专利名称：呈可溶和结晶形式的长效胰岛素类似物制剂的制作方法
呈可溶和结晶形式的长效胰岛素类似物制剂相关申请的交叉引用
本申请要求于2010年2月22日提交的未决美国临时申请号61/306，722的权益。关于联邦政府资助研发的声明
本发明在政府支持下完成，合作协议由国立卫生研究院授予，合约号为NIH ROlDK40949、R01DK069764和ROl - DK74176。美国政府可享有本发明一定的权利。发明背景 用于I型糖尿病治疗的胰岛素强化疗法需要皮下注射胰岛素制剂或胰岛素类似物制齐U。治疗方案可包括每天多次注射或连续皮下输注胰岛素或胰岛素类似物(“泵疗法”)。寻求在进餐期间、餐后和餐与餐之间及整个醒睡周期都对血糖浓度进行控制。因为仅由少数患者使用可以连续输注的泵，所以做了大量的努力来开发短效、中效和长效制剂，其通常被限定为有效作用时间分别在约4、12和18 - 24小时但可潜在持续至7、16和30小时的人胰岛素制剂、哺乳动物胰岛素制剂或胰岛素类似物制剂。出于避免夜间低血糖症和/或早晨高血糖症的需要，激发了对长效胰岛素制剂或长效胰岛素类似物制剂的特别关注。本发明涉及新型长效胰岛素类似物制剂的制备方法。该类制剂亦可用于治疗2型糖尿病。胰岛素给药是长期以来建立的糖尿病治疗法。胰岛素是小的球状蛋白质，在脊椎动物的新陈代谢中起着重要作用。胰岛素含有两条链含21个残基的A-链和含30个残基的B-链。该激素作为Zn2+ -稳定的六聚体储存于胰腺P细胞中，但在血流中以无Zn2+的单体发挥作用。胰岛素是单链前体胰岛素原的产物，胰岛素原中的连接区域(35个残基)将B链的C-末端残基(残基B30)连接到A链的N-末端残基上(
图1A)。最近通过核磁共振确定，正如长期想象的那样，作为工程改造的单体的胰岛素原的结构含有胰岛素-样核心和无序的连接肽(图1B)。认为三个特异性二硫键(A6 - All、A7 - B7和A20 - B19,图1B)的形成与糙面内质网(ER)中胰岛素原的氧化折叠偶联。从ER输出到高尔基体后，胰岛素原立即装配形成可溶的Zn2+ -配位的六聚体。在不成熟的分泌颗粒中发生内源蛋白分解的消化并转化成为胰岛素，接着是形态上的凝聚。已用电镜(EM)观测到成熟贮藏粒中的锌-胰岛素六聚体的结晶体。本发明阐述胰岛素类似物制剂，所述制剂引导新型含锌的多六聚体装配以改变皮下注射的活性胰岛素类似物作用的持续时间。用于治疗糖尿病的胰岛素类似物的设计，利用了胰岛素单体、二聚体和六聚体的三维结构。胰岛素单体含有三个a -螺旋、两个P -转角和两个延伸片段。A-链由N-末端a -螺旋(残基Al-AS)、不规则转角(A9-A12)、第二个a -螺旋(A12-A18)和C-末端延伸(A19-A21)组成。B链含有N-末端臂(B1-B6)、^ -转角(B7-B10)、中央a -螺旋(B9 - B19)、P -转角(B20 - B23)、P -链(B24 - B28)和柔性C -末端残基B29 - B30。两条链组装形成由三个二硫键(胱氨酸A6 - All、A7 - B7和A20 - B19)稳定的致密球状结构域。已对多种晶格形式的Zn2+ -配位的胰岛素六聚体进行了广泛的X-射线晶体学研究；多晶形限定了命名为R6的三个结构家族。在每种情况下，都发现两个Zn离子位于沿六聚体中心轴的位置(“轴锌离子”)，每一个Zn离子与三个组氨酸侧链(Hi Sb10)配位；在一些晶形中，已观测到另外的低亲和カ或部分被占据的锌结合位点。T-态原体类似于溶液中胰岛素单体的结构。