专利名称：人脑组织特异性基因lrrc4单抗及其制备和应用方法
技术领域：
本发明涉及人脑组织特异性基因LRRC4单抗及其制备和应用方法，属于基因工程领域。
背景技术：
胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，约占中枢神经系统原发性肿瘤的40-50%，综合发病年龄高峰在30-40岁，或10-20岁，具有发病率高、复发率高、死亡率高及治愈率低等特点。由于胶质瘤呈“树根状”浸润性生长，与周边正常脑组织无明显分界，仅通过手术治疗难以达到完全根除，常联合放、化疗及免疫治疗等方案。尽管如此，胶质瘤细胞增殖快、易侵袭，以至于它能有效地“逃脱”上述治疗方案，最终导致患者死亡。虽然目前随着生命科学研究的发展，胶质瘤的诊断和治疗方法在不断改进，但其中位生存期仍没有明显提高，尤其是胶质母细胞瘤，其中位生存期仅为9-12个月，而间变性星形细胞瘤其中位生存期也仅为 3年。因此，寻求新的治疗途径和方法，例如靶向治疗、基因治疗等成为热门研究领域。我们前期运用EST介导的定位候选克隆策略，从多种肿瘤高频缺失区7q31_32克隆了一 LRR超家族新成员LRRC4，该基因编码一种跨膜蛋白，其胞外区包含9. 5个LRR结构域。研究发现LRRC4在正常人脑组织中相对特异高表达，而在多种原发性脑瘤中表达明显下调甚至缺失，尤其是胶质瘤。(王洁如，钱骏，董利，李小玲，谭琛，李江，张必成，周洁，李桂源.富亮氨酸重复超家族新成员LRRC4的克隆与在脑瘤中的表达分析.生物化学与生物物理进展.2002, 29 (2) 233-239.)进一步研究发现，LRRC4能通过MAPK信号通路抑制胶质母细胞瘤细胞系U251的生长和成瘤潜能，是一个新的候选抑瘤基因。为深入研究LRRC4的生物学功能，寻找与其直接作用的交互蛋白，明确其所参与的具体信号转导通路，制备高效特异的抗LRRC4抗体是非常必要的。申请人:在前期工作中发现，LRRC4全长蛋白整体亲水性不高，经多次尝试难以诱导其表达，选择亲水性好、抗原指数高且序列特异的一段多肽作为动物的免疫原不失为一种好的方法。His标签是由6个组氨酸构成的短肽，专门设计用于重组蛋白的表达纯化，His 标签与其它标签相比具有很多明显优势①对金属离子(如镍、钴)有高度的选择性和亲和力；②与金属离子的结合不受变性剂(如尿素、胍)的影响；③温和多样的洗脱条件。因此， 选择LRRC4基因编码区中特定的一段核苷酸序列，利用His标签建立一个基于融合蛋白的高效的蛋白表达和纯化系统，是本发明的工作基础。
发明内容
本发明的目的在于提供高效特异的抗人脑组织特异性基因LRRC4的单抗及其制备和应用方法。本发明单抗的制备方法如下应用DNASTAR软件分析LRRC4 (Genebank ID 64101) 全长蛋白的亲水性、抗原指数及表位可能性等，并结合NCBI数据库中的Protein Blast进行序列特异性分析，选取其第460-521位，长度为62个氨基酸，序列为ETTEISPEDTTRKYKPVPTTSTGYQPAYTTSTTVLIQTTRVPKQVAVPATDTTDKMQTSLDE,的多肽作为动物的免疫原。首先应用多聚酶链式反应克隆编码该多肽的核苷酸序列，构建包含该核苷酸序列的His融合表达载体，转入大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导His融合蛋白表达，Ni柱亲和纯化后免疫Balb/c小鼠，然后分离其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，经阳性克隆筛选及亚克隆化后制备腹水，辛酸_硫酸铵沉淀法纯化获得抗LRRC4单抗。