用于治疗肠炎的益生菌组合物的制作方法

专利名称：用于治疗肠炎的益生菌组合物的制作方法
用于治疗肠炎的益生菌组合物本申请要求2010年I月28日提交的美国临时申请号61/299，116和欧洲专利申请EP10151998的权益，它们通过引用并入本文。本发明涉及医学、微生物学和营养学领域，并具体地，涉及一种新颖的益生菌组合物。具体地，已经分离出植物乳杆菌iLac tobaciIlus plan tarum )和乳酸片球菌(.Pediococcus acidilaciici )的新菌株，并组合在可用于治疗胃肠道疾病(诸如肠炎(例如，炎性肠病)和肠易激综合征)的制剂中。
背景技术：
溃疡性结肠炎(UC)、隐窝炎和克罗恩氏病是炎性肠病(IBD)的实例，所述炎性肠病的特征在于肠中的慢性炎症。临床症状是腹泻、腹痛、偶然性直肠出血、体重减轻、疲倦和 有时发热。尽管会发生在任何年龄，IBD最常见于青少年和年轻的成年人中，所以这些人可能遭受延迟的发育和矮化的生长。在欧洲和美国，该疾病的频率与I型糖尿病类似。IBD的临床进程有很大差异。具有轻度至中度征状的患者无需住院治疗。但是，10-15%的患者会发生该疾病的严重进程，其在许多情况下继之以外科手术。在医学上，通过减少炎症并从而控制胃肠道征状来治疗IBD。但是，目前尚不能在医学上治愈IBD。结肠切除术可以消除UC，但是会降低生活质量和增加并发症的风险。可利用的医学治疗包括使用5-对氨水杨酸(5-ASA)、皮质类固醇和免疫调节药物。通常使用5-ASA进行轻度至中度IBD征状的长期治疗,而皮质类固醇和免疫调节药物被用于治疗严重的征状。腹泻或腹痛作为5-ASA的副作用而出现，而皮质类固醇的长期使用经常显示出严重的副作用，包括骨质减轻、感染、糖尿病、肌肉消瘦和精神病学障碍。免疫调节药物会抑制免疫系统，这会控制IBD征状。但是，产生的免疫受损的状态会使患者易感许多疾病。肠易激综合征(IBS)是一种特征在于腹痛和/或不适的病症，其与改变的大便习惯或排便有关，其中征状不能通过结构或生化异常来解释。紧迫性、气胀和不完全肠运动的感觉也常见于IBS中。因此，它被归类在功能性胃肠道病症中，所述功能性胃肠道病症包括下述疾病诸如功能性气胀、非心源性胸痛、非溃疡性消化不良和慢性便秘或腹泻(Longstreth G. H.等人，2006)。值得注意的是，IBS对发病率和超出腹痛和不适以外的生活质量具有重大影响，因为有关的征状会影响患者的健康感和正常地起功能的能力(Dean B. B.等人，200δ)。在用于治疗IBS的药物开发领域，存在大量活动。在这点上，不同的抗抑郁药已经获得普及，尽管它们在临床试验中的效力是不大的，并且它们的临床实用性受到不利副作用的限制。血清素能性药剂已经表现出对IBS的总体征状的效力。但是，最近关于安全性的忧虑已经严重地限制了它们的应用。因此，IBS的新颖疗法的开发具有极大利益。益生菌被定义为“活的微生物，其在以特定数目摄入以后，会发挥超出固有的基础营养以外的健康益处”(Araya Μ.等人，2002; Guarner F.等人，1998)。来自双歧杆菌属的几种乳酸细菌和种是益生菌，这暗示，已经证实它们会促进特定健康效应。益生细菌必须满足与没有毒性、生存力、附着和有益效果有关的几个要求。这些益生菌特征是菌株依赖性的，甚至在相同种的细菌之间是不同的。因此，重要的是，找到具有在所有益生菌要求方面具有更好性能的那些菌株。已经进行了使用单独的或与抗生素相组合的益生菌的人临床试验，以鉴别这样的菌株和/或制剂其用于治疗具有IBD或IBS的患者，或用于保持已经治疗过的IBD患者处于缓解中。WO 96/29083和EP 554418公开了 2种寄居于肠的乳杆菌属菌株，包括植物乳杆菌 299v (DSM 6595)和干酿乳杆菌(ZacioAaciBw1S casei )鼠李糖亚种( / · Rhamnosus)271 (DSM 6594)。EP 415941公开了用于制备营养组合物的方法，所述方法包括用酶处理燕麦粥，然后与乳杆菌混合。美国专利7195906公开了从切除的并洗过的人胃肠道中分离出的双歧杆菌属菌株，其用于治疗炎性疾病，特别是胃肠道炎症性活动，诸如IBD和IBS。尽管具有有前途的潜力，需要大幅提高用于治疗炎性肠病(诸如IBD)以及其它胃肠道疾病(诸如IBS)的益生菌的效果。