R-态原体在B-链的ニ级结构上表现出变化中央a -螺旋延伸至BI (R态)或至B3 (破损的(fray) Rf态)。三个家族的六聚体在侧链组装的细微特点上亦有差別。胰岛素六聚体的皮下解体可以是注射的胰岛素药代动力学的关键驱动因素(driver) 0因此，药用胰岛素制剂设计通常基于锌胰岛素六聚体的装配或解体。例如，速效类似物可限制胰岛素六聚体的自我装配或加速六聚体的解体。另ー方面，长效类似物通常减缓皮下忙库(depot)的解体,或促进沉淀和自我装配。例如，关于Humalog 和NovoLog 的设计和药代动力学，构成的胰岛素类似物以六聚体注射，其必须解体以吸收到毛细血管中。那些类似物中的取代有助于六聚体解体以使速效胰岛素制剂成为可能。相比之下，长效Lantus 以初始単体和ニ聚体溶液注射，注射之后因皮下组织和体液的 缓冲，注射液的pH升高，単体和ニ聚体沉淀形成无定形的或微晶形的贮库。这些策略取决于ー个共同原则-皮下贮库中游离胰岛素单体或ニ聚体的利用度和毛细血管对其的吸收速率之间的关系。如此开发的多种胰岛素制剂提供多种药代动力学性质。联合短效、中效和长效胰岛素制剂或胰岛素类似物制剂使得可设计日常方案来抑制血糖浓度的波动，并因此优化血糖控制。临床制剂的主要种类有
普通胰岛素一拓キ私PH下将速效胰岛素制剂配制为可溶的锌胰岛素六聚体的透明溶液。起初作为抗微生物防腐剂引入的苯酚、间甲酚或对羟基苯甲酸甲酷，亦与六聚体结合以诱导T — R结构转换。R6六聚体表现出比经典的T6六聚体更高的热力学稳定性和动力学稳定性。类似的基于锌的六聚体胰岛素类似物制剂用于速效产品Humalog (Eli Lilly和Co.)和 Novolog (Novo - Nordisk)。NPH胰岛素一中效胰岛素制剂(NPH,中性鱼精蛋白锌胰岛素(neutral protamineHagedorn))，基于R6锌胰岛素六聚体的斜方晶体的混悬液，其含有苯酚(或间甲酚)和亚化学计量浓度的精蛋白，所述精蛋白为含有多个精氨酸残基的小的碱性肽的混合物。NPH胰岛素晶体的X-射线晶体学研究表明了这些碱性肽在其与锌胰岛素六聚体结合模式的晶体中的位置。已开发了另外类似的NPH制剂-速效赖脯胰岛素(insulin lispro) (Humalog 的活性组分)以允许混合方案。然而，NPH胰岛素的制备很困难并昂贵精蛋白是很多衍生自精子通常为牛精子的碱性肽；产生NPH晶体是艰难和复杂的过程，该过程围绕最先产生的均一晶种而建立。此外，NPH胰岛素易于纤维化。慢胰岛素(Lente Principle)一亦指胰岛素锌混悬液(IZS),通过向T6胰岛素六聚体混悬液中加入过量的锌离子(通常为20 - 30个/六聚体)来获得人胰岛素或动物胰岛素的延长作用。这种大幅度的过量导致与低亲和カ位点结合，并产生锌胰岛素络合物的无定形沉淀(无定形的半缓慢(Semilente)或IZS)或菱形的锌T6胰岛素微晶混悬液(结晶的超缓慢(Ultralente)或IZS)。通常将对羟基苯甲酸甲酯用作防腐剤，并与T6锌胰岛素六聚体的一个面结合。超缓慢制剂比半缓慢制剂更为长效，可通过混合无定形和结晶颗粒(缓慢或IZS，混合)来获得中间时程。制造中采用了下列两个步骤