应用该抗体进行 western blot及细胞免疫荧光实验，均显示出该抗体的特异性和高效价。一种人脑组织特异性基因LRRC4单抗是由上述的方法制备而成的单抗。一种人脑组织特异性基因LRRC4单抗用于制备诊断和治疗胶质瘤的药物或试剂。应用本发明抗体可深入研究LRRC4的生物学功能，明确其所参与的具体信号转导通路，有助于进一步阐明胶质瘤发生发展的机制。此外，由于LRRC4在正常人脑组织与胶质瘤组织中的表达水平存在明显差异，因此抗LRRC4单抗在胶质瘤的早期诊断和治疗方面具有潜在的应用价值。
图1 :DNASTAR软件分析LRRC4全长蛋白的特性；图2 :His融合表达质粒的酶切鉴定；(M1、M2 =DNAMarker ；1 =His融合表达质粒)图3 =His融合蛋白的诱导表达；图4 应用抗LRRC4单抗进行Western blot，检测LRRC4蛋白的表达水平；图5 应用抗LRRC4单抗进行细胞免疫荧光实验，检测LRRC4蛋白的细胞定位。
具体实施例方式下面结合实施例进一步说明本发明，而非限制本发明。实施例1His融合表达载体的构建(1)生物软件分析应用DNASTAR软件分析LRRC4全长蛋白的特性(图1)，着重考虑蛋白的亲水性、抗原指数及表面可能性等并结合NCBI数据库中的Protein Blast进行序列特异性分析，选取第460-521位，长度为62个氨基酸的多肽作为免疫原。多肽序列为E TTEISPEDTTRKYKPVPTTSTGYQPAYTTSTTVLIQTTRVPKQVAVPATDTTDKMQTSLDEo(2)构建载体根据His表达载体pET_28b (+)(购自Novagen公司，Cat. No. 69865-3)序列及多肽编码区序列，引入限制性酶切位点Nco I、Xho I，设计特异性引物 (forward primer 5' -TTACCATGGTGGAGACCACGGAGATCT-3‘ ；reward primer 5' -ATACT CGAGTTCATCCAGGCTGGTCTGC-3 ‘)，使得多肽编码区的阅读框与His标签的阅读框一致，以 pcDNA3. 1 (+)(购自 Invitrogen 公司，Cat. No. V790-20) /LRRC4 为模板进行 PCR 扩增，胶回收扩增产物。载体pET-28b(+)及回收的PCR扩增产物分别经限制性内切酶Nco I、Xho I双酶切，胶回收酶切产物，利用T4DNA连接酶进行连接反应，然后转化感受态细胞BL21 (DE3)， 挑取单克隆进行小量培养，抽提质粒DNA进行Nco I、Xho I双酶切鉴定是否含有插入片段 (图2)，将含有插入片段的质粒DNA进行测序确认。实施例2His融合蛋白的诱导表达和纯化
1)IPTG诱导表达将测序鉴定正确的His融合表达载体转化入大肠杆菌 BL21 (DE3)(购自Novagen公司)，挑取单菌落小量培养，至A600 = 0. 6-0. 8时，加入IPTG 至终浓度为0. 5mM，37 °C，220rpm,继续培养3. 5小时后收集细菌，制备细菌裂解液，15 % SDS-PAGE电泳检测融合蛋白的表达情况(图3)。2)融合蛋白纯化大量制备经IPTG诱导的菌液，离心收集沉淀，按照His-Bind Buffer Kit操作说明，将沉淀重悬于5ml结合缓冲液中(10mmol/L咪唑，0. 5mmol/L NaCl， 20mmol/LTriS-HCl)，冰上超声裂解，离心，将上清转入加有Ni2+-NTA resin的层析柱中(每 IOOml菌液所收集的沉淀使用0. aiil Ni2+-NTA resin)，先用10倍体积的结合缓冲液洗涤， 再用6倍体积的冲洗缓冲液QOmmol/L咪唑，0. 