发明内容
本发明的发明人已经发现，包含乳杆菌属和片球菌属菌株的组合物可有效地治疗肠炎。具体地，已经分离出3种属于植物乳杆菌属和乳酸片球菌属的新的益生菌菌株，所述菌株当组合进单一制剂形式时会有效地治疗肠炎。因而，在第一个方面，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含有效量的植物乳杆菌CECT 7484、植物乳杆菌CECT 7485和乳酸片球菌CECT 7483或其突变体或变体。植物乳杆菌菌株CECT 7485和CECT 7484以及乳酸片球菌菌株CECT 7483于2009年2月4日保藏在西班牙典型培养物保藏中心(Valencia，西班牙)。所有3种保藏的菌株都是活的，并保持与它们的保藏有关的所有特征。本文使用的术语“有效量”是指这样的活性剂的量其足够高以递送希望的益处，但是足够低以避免在医学判断范围内的严重副作用。显而易见，通过使用保藏的菌株作为原料，本领域的技术人员通过常规诱变或重新分离技术可以常规地得到其它突变体或其衍生物，它们保留或增强本文所述的形成本发明组合物的菌株的有关特征和优点。本领域的技术人员会判断用于测定菌株的抗炎活性、免疫调节活性或抗-IBS活性或抗-腹部气胀活性的适当方法。在下面的实施例中，显示了用于测量该活性的可行方法的实例。在一个实施方案中，所述突变体是遗传修饰的突变体。在本发明的第一方面的另一个实施方案中，所述变体是天然存在的变体。形成本发明的第一方面的组合物的一部分的菌株，可以是活细胞的形式。或者，所述菌株可以是非活细胞的形式。通常使用的菌株乳酸片球菌CECT 7483、以及植物乳杆菌CECT 7484和CECT 7485是活细胞的形式。但是，也可以延伸至非活细胞，诸如含有由乳酸片球菌CECT 7483、以及植物乳杆菌CECT 7484和CECT 7485生产的有益因子的杀死的培养物或组合物。这可以包括热杀死的微生物或通过暴露于改变的pH、声处理、辐射或遭受压力而杀死的微生物。由于非活细胞产品制备更简单，可以将细胞容易地掺入药物中，且贮存要求的限制比活细胞少很多。当以本发明的组合物的形式使用时，所述菌株优选地具有1:1:1的浓度比。
菌株CECT 7483,CECT 7484和CECT 7485表现出针对几种病原性的和潜在病原性的细菌菌株的显著抑制活性，同时表现出针对人胃肠道菌丛(flora)的常见共生菌株的微小拮抗作用。此外，这3种菌株表现出它们之间的显著抑制活性的缺乏，因而允许它们组合使用在单一制剂中。这是适当的，因为这意味着，在本发明的第一方面定义的组合物会在肠中发挥有益效果，这是由于3种菌株中的每一种的“完整”作用。将这些菌株组合成单一配方(即本发明的组合物)，会在不同的肠炎动物模型中表现出改善临床症状(诸如体重减轻和腹泻)的能力。与这些结果相一致，本发明的组合物显示出显著减少急性(IL-6)和慢性(IFNy )细胞因子的独特能力。多个乳酸细菌种具有明显(apparent)安全的长期使用史。欧洲食品安全性当局已经开发了一个系统，该系统将“合格的安全性推测”(QPS)状况授予具有经证实的明显安全的长期使用史的分类单位。菌株CECT 7483,CECT 7484和CECT 7485属于具有QPS状况的细菌种(Andreoletti O.等人，2008)。本发明的菌株具有下述优点它们作为益生菌是特别有用的。