(I)盧对游海ノ系碁# 一第一步在无防腐剂存在和PH 5. 5时，采用锌离子和高(超过生理学上的)浓度的氯离子(1.2 M NaCl)形成微晶种混悬液。前体晶体属于空间群R3且含有T3Rf3锌胰岛素六聚体，其中每个六聚体共结合四个锌离子(电荷为+8)和七个氯离子(电荷为-7)，共同提供的六聚体的形式电荷为+1。和普通制剂的R6六聚体不同，该前体六聚体仅含有一个轴向的锌离子，其位于T6三聚体之中。其它三个锌离子在Rf3三聚体内离轴。HisB1°与HisB5及两个氯离子一致转动而改变(flip)其构象以形成四面体的锌离子结合位点。这些离轴的位点邻近典型R6六聚体中的苯酚结合袋。超缓慢前体晶体的六聚体内部的离轴锌离子结合位点与本发明的界面/六聚体之间的锌结合位点无关。(2)產缓漫籍海蓄邊贫一为获得超缓慢微结晶混悬液，将晶种稀释到含对羟基苯甲酸甲酯、较低浓度氯离子(120 mM)和较高浓度锌离子的pH 7. 4的缓冲液中。晶体由空间群R3中的T6胰岛素六聚体组成。由于制剂中非常高的锌离子浓度(例如>5个/胰岛素分子)，在每个六聚体中观测到额外的锌离子。除正常的两个轴向锌离子外，观测到相互排斥的非典型、弱结合的两个位点之一的部分占据亦位于六聚体的中心。无足够质量的电子密度来分析结合的氯离子。成熟超缓慢晶体的六聚体内部的离轴锌离子结合位点亦与本发明的界面/六聚体之间的锌结合位点无关。 亦已知具延伸B -链的胰岛素类似物，其用超过2个锌/六聚体形成六聚体。具以下取代组的人胰岛素分别与6. 5,5. 3,6. 7和5个锌/六聚体形成稳定络合物GlyA21 -HisB31 - HisB32、GlyA21 - HisB31 - HisB32 - ArgB33、GlyA21 - AlaB31 - HisB32 - HisB33和 GlyA21 - AlaB31 - HisB32 - HisB33 - ArgB34。这些络合物(尤其是 GlyA21 - AlaB31 -HisB32-HisB33-ArgB34)在狗中亦显示长期的药代动力学。这可能是由于在各六聚体中，额外的锌离子与A-链的a -氨基和B-链C-末端的新组氨酸之间结合。算它一通过在皮下注射透明的酸性胰岛素类似物溶液(甘精胰岛素(insulinglargine), Lantus 的活性组分,Sanofi - Aventis)来实现作用的延长,其中胰岛素类似物的等电点已通过修饰人胰岛素的多肽序列偏移到7.0至7. 4之间。因在皮下组织pH (pH
7.4)下的沉淀而形成长效贮库。亦可通过以下来实现作用的延长通过非极性部分共价修饰胰岛素(地特胰岛素(insulin detemir)，Levimir 的活性组分；Novo - Nordisk)，以增强其在皮下贮库中的疏水性，并使之与血清白蛋白结合以延迟从血流中的清除。过去感兴趣的有动物胰岛素(例如猪的和牛的)的混合物，所述混合物利用它们在溶解性上的差异。本发明创新利用非轴锌离子(non-axial zinc ion)来延长本文提供的胰岛素类似物制剂作用的持续时间。本领域所知的先前对锌离子的利用如下。普通胰岛素制剂和相应的速效制剂Humalog 和Novalog 利用锌离子来引导和稳定胰岛素六聚体的装配。六聚体由通过中心三重对称轴相联的三个胰岛素二聚体组成。每一胰岛素六聚体或胰岛素类似物六聚体含有两个位于六聚体三重对称轴的锌离子。这些“轴锌离子”与HisB1°的咪唑环进行配位。在R6六聚体中，认为配位几何结构是四面体；因此每一个锌离子结合三个对称相关的HisB1°残基，且氯离子占据第四个配位点。两个轴锌离子(电荷+4)和两个配位氯离子(电荷-2)共给六聚体的总形式电荷增加+2。该结构中没有非轴锌离子。野生型NPH胰岛素微晶体的单晶X -射线衍射研究显示，每个六聚体中有两个轴锌离子而没有另外的锌离子。晶格为具有空间群斜方晶，这导致与本发明不一致的六聚体-六聚体组装模式(如下)。