专利名称：雷公藤甲素在抑制ra滑膜血管新生药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药领域，具体地说，涉及雷公藤甲素在制备抑制RA滑膜血管新生药物中的应用。
背景技术：
雷公藤为卫矛科植物雷公藤的根，又叫黄藤、黄腊藤、菜虫药、红药、水莽草。雷公藤是中药中治疗RA疗效肯定的药物。雷公藤甲素是从雷公藤中分离出的含有3个环氧基的二帖内酯化合物，是雷公藤发挥抗炎和免疫抑制作用的主要成分之一。已有多家文献报道，雷公藤甲素在体内外对RA具有较好的抗炎、免疫抑制和保护软骨的作用，其抗炎和免疫抑制涉及的主要机制包括:①下调T细胞受体的信号传道，抑制T细胞增殖，活化半胱氨酸蛋白酶，进而诱导T细胞凋亡；②调节细胞间粘附分子(ICAM)和血管细胞粘附分子(VCAM)表达，阻止白细胞穿过血管壁到达炎症部位；③抑制诱导型一氧化氮合酶(iNOS)及其产物前列腺素(PG)E2和一氧化氮(NO)的产生；④抑制趋化因子调节正常T细胞表达和分泌蛋白(RANTES)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和巨噬细胞炎症蛋白-1(MIP-1)趋化淋巴细胞和单核细胞向炎症部位迁移等；其发挥软骨保护的作用机制包括抑制基质金属蛋白酶(MMPs)的产生和基因表达，而对其内源性的特异性抑制剂HMPs则有增强作用。近年来研究表明，雷公藤能抑制(肿瘤)新生血管生成。研究发现，雷公藤甲素能抑制血管内皮细胞的迁移及血管内皮生长因子(VEGF)、尿激酶型纤溶酶原激活因子(uPA)等的表达与合成；雷公藤甲素体外抑制培养的脐静脉内皮细胞的增殖和迁移活性及管腔形成能力，抑制鸡胚尿囊膜的血管形成，其机制与抑制内皮细胞uPA和组织纤溶酶原激活物(t-ΡΑ)的蛋白和基因表达有关。RA是一种病因未明的以关节破坏为主的慢性、全身性的自身免疫系统疾病，其主要病理环节包括滑膜炎症增生，血管翳形成，以及软骨和骨组织的破坏等几个方面。已经证明雷公藤甲素具有很好的抗炎、免疫抑制和软骨保护作用，从而抑制RA的滑膜炎症、软骨破坏，但是对RA滑膜血管生成(血管翳)方面的抑制作用及机制尚未见报道。虽然，有文献报道雷公藤甲素具有抗(肿瘤)血管新生的作用，但是这些研究所采用的载体是体外培养的内皮细胞、平滑肌细胞、肿瘤细胞和/或鸡胚尿囊膜模型等，不具有RA滑膜血管新生的特异性，因此雷公藤甲素对RA滑膜血管新生方面的作用仍需要研究。VEGF/VEGF受体途径和血管生成素(Ang)/Tie2信息通路是调控血管生成的两条主要途径，在RA发病过程中受多种细胞因子如肿瘤坏死因子(TNF) α、白介素(IL)-1 β的调节。从VEGF/VEGF受体途径和Ang/Tie2信息通路切入探讨雷公藤甲素抗RA滑膜血管新生(血管翳)的作用机理，尚未见相关报道。本发明从VEGF/VEGF受体途径和Ang/Tie_2信息通路等血管生成调控通路切入，体内实验选择与人类RA临床特征最为接近的胶原诱导型关节炎(CIA)大鼠模型、体外实验采用RA病人滑膜成纤维细胞(RA-HFLS)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，首次探讨雷公藤甲素抗RA滑膜血管新生的作用及机理。
发明内容