如上所述，益生细菌必须满足与没有毒性、生存力、附着和有益效果有关的几个要求。这些益生菌特征是菌株依·赖性的，甚至在相同种的细菌之间是不同的。因此，重要的是，找到具有在所有益生菌要求方面具有更好性能的那些菌株。下面的实施例提供了(作为实例)测定每个益生菌特征的方案，还证实了所述菌株具有优良的益生菌特征。对抗微生物剂的抗性在细菌中的出现和传播，产生对人和动物健康的威胁，并造成重大的财政和社会成本。当对抗微生物剂的抗性为细菌种所固有时，它通常被称作‘固有抗性’(有时称作‘天然抗性)。认为固有抗性具有微小的水平传播潜力，而认为由添加的基因介导的获得性抗性具有高横向传播潜力。本发明的发明人已经发现，形成本发明的组合物的菌株不会表现出对具有人和/或兽医重要性的抗生素(氨苄西林、庆大霉素、链霉素、红霉素、四环素、克林霉素和氯霉素)(根据欧洲食品安全性当局的指南(Anad0n A.等人，2005; Bories G.等人，2008))的任何显著抗性，因而排除了抗生素抗性向病原性物种的潜在转移的风险。另外，本发明的发明人已经发现，菌株CECT 7483,CECT 7484和CECT 7485可以与用于治疗IBD的其它药物(诸如美沙拉秦)共同施用。如下面显示的，即使使用饱和浓度的美沙拉秦，也没有完全抑制所述菌株的生长。换而言之，即使使用高浓度的美沙拉秦，本发明的包含益生菌菌株的组合物的效力没有受损，因此，它可以发挥益生菌功能和抗炎功能。已经证实，本发明的菌株对哺乳动物的胃肠道环境条件(酸性环境、胆汁盐以及高溶菌酶和氧、过氧化物浓度)是高度抗性的，因而能够穿过胃肠道(在下文中也称作“GIT”)存活。所述菌株也具有良好的对肠上皮的附着力，这允许它们保留在肠道中，并发挥它们的益生菌作用。此外，本发明的菌株在宿主中具有几种有益效果。除了在肠中的抗炎活性以外，它们有益于肠小型生物群平衡，这是由于它们的拮抗活性。术语“拮抗活性”表示，益生细菌的活动对胃肠道非有益细菌的生长的抑制。具有不适当的胃肠道微生物平衡的情况称作生态失调(disbiosis),且对人健康具有多种不利后果。在下面将证实,与其它商业菌株相比，所述菌株具有更高的抑制病原性菌株的生长的能力。另外，如上所述，发明人已经发现，本发明的新菌株在它们中没有表现出显著抑制活性。
另外，已经发现，形成本发明的第一方面的组合物的菌株会生产大量短链脂肪酸(SCFA)0从不可消化的纤维生产SCFA，是一项令人感兴趣的益生菌特性。该特性在益生菌中是合乎需要的，因为生产的SCFA会在宿主中显示出几种有益性质。在它们的不同性质中，SCFA、特别是丁酸可被肠粘膜容易地吸收，刺激钠和水在结肠中的吸收，且对肠粘膜是营养性的(D’Argenio G.等人，1999; Tedelind S.等人，2007)。此外,丁酸被结肠细胞(colonocyte)用作燃料。在配方中的每种菌株是不同SCFA(乙酸、丙酸或丁酸，它们是在肠中发现的3种主要SCFA)的强生产菌。对短链脂肪酸如何作用于炎症过程的更好理解，可以帮助提高当前的肠炎治疗的效力。在这点上，已经报道了 SCFA和通过G蛋白偶联的受体来调节炎性病症之间的联系(Maslowski K. M.等人，2009)。此外，菌株CECT 7483, CECT 7484和CECT 7485会促进在宿主中的免疫调节效应，因为它们会诱导提高的来自肠粘膜的细胞因子模式。这些免疫调节效应对宿主是有益的，因为它们会帮助实现提高的疾病抗性和减少的变态反应风险。已知在GIT中的革兰氏阴性细菌会在它们的表面上展示分子脂多糖(LPS)，所述脂多糖会诱导肠粘膜细胞的促炎症信 号生产。益生菌补充可以改变该情形，以利于更多的革兰氏阳性细菌(分组在乳酸细菌组中)在GIT中的存在，具有更好的生态适应性，或具有针对一些革兰氏阴性微生物的拮抗性质。