目前治疗糖尿病使用的大部分胰岛素产品含有序列不同于天然人胰岛素序列的胰岛素类似物。已广泛研究了胰岛素A-和/或B-链中氨基酸的取代对皮下注射后胰岛素作用的药代动力学的可能有利的影响。本领域所知的实例含有加速或延缓吸收时程的取代。前者的类似物总体定义为“进餐时间”胰岛素类似物，因为糖尿病患者可能在进餐时注射所述速效制剂；而延缓吸收的野生型人胰岛素或动物胰岛素(例如猪胰岛素或牛胰岛素)使得有必要在餐前30 - 45分钟注射这些制剂。设计取代以通过改变亚単位界面的空间或静电互补性而使锌胰岛素六聚体去稳定化，并从而有助于皮下给予后锌胰岛素六聚体的快速解离。将进餐时间胰岛素类似物配制成锌-胰岛素类似物六聚体的透明溶液(pH7. 4) (Humalog 和Novalog ),或配制为处于平衡的含有单体、ニ聚体、三聚体、四聚体和六聚体的无锌溶液(Apidra ；Sanofi - Aventis)。虽然在磷酸盐缓冲的锌溶液(类似于在人胰岛素和动物胰岛素的普通制剂中长期采用的)中配制Humalog 和Novalog ,但不像本领域所知的先前普通制剂，其装配为锌胰岛素六聚体需要苯酚、间甲酚或其它特异性配体的结合以稳定突变型胰岛素六聚体。本领域已知，用多种多样的氨基酸取代物(除半胱氨酸外)来取代ProB28，使锌胰岛素六聚体不稳定，其程度类似于Aspb28和LysB28，所述取代任选包括B29的脯氨酸取代。本领域亦知长效胰岛素类似物，其在12 - 24小时内的缓慢吸收意欲提供对血糖浓度的基础控制。所述类似物例如但不限于[GlyA21，ArgB31, ArgB32]-胰岛素(甘精胰岛 素或Lantus )，可设计含有氨基酸取代和/或A-或B-链的延伸，以将胰岛素类似物的等电点偏移至PH 7.0和7. 4之间。通常在pH < 5下，将类似物配制成含有可溶的胰岛素单体、ニ聚体和高阶低聚体的透明溶液，在PH < 5的条件下锌-介导的装配因HisB1°的质子化作用而受损。通过因PH偏移到7. 4而致的皮下组织中胰岛素类似物的聚集和沉淀来实现延长的吸收。以Lantus 出售的胰岛素制剂含有在pH 4的溶液中制为0. 6 mM的活性类似物[GlyA21, ArgB31, ArgB32]-胰岛素(甘精胰岛素)，其通过在无活性的组分间甲酚(2.7mg/ml 或 25 mM)、甘油(17 mg/ml 或 185 mM)、聚山梨醇酯-20 (20 y g/ml)和(30 iig 锌离子/ml或0. 52 mM)存在下加入等分试样的稀HCl或NaOH来制备。Lantus 的U - 100溶液含有0.60 mM [GlyA21，ArgB31, ArgB32]-胰岛素。因为本领域已知在野生型胰岛素中，AsnA21经受酸催化的化学变化，所以GlyA21取代的目的是避免在酸性溶液中的所述化学降解。本领域亦已知，另ー类型的长效胰岛素类似物的示例为地特胰岛素(商品名Levemi/)，其中残基ThrB3°已缺失，C14脂肪酸链与LySB29的侧链(分子量5912. 9道尔顿)连接。脂肪酸链增加胰岛素分子的疏水性，而疏水性与皮下贮库中的延迟吸收有夫。脂肪酸链亦介导胰岛素类似物与血清白蛋白的结合，并因此延长其循环寿命。将地特胰岛素配制成可溶的锌-胰岛素类似物六聚体(14. 2 mg/ml或2. 5 mM胰岛素单体单位，定义为U - 100溶液)透明溶液，其在无活性的赋形剂氯化钠(I. 17 mg/ml)、间甲酚(2.06 mg/ml)、苯酚(I. 80 mg/ml mM)、甘露醇(30 mg/ml)和锌离子(65. 