心分离条件:5000rpm, 15min ；
(7)将步骤(6)所得沉淀物依次用丙酮、乙醚洗涤2次，55°C烘干，即为鼎湖鳞伞多糖。
(8)将步骤(7)所得多糖用DMEM培养基分别配制成一系列浓度溶液，Methylene Blue法测定其对人乳腺细胞MCF-IOAjU^g MCF-7、MDA-MB-231、胃癌BGC-823以及肝癌 HepG2细胞体外增殖的抑制能力。
采用苯酚-硫酸法测定鼎湖鳞伞多糖的含量，多糖提取率按下面公式计算
多糖提取率(％ )=[多糖提取物中多糖质量(g)/菌丝体质量(g)]X100%。
肿瘤细胞抑制率(％ ) = (1-测定孔吸光度/空白孔吸光度)X 100%
实施例2:
制备具有生物活性鼎湖鳞伞多糖的发酵条件优化实验
(1)制备具有生物活性鼎湖鳞伞多糖的发酵条件优化的单因素筛选试验
①部分因素设计对发酵条件显著因素的筛选。
鼎湖鳞伞发酵条件因素以及代码为葡萄糖(X1),玉米粉(X2),蛋白胨(X3)，酵母膏(X4), KH2PO4(X5), MgSO4(X6)的中心点(0)分别为(g/L) :20，4，3，3，1，1. 5，步长分别为 5，2，1，1，0.5，0.5。12组试验的鼎湖鳞伞多糖得率见表1。经过Design-Expert 7. 0软件统计分析，得到如下公式
多糖得率Y = 284. 8+52X1+91X2+17X3+40. 25X4+10. 25Xs-2. 25X6
由表ι与该公式可以看出，葡萄糖(X1)，玉米粉OQ与酵母膏OQ是鼎湖鳞伞菌丝体多糖得率的显著性影响因素。
但是从表中无法判断葡萄糖(X1),玉米粉OQ与酵母膏OQ对鼎湖鳞伞菌丝体多糖得率的显著性影响的浓度中心点。为了进一步优化葡萄糖(X1),玉米粉(X2)与酵母膏 (X4)最佳浓度以及交互作用，本发明采用爬坡实验方法判断葡萄糖(X1),玉米粉OQ与酵母膏OQ最佳浓度的中心点。
表1发酵培养基显著性条件筛选
因素(g/L)产量葡萄糖 ⑶)玉米粉( )蛋白胨 ( )酵母膏 ( )KH2PO4 陶MgSO4 陶鼎湖鳞伞多糖(mg/L)1-1 (15.0)-1 (2.0)-1 (2.0)1 (4.0)1 (1.5)1 (2.0)167 士 2121 (25.0)-1 (2.0)-1 (2.0)-1 (2.0)-1 (0.5)1 (2.0)182 士 173-1 (15.0)1 (6.0)-1 (2.0)-1 (2.0)1 (1.5)-1 (1.0)285 士 3141 (25.0)1 (6.0)-1 (2.0)1 (4.0)-1 (0.5)-1 (1-0)437 土 235-1 (15.0)■1 (2.0)1 (4.0)1 (4.0)-1 (0.5)-1 (1.0)197 士 1561 (25.0)-1 (2.0)1 (4.0)-1 (2.0)1 (1.5)-1 (1.0)229 ± 137-1 (15.0)1 (6.0)1 (4.0)-1 (2.0)-1 (0.5)1 (2.0)282 士 2981 (25.0)1 (6.0)1 (4.0)1 (4.0)1 (1.5)1 (2.0)499 ± 3890 (20.0)0 (4.0)0(3.0)0 (3.0)0(1.0)0(1.5)301 ± 17100 (20.0)0 (4.0)0 (3.0)0 (3.0)0(1.0)0(1.5)281 ±26110 (20.0)0 (4.0)0(3.0)0 (3.0)0(1.0)0(1.5)279 ± 36120 (20.0)0 (4.0)0 (3.0)0 (3.0)0(1.0)0(1.5)303 ± 27
②影响鼎湖鳞伞菌丝体多糖得率的显著性因素浓度的中心点确立(爬坡实验)。