尽管如此，一些益生菌微生物表现出调节细胞因子生产的能力，所述细胞因子是调节体内的炎症应答和免疫应答的信使分子。具体地，一些益生细菌会在肠粘膜中诱导促炎/抗炎信号传递之间的更好平衡模式(不论对革兰氏阴性细菌的影响)。如下面将例证的，经发现，本发明的组合物的菌株会促进炎症性细胞因子(IFN-Y和IL-6)水平的降低，由此诱导提高的来自肠粘膜的细胞因子模式。菌株在减少病原性的革兰氏阴性细菌在GIT中的存在方面的拮抗性质会补充该免疫调节作用。已知，非活细菌以及细菌组分自身可以具有免疫调节效应。例如，已经报道，乳杆菌属各种的细胞组分会诱导抗炎细胞因子(Pathmakanthan S.等人，2004)或减少促炎细胞因子(Zhang L.等人，2005)。在分离出这些组分以后，预见到药物级操作。考虑到下面显示的结果，显而易见，形成本发明的第一方面的组合物的菌株CECT7483、CECT 7484和CECT 7485的特征在于诸如下述具体特性在胃肠道中存活，附着于肠粘膜，对氧化性应激的抗性，生产具有抗炎活性的代谢物(短链脂肪酸或具有所述活性的其它产物)和在它们之间没有拮抗作用。从现有技术不能明显地推导出本发明的组合物和分离的菌株，因为它们是复杂研究的结果，并且已经得到的关于肠炎活性的结果是令人惊奇的。在下面包括了用于测定每种所述特性的方案。从本申请的内容中，本领域技术人员可以发现属于乳杆菌属和片球菌属(更具体地，植物乳杆菌种和乳酸片球菌种)的其它菌株，当单独地施用或组合进单个组合物中时，所述菌株会表现出与在本申请中描述的那些相同的益生效果和治疗效果。在第二个方面，本发明提供了一种用作药物的组合物，其包含有效量的本发明的菌株或其突变体菌株。具体地，已经发现，包含菌株CECT 7483,CECT 7484和CECT 7485的组合物在IBD模型中在肠中具有抗炎活性。如上面所解释的，肠炎是IBD的主要特征之一。因而，本发明的第一方面的组合物可用于预防或治疗所述疾病。因此，在第三个方面，本发明提供了用于预防或治疗动物(包括人)的肠炎的、在本发明的第一方面中定义的组合物。或者，可以将该方面表述为，在本发明的第一方面中定义的组合物用于生产药物的用途，所述药物用于预防和/或治疗肠炎。或者，可以将该方面表述为，一种用于预防和/或治疗动物(包括人)的肠炎的方法，所述方法包括给所述有此需要的动物施用有效量的在本发明的第一方面中定义的组合物。在本发明的第三方面的一个实施方案中，所述组合物用于治疗或预防炎性肠病。从在实施例中报道的、使用IBD模型得到的数据(参见下面)可以看出，本发明的菌株(其可以有效地治疗以肠炎和腹泻为特征的病症)的施用也可以用于治疗以肠粘膜或粘膜下层的炎症为特征且腹泻流行的其它病症，诸如由放射疗法或化学疗法造成的肠炎。肠炎是腹部和骨盆放射疗法的常见副作用，影响60-70%的患者。肠炎可以造成放射治疗方案的时间表变化，以减少副作用，这可能导致治疗的最适度以下的抗肿瘤效力。目前，对放射疗法诱发的肠炎没有预防策略。但是，已经证实，一些益生菌在随机化的临床试验(RCT)中是有前途的。组合了 SCFA生产的健康促进作用、耐受在发炎的粘膜中存在的反应性氧和氮物质的能力、以及针对机会致病菌的抗微生物活性的益生菌组合物(诸如本发明的益生菌 组合物)，可以用于治疗放射疗法和化学疗法诱发的肠炎。另一方面，发明人已经发现，本发明的菌株可有效地治疗IBS。如下面显示的，本发明的第一方面的组合物可用于治疗IBS，这通过随机化的双盲安慰剂对照的干预试验来评估。因此，在第四个方面，本发明提供了用于预防和/或治疗IBS的本发明的第一方面的组合物。或者，可以将该方面表述为，在本发明的第一方面中定义的组合物用于生产药物的用途，所述药物用于预防和/或治疗IBS。或者，可以将该方面表述为，一种用于预防和/或治疗动物(包括人)的IBS的方法,所述方法包括给所述有此需要的动物施用有效量的在本发明的第一方面中定义的组合物。