4 u g/ml或I. I mM)存在下，用磷酸钠(0. 89 mg/ml ニ钠ニ水合物)将pH缓冲为7. 4。锌离子浓度相当于每个六聚体大约2. 6个锌离子的比率。相对于野生型人胰岛素，地特胰岛素的摩尔活性降低约4倍。在锌离子和苯酚存在吋，des - ThrB30/C14 - Lyse29 -修饰的胰岛素类似物的晶体结构类似但不等同于存在于其制剂中的结构，所述制剂描述了在晶体晶格中的六聚体之间填充有脂肪酸的天然样R6六聚体。在皮下贮库中形成的地特胰岛素的物理状态和结构尚不为本领域所知。因此，有必要对胰岛素类似物进行联合取代，其可在锌胰岛素类似物的六聚体表面和六聚体之间联合产生新的锌-结合位点，并借此提供长效皮下蛋白贮库的形成。
胰岛素属于脊椎动物胰岛素-相关蛋白超家族，包括(除胰岛素自身外)胰岛素-相关生长因子I和II (IGF - I和IGF - II)、松弛素和松弛素-相关因子。这些蛋白质表现出同源的a -螺旋结构域和二硫键。IGF是含有A-和B结构域、间插连接的(C)结构域和C-末端D结构域的单链多肽；由于蛋白水解加工，胰岛素和松弛素-相关因子含有两条链(命名为A和B)。然而，在整个脊椎动物胰岛素-相关超家族中，六个基序特异性的半胱氨酸和所选的核心残基大体保守，其它残基受限于特定蛋白质，这赋予其功能特异性。胰岛素和IGF充当受体酪氨酸 激酶(胰岛素受体(IR)和I类IGF受体(IGF - IR))的配体，而松弛素和相关因子与G-蛋白偶联受体(GPCR)结合。胰岛素与IR的结合最强，与IGF- IR的结合弱，与GPCR无可检测的结合。IGF - I与IGF - IR的结合最强，与IR的结合弱，与GPCR无可检测的结合。胰岛素与IGF - IR的交叉结合可触发有丝分裂信号转导途径，包括与癌细胞增殖有关的途径。通过使用含有氨基酸取代(其降低所述交叉结合程度)的胰岛素类似物，可提高糖尿病治疗中胰岛素补偿疗法的长期安全性。所述氨基酸取代将提高胰岛素类似物对IR的亲和力与对IGF - IR的亲和力的比率。因此，需要长效胰岛素类似物制剂，其中活性组分(单体形式的胰岛素类似物组分)表现出对IGF - IR的固有亲和力降低，胰岛素类似物对IR的亲和力与对IGF - IR的亲和力的比率增加，其中每种情况均相对于野生型人胰岛素而言。甘精胰岛素与胰岛素-样生长因子I (IGF - I)的I型受体的结合比人胰岛素更强。该受体(IGF-IR)可介导有丝分裂信号转导途径并抑制凋亡。估计IGF- IR结合及信号转导的增强程度在因数I. 4和14之间，这取决于所采用的体外测定或基于细胞的测定。所述IGF- IR结合及信号转导的增强与培养物中人癌细胞系增殖的增加有关。在配制条件下的或在皮下贮库中形成的[GlyA21，ArgB31, ArgB32]-胰岛素的物理状态或分子结构尚不为本领域所知。十多年前，首次提出了对表现出对IGF-IR的相对或绝对亲和力增加的胰岛素类似物的安全性忧虑，这是因为人癌细胞系的细胞培养研究中AspB1°-胰岛素(相对于人胰岛素)的有丝分裂原活性(mitogenicity)增强以及因为用AspB1° -胰岛素处理(相对于用人胰岛素处理)的Sprague - Dawley大鼠的乳腺癌发病率的增加，因此，不继续将Aspmo -胰岛素作为临床上人用的胰岛素类似物制剂。最近，对Lantus 也提出了类似的担忧，Lantus 亦表现出与IGF - IR的交叉结合增强并在人细胞培养物中的有丝分裂原活性增力口。