5mmol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl)洗涤， 然后用 Iml 洗脱缓冲液 O50mmol/L 咪唑，0. 5mmol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl)洗脱，洗脱的融合蛋白经透析脱盐。实施例3抗LRRC4单抗的制备1)免疫小鼠用纯化的His融合蛋白免疫8周龄的Balb/c雌性小鼠，免疫剂量为 IOOug/只，首次免疫用弗氏完全佐剂与抗原按1 1乳化混合于背部皮下+腹腔多点注射， 3周后用弗氏不完全佐剂与抗原按11乳化混合于背部皮下+腹腔多点注射加强免疫1 次，ELISA测定小鼠血清效价大于1 8000即可进行融合，融合前3天采用尾静脉注射方式加强免疫1次，剂量同前。2)细胞融合无菌分离Balb/c免疫小鼠的脾脏，置于200目无菌筛网上，用无菌注射器内芯研磨，再用RPMI-1640无血清培养基冲洗筛网，收集细胞并计数。取免疫小鼠的脾细胞1 X IO8个，SP2/0骨髓瘤细胞2 X 107-3 X IO7个，混合于50ml无菌离心管中，1200rpm 离心5min，弃上清，轻弹管底，使沉淀细胞松散均勻。于37°C水浴中，一手轻轻转动离心管， 另一手用滴管在Imin内勻速缓慢滴入Iml 50% PEG，再在Imin内勻速滴入Iml RPMI-1640 无血清培养基，然后在anin内勻速滴入RPMI-1640无血清培养基，在随后的^iin内加入15mlRPMI-1640无血清培养基。细胞悬液于800rpm离心8min，弃上清，加入HAT选择培养基120ml，轻轻吹打沉淀，使融合细胞混勻，然后将细胞悬液加入96孔细胞培养板中， 200ul/孔，将培养板置于37°C，含5% CO2的细胞培养箱中培养。3)阳性克隆的筛选与亚克隆化根据细胞生长情况，每3天更换培养基一次，采用半量换液法，融合后10天内用HAT培养基，10天后改用HT培养基，第18天改用普通的 RPMI-1640完全培养基。融合后7-10天对有克隆生长的培养孔，取培养上清，分别以纯化的His融合蛋白、His标签包被96孔酶标板，用间接ELISA法检测，筛选出能与His融合蛋白发生反应，而不与His标签发生反应的阳性克隆。对筛选出的阳性克隆孔采用有限稀释法进行亚克隆及克隆化铺板，第1次亚克隆用HT选择培养基，将阳性孔中的细胞转移至装有10ml HT选择培养基的离心管中，充分混勻后铺1/3块96孔板，7_10天后采用上述间接ELISA法进行筛选，筛选出的阳性克隆移入RPMI-1640完全培养基中，进行有限稀释法铺板，每个阳性克隆铺一块96孔板，7-10天后采用间接ELISA法检测96孔板上所有单克隆孔是否均为阳性，若非全阳性，则重复有限稀释法，直至96孔板上所有单克隆孔均为阳性，随后转入M孔细胞培养板培养，继而转入细胞培养瓶中进行扩大培养，并及时对细胞进行冻存。由此，经过3次亚克隆筛选，我们获得了三株抗LRRC4单抗杂交瘤细胞系2C7G3、4D7D8和1E7F4，均由本室保存。4)诱生腹水及单抗纯化在接种杂交瘤细胞的前1周，于Balb/c雌性小鼠的腹腔内注射0. 5ml液体石蜡，1周后收集培养的杂交瘤细胞并计数，1200rpm离心6min，弃上清， 用RPMI-1640无血清培养基重悬至1 X 106_2X 106/ml，每只小鼠腹腔注射0. 5ml, 10天后抽取腹水，采用辛酸_硫酸铵两步沉淀法纯化抗体，透析后保存于含有50%甘油、0. 02%叠氮钠的0. OlMPBS缓冲液中。