此外，发明人已经发现，由于菌株的特征，本发明的第一方面的组合物可用于治疗腹部气胀(bloating)和膨胀(distension)。如下面显示的，当将本发明的组合物施用给遭受腹部气胀和膨胀的人时，观察到令人惊奇的改善。因此，在第五个方面，本发明提供了用于治疗腹部气胀和膨胀的本发明的第一方面的组合物。或者，可以将该方面表述为，在本发明的第一方面中定义的组合物用于生产药物的用途，所述药物用于治疗腹部气胀和膨胀。或者，可以将该方面表述为，一种用于治疗动物(包括人)的腹部气胀和膨胀的方法，所述方法包括给所述有此需要的动物施用有效量的在本发明的第一方面中定义的组合物。在遭受IBS和/或腹部气胀和膨胀的人中观察到的令人惊讶的有益效果可能是由于下述事实本发明的菌株CECT 7483、CECT 7484和CECT 7485具有生产在表6中列出的SCFA的能力和在表3中显示的拮抗活性。本领域众所周知，SCFA会调节肠运动性。具体地，已知SCFA会刺激大鼠结肠中的5-轻色胺(5-HT)释放(Fukumoto S.等人，2003; Tazoe H.等人，2008),这在肠运动性和感觉的调节中起关键作用。类似地，已经描述丁酸会减少人志愿者的肠的内脏敏感度(Vanhoutvin S. A.等人，2009)。由此可以得出结论,形成本发明的组合物的菌株不仅可以用于治疗IBS或腹痛，而且可以用于治疗与胃肠道运动性和/或胃肠道疼痛有关的其它病症，诸如功能性便秘或功能性腹泻。
从现有技术不能明显地推导出本发明的组合物和分离的菌株，因为它们是复杂研究的结果，并且已经得到的关于治疗IBS和腹部气胀和膨胀的功效的结果是令人惊奇的。令人惊奇地，发明人已经首次发现了具有治疗IBD和IBS的能力的乳酸片球菌菌株。不受理论的约束，认为所述能力是由于在本说明书中指出的分离的片球菌属菌株的具体性质。考虑到在本发明的说明书中提供的教导和方案，本领域的技术人员将能够发现具有与本申请的一个目标相同的益生特征和治疗特征的其它乳酸片球菌菌株。包含有效量的本发明的菌株或它们的突变体的根据本发明的组合物可以配制为可食用的、药用的或兽药用的产品，其中所述菌株是唯一活性剂，或与一种或多种其它活性剂相混合，和/或与药学上或兽药学上可接受的赋形剂(在药用的或兽药用的产品的情况下)或适当的添加剂(在可食用的产品的情况下)相混合。在本发明的一个具体实施方案中，所述产品另外含有一种或多种其它的活性剂。优选地，所述其它的活性剂是其它益生细菌，其不会拮抗形成本发明的组合物的菌株。根据制剂，所述菌株可以以下述方式添加作为纯·化的细菌，作为细菌培养物，作为细菌培养物的一部分，作为已经后处理的细菌培养物，且单独地或与合适的载体或成分一起添加。也可以加入益生元。在其它方面，本发明提供了药用的和兽药用的产品，所述产品含有有效量的本发明的组合物以及适量的药学上或兽药学上可接受的赋形剂。在这点上，所述药用产品可以制备成任意合适的形式，所述形式不会不利地影响形成本发明的组合物的菌株的生物利用度。因而，本发明的组合物可以配制成以下述形式口服施用例如，冷冻干燥的粉末、胶囊、液体制品等。考虑到组合物的具体目的，赋形剂和最适当的配制方法的选择是在药物技术领域的普通技术人员的知识范围内。尽管口服给药是优选的，其它形式是可能的，诸如注射的、直肠的或局部的。本文使用的术语“药学上可接受的”是指这样的化合物、物质、组合物和/或剂型其在合理的医学判断范围内，适用于接触受试者(例如人)的组织，没有过度的毒性、刺激、变应性应答或其它问题或并发症，与合理的收益/风险比相称。每种载体、赋形剂等还必须是“可接受的”，其含义是，与制剂的其它成分相容。合适的载体、赋形剂等可以参见标准的药学教材。同样地，术语“兽药学上可接受的”是指适用于接触非人动物的组织。