最近对超过120，000例经Lantus 治疗的欧洲糖尿病患者的回顾性病例研究表明，各种癌症的发病率为剂量依赖性增加，所述癌症包括乳腺癌、前列腺癌、结肠癌和胰腺癌。不仅与IGF- IR交叉结合水平的升高可增加癌症风险的程度，而且Lantus 与IR亲和力的降低亦可增加癌症风险的程度。因此，在目前的临床使用中，相对于野生型胰岛素或其它胰岛素类似物，[GlyA21，ArgB31, ArgB32]-胰岛素的受体结合选择性(IR缔合常数与IGF - IR缔合常数之比)反常地降低。人胰岛素本身可与IGF - IR结合，但其在体外与去垢剂溶解的和凝集素纯化的受体亲和力比其与IR的结合低333倍。进餐时间胰岛素类似物例如Humalog 和Novolog 表现出相似的与IGF - IR的交叉结合水平(已报道赖脯胰岛素与IGF - IR (Humalog 的活性组分)的交叉结合有轻微的增加)。流行病学研究显示了内源性超高胰岛素血症(在代谢综合征中和2型糖尿病早期阶段中对胰岛素抗性的代偿性反应)和癌症(特别是结直肠癌)流行増加的关联性。用高剂量的人胰岛素或胰岛素类似物来治疗胰岛素抗性的患者亦与癌症风险的増加有关，这可反映与IGF - IR交叉结合的基线水平。对于所述患者，关于累积的癌症风险，有可能即使是人胰岛素和进餐时间胰岛素类似物的基线受体特异性仍不足以严格确保长期治疗的安全性。不希望受理论的限制，慎重建议，为治疗糖尿病而设计的胰岛素类似物的受体结合选择性应等于或大于野生型人胰岛素受体结合的选择性。胰岛素类似物对血糖浓度的调节不需要精确水平的人胰岛素与IR结合。在体内可通过延缓从血液中清除类似物来补偿类似物对IR亲和カ的降低。发生所述补偿是因为胰岛素的清除由其与IR的结合介导。但与IR的亲和カ降低三倍的胰岛素类似物在体内仍可表现出与人胰岛素相似的效价。可通过增加类似物的注射量来补偿亲和力的进ー步降低。具有所述降低的亲和カ的胰岛素类似物的实例为甘精胰岛素(Lantus )和地特胰岛素(Levemi/)。胰岛素类似物与IR的亲和カ的变化通常反映解离速率的变化亲和カ降低与激素在受体上的驻留时间缩短有关，而亲和カ的增强与驻留时间的延长有夫。尚不知驻留时间和代谢效カ之间或驻留时间与有丝分裂信号转导之间的总体关系。业已提议，延长 Aspmo -胰岛素在IR复合物上的驻留时间至少部分引起其有丝分裂原活性增强。不希望受理论的限制,过去的经验教导,在体外与IR的相对亲和力为人胰岛素的20%至200%之间的胰岛素类似物可有效治疗哺乳动物糖尿病。因此，在控制血糖浓度中，需要表现出与IGF - IR的交叉结合降低、且作用的持续时间延长同时又保持类似物的至少部分生物学活性的胰岛素类似物。具体而言，在控制血糖浓度中，需要表现出从皮下贮库的吸收延迟，但一旦吸收到血液中，又表现出与IGF-IR的亲和カ降低，同时还保持类似物的至少部分生物学活性的胰岛素类似物。在控制血糖浓度中，还需要表现出等电点朝向中性值增加而与IGF-IR的亲和カ不增加，同时保持类似物的至少部分生物学活性的胰岛素类似物。与人胰岛素相比，由于A -链和/或B -链中氨基酸取代的存在，或因A -链和/或B-链的可能延伸以产生更大分子，因而可以改变胰岛素类似物的生物学、物理学和化学性质。胰岛素类似物的研究表明，含有两个或多个修饰的类似物的性质无法基于含有相应单个修饰的类似物组的性质来可靠地预測。因为分子中一个位点的氨基酸取代或链延伸可导致蛋白质构象、动力学或溶剂化的传递改变，所以分子中另ー个位点的氨基酸取代的影响与不存在第一修饰时的相同取代的影响可不同。