葡萄糖(X1)，玉米粉(X2)与酵母膏(X4)的起点分别为(g/L) :25，6和3 ；步长分别为5，2和1。爬坡试验结果见表2
表2显著性影响因素的中心点确立
权利要求
1.一种生物活性多糖的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤(1)从土豆斜面培养基上取出菌丝体块，接种于种子培养基上，于25°c静止培养12h， 摇床转速调为140rpm继续培养96小时。种子培养基(g/L):葡萄糖20，蛋白胨3，酵母膏 4，磷酸二氢钾1，硫酸镁1. 5，装液量为100mL/250mL。(2)将步骤(1)制得种子无菌破碎，并进行二级扩大培养。培养基配方同(1)，培养条件为于25°C，摇床转速为140rpm，培养96小时，装液量为100mL/250mL。(3)取步骤( 中的种子液接种到发酵培养基中，接种量为15%(V/V)。发酵培养基配方(g/L):葡萄糖36，玉米粉11. 8，蛋白胨3，酵母膏5. 4，磷酸二氢钾1. 0，硫酸镁1. 5 ；培养条件为25°C，144小时，摇床转速为140rpm，装液量为100mL/250mL。(4)过滤得到步骤(3)中菌丝体，用去离子水冲洗菌丝体，55°C烘干，粉碎，过60目筛。(5)将步骤⑷制得的菌丝体粉中加入去离子水浸提，提取温度90°C，时间池，提取次数3次，得提取液；(6)将步骤(5)所得提取液离心分离(离心分离条件5000rpm，15min)，取上清液；减压浓缩至合适的体积，在浓缩液中加3倍无水乙醇，4°C沉淀过夜，离心取沉淀，离心分离条件5000rpm，15min ；(7)将步骤(6)所得沉淀物依次用丙酮、乙醚洗涤2次，55°C烘干至恒重，即为鼎湖鳞伞多糖。(8)将步骤(7)所得多糖用DMEM培养基分别配制成一系列浓度溶液，MethyleneBlue 法测定其对人乳腺细胞MCF-IOAjW^g MCF-7、MDA-MB-231、胃癌BGC-823以及肝癌H印G2 细胞体外增殖的抑制能力。
2.制备的鼎湖鳞伞多糖为灰色粉末，其中多糖含量86.95%，容易吸潮。该多糖对人乳腺细胞MCF-10A没有显著的抑制作用，对人乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231、胃癌BGC-823细胞增殖的抑制作用呈现剂量和时间依赖关系。当多糖浓度为62. 5 μ g/mL,作用时，最大抑制率为67. 5%。同时在52. 1 μ g/mL时，该多糖能显著诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡。
全文摘要
本发明涉及一种微生物发酵法制备鼎湖鳞伞多糖的方法。该方法包括鼎湖鳞伞一级种子培养，二级种子扩大，接种发酵，过滤获得菌丝体，所得菌丝体经过烘干、粉碎、热水浸提、乙醇沉淀、烘干等多道工序获得鼎湖鳞伞多糖。Methylene Blue法分析该多糖的抗肿瘤活性，发现其对人乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231以及胃癌BGC-823细胞增殖均具有显著的抑制能力。本发明的工艺方法具有工艺简单、提取条件温和、成本低、对环境友好等优点，制备的鼎湖鳞伞多糖具有显著的抑制肿瘤细胞增殖以及诱导肿瘤细胞凋亡活性，因此具有广阔的应用前景。
文档编号A61P35/00GK102505029SQ20111037954
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月25日 优先权日2011年11月25日
发明者曾晓雄, 甘聃 申请人:南京农业大学