本发明的菌株也可以被包含在多种可食用的产品中，诸如乳制品、酸乳、凝乳、干酪(例如quark、奶油、加工过的、软的和硬的)、发酵乳、奶粉、基于奶的发酵的产品、冰淇淋、基于发酵的谷物的产品、基于奶的粉末、饮料、调味品和宠物食品。术语“可食用的产品”在本文中以它的最广泛的含义使用，包括处于任意呈现形式的、可以被动物摄入的任意类型的产品，但是不包括药用的和兽药用的产品。其它可食用的产品的实例是肉制品(例如肝糊、香肠和意大利腊肠或肉糊)、巧克力糊、填充物(例如松露、乳油)和霜白状糖覆、巧克力、糖果(例如焦糖糖果、软糖或太妃糖)、烘焙食品(蛋糕、馅饼)、调味料和汤、果汁和咖啡白化齐U。特别令人感兴趣的可食用的产品是饮食添加物和婴儿配方。从本发明的意义上而言，饮食添加物也包括营养制品，所述营养制品已知是对人健康具有医疗效果的食品提取物。用于动物食物的饲料也被包括在本发明的范围内。本发明的组合物也可用作在其它食物产品中的成分。因此，在本发明的另一个方面，提供了一种可食用的产品，其含有本发明的组合物以及适当量的可食用的成分。优选地，本发明的组合物是饮食添加物。
组合物中的每种菌株的菌落形成单位(cfu)的有效量由本领域技术人员来确定，且取决于最终的制剂。例如，根据现行法律，在可食用的产品中，所述菌株以约IO5 cfu/g至约IO12 cfu/g的量、优选约IO7 cfu/g至约IO12 cfu/g的量存在。术语“菌落形成单位”(“cfu”)被定义为，通过在琼脂平板上的微生物学计数所揭示的细菌细胞的数目。饮食添加物通常含有在IO7至IO12 cfu/g范围内的量的益生菌菌株。在一个具体实施方案中，本发明的组合物是包含IO9-IO11 cfu/g的饮食添加物。通过在合适的培养基中和在合适的条件下培养所述细菌，生产本发明的菌株。可以单独地培养所述菌株，以形成纯的培养物，或作为与其它微生物一起的混合培养物，或通过分别培养不同类型的细菌、然后以希望的比例混合它们。在培养以后，回收细胞悬浮液，并原样使用，或以希望的方式(例如，通过浓缩或 冷冻干燥)进行处理，以进一步用于药用的或可食用的产品的制备中。有时，对益生菌制品进行固定或包囊过程，以便提高贮存期限。用于细菌的固定或包囊的几种技术是本领域已知的。如果根据本发明的组合物用作饮食添加物，它可以原样使用，或可以与合适的可饮用的液体(诸如水、酸乳酪、奶或果汁)相混合，或可以与固体或液体食物相混合。在该背景下，所述饮食添加物可以是片剂、丸剂、胶囊、颗粒、粉末、混悬液、药囊、软锭剂、糖果、条、糖浆剂的形式和对应的施用形式，通常是单位剂量形式。优选地，本发明的组合物以片剂、胶囊或粉末的形式施用，在制备药物产品的常规方法中生产。在本说明书和权利要求书中，词语“包含”和它的变化无意排除其它技术特征、添加剂、组分或步骤。本领域技术人员在查阅说明书以后会明白本发明的其它目的、优点和特征，或可以从本发明的实践中学习。此外，本发明覆盖了本文描述的具体的和优选的实施方案的所有可能的组合。


图I描绘了 Not-I或Sfi-I (左)和Sma-I (右)限制的下述菌株的基因组DNA的脉冲场凝胶电泳图谱1，乳酸片球菌CECT 7483 ;2，植物乳杆菌CECT 7484 ;3，植物乳杆菌CECT 7485。作为对照4，商业菌株乳酸片球菌RosselllOOl (Institut Rossell,加拿大)；5，植物乳杆菌 299v (Probi AB，瑞典);和 6，从商业产品 VSL#3 (VSL Pharmaceuticals，美国)分离出的植物乳杆菌菌株。该图涉及“菌株基因分型”部分。图2描绘了在一组遭受DSS诱发的肠炎的小鼠中的疾病活性指数(Y-轴)。X-轴表示a，在一组遭受DSS诱发的肠炎的小鼠中施用本发明的益生菌制剂；b，在一组遭受DSS诱发的肠炎的小鼠中施用商业的益生菌制剂(VSL#3);c，在一组遭受DSS诱发的肠炎的小鼠中施用媒介物；和d，在健康的对照组中施用媒介物。