实施例4单抗特异性的鉴定及应用Dffestern blot检测分别收集胶质母细胞瘤细胞系U251和U251/LRRC4细胞， 抽提蛋白，15% SDS-PAGE电泳后转印至PVDF膜上，5 %脱脂奶粉室温封闭1_2小时，将抗 LRRC4单抗用封闭液1 15000稀释，4°C孵育过夜。第2天取出用IX TBST溶液漂洗数次， 将带辣根过氧化物酶标记的二抗用封闭液1 2000稀释，37°C孵育1小时。取出用IXTBST 溶液漂洗数次后均勻滴加辣根过氧化物酶底物，暗室中压片，压片时间根据荧光信号的强弱决定，然后显影定影，观察结果。如图4所示，LRRC4单抗以1 15000稀释后仍能识别 LRRC4全长蛋白，且特异性好。2)细胞免疫荧光实验将U251/LRRC4细胞接种于6孔板，6父105个/孔，制成细胞爬片。将细胞爬片用丙酮/甲醇(按体积1 1配制)室温固定30分钟，0. OlMPBS洗涤 5分钟X3次(以下简称洗涤)；0. 25% Triton X_100(用0. OlM PBS配制)室温处理15 分钟，洗涤；正常羊血清室温封闭90分钟；将抗LRRC4单抗用封闭血清1 3000稀释，4°C 孵育过夜；第2天取出，洗涤后加带荧光标记的二抗(用封闭血清1 200稀释)37°C孵育 1小时；洗涤后在荧光显微镜下观察照相。如图5所示，LRRC4单抗能清晰识别U251/LRRC4 细胞中的LRRC4全长蛋白，表明该抗体不仅能用于Western blot检测，还能用于细胞免疫荧光实验，进一步证实了其实用性。
权利要求
1.人脑组织特异性基因LRRC4单抗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤选取LRRC4全长蛋白第460-521位，长度为62个氨基酸的多肽，序列为ETTEISPEDTTRK YKPVPTTSTGYQPAYTTSTTVLIQTTRVPKQVAVPATDTTDKMQTSLDE，作为动物的免疫原；应用多聚酶链式反应克隆编码该多肽的核苷酸序列，构建包含该核苷酸序列的His融合表达载体，转入大肠杆菌BL21 (DE3)，IPTG诱导His融合蛋白表达，Ni柱亲和纯化后免疫Balb/c小鼠，然后分离其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，经阳性克隆筛选及亚克隆化后制备腹水， 辛酸_硫酸铵沉淀法纯化获得抗LRRC4单抗。
2.人脑组织特异性基因LRRC4单抗，其特征在于，是由权利要求1所述的方法制备而成的单抗。
3.人脑组织特异性基因LRRC4单抗的应用方法，其特征在于，用于制备诊断和治疗胶质瘤的药物或试剂。
全文摘要
本发明涉及人脑组织特异性基因LRRC4单抗及其制备和应用方法。本发明选取LRRC4全长蛋白中亲水性好、抗原指数高且序列特异的一段多肽作为动物免疫原。应用多聚酶链式反应克隆编码该多肽的核苷酸序列，构建包含该核苷酸序列的His融合表达载体，然后诱导His融合蛋白表达，经纯化后免疫Balb/c小鼠，分离其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。融合细胞经阳性克隆筛选及亚克隆化后用以制备腹水并纯化获得抗LRRC4单抗。LRRC4在正常人脑组织中特异性高表达而在胶质瘤中表达下调，抗LRRC4单抗的制备将为深入研究LRRC4的生物学功能提供有利工具，以期为胶质瘤的诊断和治疗提供新的思路与方法。
文档编号A61P35/00GK102443062SQ201110379570
公开日2012年5月9日 申请日期2011年11月25日 优先权日2011年11月25日
发明者唐海林, 李丹, 李小玲, 李桂源, 武明花, 王泽友, 王蓉, 陈攀 申请人:中南大学