本发明的目的是提供雷公藤甲素在制备抑制RA滑膜血管新生药物中的应用。本发明提供的药物被制成经胃肠道给药剂型或非胃肠道给药剂型。优选的药物为雷公藤甲素水溶液的口服剂型。药物的制备方法可按目前的常规方法制备。本发明的发明人采用DA大鼠构建胶原诱导性关节炎(CIA)模型，经雷公藤甲素低剂量(llug/kg)、中剂量(22^/1^)、高剂量(45^/1 )治疗4w后，明显抑制CIA大鼠炎症关节滑膜细胞的增生，减少滑膜中毛细血管和未形成管腔结构的新生血管的数量。采用免疫组化技术对炎症关节滑膜中血管内皮细胞标志物血小板-内皮细胞粘附分子(CD)31进行染色，结果显示雷公藤甲素能量效依赖的抑制滑膜中CD31的累积光密度(10D)，且22 45ug/kg剂量的作用显著，进一步的滑膜血管密度结果分析显示，CIA模型大鼠关节滑膜血管大量增生，且以小血管为主，雷公藤甲素能抑制滑膜小血管的增生。采用在体小鼠基质胶栓子实验研究发现50ng/ml剂量的雷公藤甲素可明显抑制VEGF诱导的基质胶内血管内皮细胞的浸润。采用体外实验研究结果显示，10 50ng/ml剂量的雷公藤甲素可显著抑制HUVEC的增殖，抑制VEGF诱导的HUVEC迁移，I 50ng/ml剂量的雷公藤甲素可显著降低HUVEC黏附能力，抑制VEGF诱导的HUVEC管腔形成能力，且呈现明显的浓度依赖性；同时，10 50ng/ml剂量的雷公藤甲素可显著抑制IL-1 β诱导的RA-HFLS的增殖活性和黏附能力，抑制VEGF诱导的RA-HFLS迁移，且呈现一定的剂量依赖性。以上体内外实验研究结果提示雷公藤甲素能抑制RA滑膜血管新生的作用。进一步采用体外实验探讨雷公藤甲素抑制滑膜血管新生的作用机制。I 50ng/ml剂量的雷公藤甲素显著抑制RA-HFLS分泌IL_17、VEGF、Angl，且对IL-17有剂量依赖性，10 50ng/ml雷公藤甲素的对TNF α和50ng/ml的雷公藤甲素对Ang2也有显著的抑制作用。50ng/ml剂量的雷公藤 甲素可显著上调HUVEC VEGFR2水平，10 50ng/ml剂量的雷公藤甲素能显著上调HUVEC Tie2表达水平。这些结果显示雷公藤甲素抑制RA滑膜血管新生的作用机制与其抑制血管新生相关因子TNFa、IL-17、VEGF、Angl、Ang2的蛋白表达，同时上调血管新生相关受体Tie2、VEGFR2的蛋白表达有关。本发明所述的雷公藤甲素可应用于抑制RA滑膜血管新生的药物中，开拓了雷公藤的新用途，为抑制RA滑膜血管新生的药物提供了新选择。
图1为本发明所述雷公藤甲素对CIA大鼠滑膜血管的作用；图2为本发明所述雷公藤甲素对CIA大鼠关节滑膜中⑶31表达的作用；图3为本发明雷公藤甲素对小鼠基质胶栓子中血管形成的作用(100X)；图4为本发明雷公藤甲素对VEGF诱导的HUVEC迁移的影响；图5为本发明雷公藤甲素对VEGF诱导的HUVEC管腔形成能力的影响；图6为本发明雷公藤甲素对VEGF诱导的RA-HFLS迁移的作用。图中:Con代表空白组；Mod代表模型组；TP代表雷公藤甲素处理组。
具体实施方式
下面结合实例，对本发明的具体实施方式
作进一步详细描述。以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实例I雷公藤甲素对CIA大鼠关节滑膜血管生成、血管标志物⑶31表达、血管密度的作用本试验所采用动物为健康、雄性DA大鼠(哈尔滨医科大学第二临床医院实验动物中心)，SPF级，60只，体重170±5g。恒温、恒湿喂养3天。实验期间自由饮水，饲固体饲料，喂养于中国中医科学院基础理论研究所实验动物中心。