该图涉及“对化学诱导的肠炎的体内影响”部分。图3描绘了在一组遭受DSS诱发的肠炎的小鼠中的IL-6水平(Y-轴)。X-轴表示a，在一组遭受DSS诱发的肠炎的小鼠中施用本发明的益生菌制剂；b，在一组遭受DSS诱发的肠炎的小鼠中施用商业的益生菌制剂(VSL#3) ;c，在一组遭受DSS诱发的肠炎的小鼠中施用媒介物；和山在健康的对照组中施用媒介物。该图涉及“对化学诱导的肠炎的体内影响”部分。图4描绘了在IL-10敲除的小鼠模型中无征状周的数目(即在第一种征状出现之前的周数，因而是等于零的疾病活性指数)(Y-轴)。X-轴表示a，将本发明的益生菌组合物施用给IL-IO敲除的小鼠组；b，将商业的益生菌制剂VSL#3施用给IL-10敲除的小鼠组；c，将PBS施用给IL-10敲除的小鼠组；和d，在健康的对照组中施用媒介物。该图涉及“对自发性肠炎的体内影响”部分。图5描绘了在IL-10敲除的小鼠模型中的IFN-Y水平(Y-轴)。X-轴表示a，将本发明的益生菌组合物施用给IL-10敲除的小鼠组；b，将商业的益生菌制剂VSL#3施用给IL-10敲除的小鼠组；c，将媒介物施用给IL-10敲除的小鼠组；和d，在健康的对照组中施用媒介物。该图涉及“对化学诱导的肠炎的体内影响”部分。图6描绘了在IL-10敲除的小鼠模型中的IL-6水平(Y-轴)。X-轴表示a，将本发明的益生菌组合物施用给IL-10敲除的小鼠组；b，将商业的益生菌制剂VSL#3施用给IL-10敲除的小鼠组；c，将媒介物施用给IL-10敲除的小鼠组；和d，在健康的对照组中施用媒介物。该图涉及“对化学诱导的肠炎的体内影响”部分。 图7描绘了与用包含组合物(黑色条)或安慰剂(白色条)的胶囊治疗的志愿者的基线(Y-轴)相比，IBSQoL评分的变化。X-轴表示在治疗21天和42天以后的评分的变化。该图涉及在“对IBS受试者的体内效力”部分中的“健康相关的生活质量的改善”。图8描绘了与用包含组合物(黑色条)或安慰剂(白色条)的胶囊治疗的志愿者的基线(Y-轴)相比，VSI评分的变化。X-轴表示在治疗3周和6周以后的评分的变化。该图涉及在“对IBS受试者的体内效力”部分中的“内脏敏感度的改善”。
实施例下述部分描述了本发明的菌株的表征、它们的具体的益生菌特征和它们对胃肠道和免疫系统的生理效应。如在下文中使用的，菌株F1033对应着乳酸片球菌CETC 7483，菌株F2064对应着植物乳杆菌CECT 7484，且菌株F2076对应着植物乳杆菌CECT 7485。I.微牛物的分离 A)方法
对于微生物的分离，从0-5岁儿童收集新鲜的粪便和唾液(Daniel C.等人，2006)，并溶解在PBS缓冲液(pH 7. 4)中，等分试样，并铺板在补充了不同抗生素组合的MRS上。在微量需氧条件下(5% CO2)在37°C培养菌株。培养时间取决于生长速率，但是通常培养24 h至3天。进行革兰氏染色，以便获得第一次鉴别。培养后，通过在含有15%脱脂奶粉的PBSO. IX中冷冻干燥，保存分离的菌株。B)结果
在补充了 10 yg/ml万古霉素的MRS琼脂上，培养新颖的菌株F2064、F2076和F1033。显微镜检查揭示，菌株F2064和F2076是革兰氏阳性杆菌，而菌株F1033是具有球菌形态学的革兰氏阳性菌。2.鉴别 A)方法