ArgA°-胰岛素晶体结构的变形，提供了不曾预料到的传递修饰效应的实例，所述变形与受体结合的降低有夫。因此，包括ArgA°的A -链的N-末端延伸，改变了残基A4、A8和其它位点的结构环境。总体上插入了ー个或多个碱性残基(Arg或Lys)的氨基酸取代或链延伸导致等电点往中性的向上偏移；偏移的程度受结构、溶剂化和伴随修饰的构象变化传递的影响，所以经验教导，単独氨基酸的性质不能良好预测实测的P〗。不希望受理论的限制，经验教导，基于含有单个修饰的类似物的性质，不可预期两个或多个修饰的联合效应。因此有可能的是，新的修饰组合可一起具有这样的性质，其为胰岛素类似物在治疗糖尿病的治疗用途中提供独特优势。发明概述
本发明涉及含有多个组氨酸取代的胰岛素类似物制剂，所述多个组氨酸取代可在锌胰岛素类似物的六聚体表面和六聚体之间组合产生新的锌-结合位点，并借此使得能够形成长效皮下蛋白贮库。更具体地，本发明提供含有在A4和AS的成对组氨酸取代且在A21有或没有取代的胰岛素类似物，并且提供用于皮下给予以实现作用持续时间延长的制剂。不希望限制(condition)关于任何特定理论的专利性,认为这些位点的各侧链在其装配成胰岛素六聚体时从A-链表面伸向溶剂，从而提供部分新的锌-离子-结合位点，这些位点与毗邻六聚体中的互补侧链突出联合，使得在毗邻的胰岛素类似物六聚体之间产生锌-离子-桥联相互作用。如图IE所示，野生型T3Rf3胰岛素六聚体包含上列(T3H聚体；圆角矩形)和下列(Rf3三聚体；尖角矩形)，其中每一列含有中轴锌离子(灰色圆圈)。图IF提供晶格中变体六聚体的堆积示意图，认为所述堆积因本发明制剂中HisA4和HisA8的取代而发生。每一桥连锌离子层(黑色圆圈)由每一个T-态原体(未显示)的HisA4和HisA8及上述Rf-态原体的HisA4侧链(垂直片段)配位。同样不希望限制关于任何特定理论的专利性，这种取代组合亦增强胰岛素类似物的受体结合选择性并降低与IGF - IR的绝对亲和力。本发明的另一方面提供了约pH 4下的长效胰岛素类似物制剂，当其pH偏移为6-7.4时，其形成微结晶混悬液。在一个具体实例中，制剂以至少约4个锌离子/6个胰岛素类似物分子的相对浓度含有锌离子。因此，该制剂能够皮下注射给个体，然后在暴露于生 理PH时形成皮下贮库。该制剂与同一物种的野生型胰岛素相比，可另外表现出对IGF受体的亲和力降低，并保持野生型胰岛素对同物种胰岛素受体的亲和力的至少20%。在胰岛素的天然结构中，残基Al-AS包含a -螺旋。认为该片段促成胰岛素和胰岛素类似物与IR和IGF - IR 二者的结合。不希望限制关于任何特定理论的专利性，认为暴露于溶剂中的残基GIua4和ThrA8 (在IGF - I中不保守)的取代可良好容忍胰岛素类似物与IR的结合，并仍然接近激素-受体界面。本领域已知，当在酸性条件下配制时，通过Gly取代AsnA21可延缓胰岛素类似物的化学降解。因此，希望提供这样的胰岛素类似物，其提供锌-依赖性的长效皮下蛋白贮库，并在降低与I型IGF受体的交叉结合时保留对胰岛素受体的高亲和力。不希望受理论的限制，亦希望提供这样的胰岛素类似物，其中胰岛素类似物六聚体中结合的非轴锌离子的两个正电荷促成其装配-依赖性等电点的进一步偏移。亦希望提供这样的胰岛素类似物，其中在位点A4和AS的成对组氨酸侧链可促成晶格中胰岛素类似物六聚体之间新界面的锌-离子结合位点。再次不希望受理论的限制，所述界面的锌离子可延迟六聚体之间和六聚体之中的高阶接触的解体，以延长胰岛素类似物作用的持续时间。