本试验所采用造模方法:按将0.lmol/L冰醋酸溶液加入牛II型胶原(购自Chondrex公司，批号:080280)中，4°C过夜,再加入等体积不完全弗氏佐剂(Chondrex公司，批号:090070)充分乳化，得到终浓度为lmg/ml的胶原乳化剂。给予除正常对照组外大鼠尾根部2 3cm处皮内注射胶原乳剂(100 μ I/只)，注射当日记为免疫第O天，第7天再次注射同等量胶原乳化剂，激活免疫。正常对照组以等量生理盐水对照处理。本试验取适量雷公藤甲素(福建医学科学院林绥教授提供)，适量二甲基亚砜DMSO(含量< 0.05% )溶解过夜，再用生理盐水配制成母液，4°C保存。给药剂量分别为
11μ g/kg，22 μ g/k g和45 μ g/kg ;给药途径为腹腔灌胃给药；给药体积为lml/100g体重大鼠，给药时间从第0-35天，每天一次。本试验空白对照为等体积生理盐水。本试验数据均以SPSS软件处理。实验结果见图1-2和表1-2所示。1.1雷公藤甲素对CIA大鼠关节滑膜血管生成的作用炎症关节组织HE染色实验结果显示，CIA模型大鼠关节滑膜细胞排列紊乱，增生明显，并呈绒毛状、或乳头状伸向关节腔深处，可见明显的新血管增生，新生血管多为毛细血管，由I到2层内皮细胞构成，无平滑肌细胞围绕，还可见大量未形成管腔结构的新生血管呈点状散在分布在滑膜当中。雷公藤甲素能明显抑制滑膜细胞的增生，减少滑膜中毛细血管和未形成管腔结构的新生血管的数量。见图1。1.2雷公藤甲素对CIA大鼠关节滑膜血管标志物⑶31表达和血管密度的作用⑶31是血小板源内皮细胞黏附分子，是血管内皮细胞标志物。炎症关节⑶31免疫组化染色实验结果显示(图2，表1)，正常大鼠滑膜血管中⑶31基本无表达，CIA模型大鼠关节滑膜中血管内皮细胞及滑膜细胞可见阳性表达，阳性细胞呈棕色。经雷公藤甲素治疗后能明显抑制滑膜组织中⑶31的阳性表达。图像分析结果显示CIA模型大鼠滑膜组织中⑶31阳性表达的IOD明显升高，雷公藤甲素能量效依赖的抑制滑膜中⑶31的10D，且22 45ug/kg剂量的作用显著。进一步从⑶31特异性染色得到的滑膜血管密度结果显示(表2)，CIA模型成功后，关节滑膜血管大量增生，血管增生以小血管为主，雷公藤甲素能抑制滑膜小血管的增生。表I雷公藤甲素对CIA大鼠关节滑膜中⑶31表达的作用
权利要求
1.雷公藤甲素在制备抑制RA滑膜血管新生药物中的应用。
2.一种抑制RA滑膜血管新生的药物，其特征在于，该药物的有效成分包括雷公藤甲素。
3.如权利要求2所述的药物，其特征在于，所述药物被制成经胃肠道给药剂型或非胃肠道给药剂型。
4.如权利要求2所述的药物，其特征在于，所述药物为口服剂。
5.如权利要求2-4任意一项所述的药物，其特征在于，该药物用于动物实验的有效剂量为 11 45 μ g/kgo
6.如权利要求2-4任 意一项所述的药物，其特征在于，该药物用于细胞实验的有效剂量为I 50ng/ml。
全文摘要
本发明提供了雷公藤甲素在制备抑制类风湿性关节炎(RA)滑膜血管新生药物中的应用。本发明所述的雷公藤甲素可应用于抑制RA滑膜血管新生的药物中，开拓了雷公藤的新用途，为抑制RA滑膜血管新生的药物提供了新选择。
文档编号A61P37/02GK103156864SQ20111042115
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月15日 优先权日2011年12月15日
发明者林娜, 刘春芳, 孔祥英, 郭炜, 李香斌 申请人:中国中医科学院中药研究所