使用Wizard基因组DNA纯化试剂盒(Promega)，提取基因组DNA。对于每种分离的菌株，使用通用引物 27f、357f、907r 和 1492r (Weisburg W. G.等人，1991)，通过 PCR扩增16S基因，这会产生几乎全长的16S rRNA片段(1465 bp)。使用Quiaquick试剂盒(Quiagenej GmbH, Hildenj 德国)，洗搽 DNA，使用 BigDye v. 3. I 试剂盒，在 Genetic 分析仪3130 (Applied Biosystems)上，对每个样品进行4个测序反应。使用选择的测序引物DNA序列分析V. 5. 2 (Applied Biosystems)软件收集数据并构建色谱图，这通过Chromas(Technelysium Pty Ltd.)和 BioEdit (Ibis Biosciencies)软件进行分析。通过将得到的序列与来自 RefSeq 数据库(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/RefSeq/)(借助于 BLASTN检索(Altschul S. F.等人，1990))和来自核糖体数据库计划(Wang Q.等人，2007)的已知生物体的16S序列进行对比，进行属和种鉴别。表I:用于扩增和测序16S基因的引物。
权利要求
1.一种组合物，其包含有效量的植物乳杆菌CECT 7484、植物乳杆菌CECT 7485和乳酸片球菌CECT 7483或它们的突变体或变体。
2.一种组合物，其包含有效量的植物乳杆菌CECT 7484、植物乳杆菌CECT 7485和乳酸片球菌CECT 7483。
3.权利要求1-2中的任一项中定义的组合物，其用作益生菌。
4.权利要求1-2中的任一项中定义的组合物，其用作药物。
5.权利要求1-2中的任一项中定义的组合物，其用作免疫调节剂。
6.权利要求1-2中的任一项中定义的组合物，其用于预防和/或治疗肠炎。
7.在权利要求1-2中的任一项中定义的组合物用于生产药物的用途，所述药物用于预防和/或治疗肠炎。
8.根据权利要求6所述的组合物或根据权利要求7所述的用途，其用于预防和/或治疗炎性肠病。
9.根据权利要求1-2中任一项所述的组合物，其用于预防和/或治疗肠易激综合征。
10.根据权利要求1-2中任一项所述的组合物，其用于预防和/或治疗腹部膨胀和气胀。
11.一种药用产品，其包含有效量的在权利要求1-2中的任一项中定义的组合物以及适当量的药学上可接受的赋形剂。
12.—种兽药用产品，其包含有效量的在权利要求1-2中的任一项中定义的组合物以及适当量的兽药学上可接受的赋形剂。
13.一种可食用的产品，其包含有效量的在权利要求1-2中的任一项中定义的组合物以及适当量的其它可食用的成分。
14.根据权利要求13所述的可食用的产品，它是饮食添加物。
15.在登录号CECT7484下保藏在西班牙典型培养物保藏中心中的植物乳杆菌菌株或其突变体或变体。
16.在登录号CECT7485下保藏在西班牙典型培养物保藏中心中的植物乳杆菌菌株或其突变体或变体。
17.在登录号CECT7483下保藏在西班牙典型培养物保藏中心中的乳酸片球菌菌株或其突变体或变体。
18.用于预防和/或治疗人的胃肠道疾病的乳酸片球菌菌株。
19.根据权利要求18所述的乳酸片球菌，其用于预防和/或治疗肠炎。
20.根据权利要求19所述的乳酸片球菌，其中所述胃肠道疾病是炎性肠病(IBD)。
21.根据权利要求18所述的乳酸片球菌，其用于预防或治疗肠易激综合征(IBS)。
22.根据权利要求18所述的乳酸片球菌，其用于治疗腹部膨胀和气胀。
23.根据权利要求18-22中的任一项所述的乳酸片球菌，其是在登录号CECT7483下保藏在西班牙典型培养物保藏中心中的乳酸片球菌菌株。
全文摘要
所述组合物包含有效量的植物乳杆菌CECT7484、植物乳杆菌CECT7485和乳酸片球菌CECT7483。该组合物可用于治疗胃肠道疾病或病症，诸如炎性肠病、肠易激综合征或腹部膨胀和气胀。
文档编号A61K35/74GK102905712SQ201180007399
公开日2013年1月30日 申请日期2011年1月27日 优先权日2010年1月28日
发明者J.埃斯帕达勒马佐, J.库内卡斯特拉纳 申请人:Ab－生物学有限公司