胰岛素或胰岛素类似物的Al-A8 a -螺旋通过其带电位点、中性位点、a -螺旋偶极矩和相互的静电相互作用来促成其等电点(PD。再次不希望受理论的限制，通过去除酸性残基(发生在用His取代GIua4时)将预期pi向上偏移但不超过pH 6. 5。pi的微小变化可能与在位点A4或AS的组氨酸残基的插入有关，这取决于所取代的组氨酸的局部PKa (通常为6和7之间)。再次不希望受理论的限制，在人胰岛素的A4位点观测到了酸性残基。预期用Gly、Ala或其它中性侧链来取代AsnA21，将不会导致pi的显著变化；预期用碱性侧链(Arg或Lys)来取代，将会导致pi的进一步向上偏移；预期用Asp来取代(可发生在在酸性溶液中储存时天然AsnA21侧链的脱酰胺化时)，将会导致pi的下移。结合到胰岛素类似物六聚体表面或结合在锌胰岛素类似物六聚体之间界面位点的非轴锌离子，亦可促成六聚体或多-六聚体复合物的总电荷，并因此影响其在皮下贮库中的PH 7. 4下的溶解性。
因此，亦希望提供这样的胰岛素类似物，其表现出上述受体结合性质，亦表现出等电点向上偏移但不超过中性，以便在非典型锌离子结合在胰岛素类似物六聚体表面或六聚体之间时，氨基酸取代和另外结合的锌离子的联合效应使得复合物在皮下贮库中的PH 7. 4下不可溶。因此，亦希望提供在酸性pH下为透明溶液的胰岛素类似物的可溶制剂，其在用注射器皮下注射时便于操作、便于精确调整剂量，并可通过计量笔(pen)进行精确计量的递送。亦希望提供作为用于中性PH下胰岛素类似物微结晶混悬液的基础的结晶方法，该方法可赋予在首次使用产品后于室温下増加的贮藏期限和稳定性。一般而言，治疗患者的方法包括将生理学上有效量的胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐给予患者，其中所述类似物或其生理学上可接受的盐含有经修饰的胰岛素A-链序列，所述修饰为在位点A4和A8被成对的组氨酸取代，且可能在A21有另外的修饰。在一个实例中，A21侧链是天然的Asn残基。在另ー个实例中，A21侧链是Gly。在另ー个实例中，A21取代可为Ala、Thr或Ser。 胰岛素类似物可为任何脊椎动物胰岛素的类似物，或含有本领域所知的经修饰B -链以改变皮下注射后吸收的胰岛素类似物。在一个实例中，胰岛素类似物是哺乳动物胰岛素类似物，例如人、鼠、啮齿动物、牛、马或犬的胰岛素类似物。在另外的实例中，胰岛素类似物为羊、鲸、大鼠、象、豚鼠或毛丝鼠胰岛素的类似物。具体胰岛素类似物包括含有如SEQ. ID. NO. 4 - 6或14中任ー个所提供的A-链序列和如SEQ. ID. NO. 7-12中的任ー个的B-链序列的胰岛素类似物。核酸可编码具有这些序列之一的多肽。所述核酸可以是可用于转化宿主细胞的表达载体的一部分。附图中数个视图的简述
图IA是人胰岛素原序列的示意图，包括A-链和B-链及显示有侧翼ニ碱基切割位点的连接区域(实心圆圈)和C -肽(空心圆圈)。图IB提供胰岛素原的结构模型，由胰岛素-样部分和无序的连接肽(虚线)组成。图IC提供了所提出的经由单体的部分解折叠而使胰岛素的原纤维形成的途径示图。天然态受典型的自我装配的保护(最左边)。解体导致天然単体和部分折叠单体(分别为空心三角形和梯形)之间的平衡。该部分折叠可因途径中断事件(off-pathway event)而完全解折叠(空心圆圈)，或聚集形成核并转变为(en route to)原丝(最右边)。图ID为人胰岛素序列的示意图，其标示了 A -链中残基AS的位置和本领域所知的赋予皮下注射后快速吸收的B-链中的取代位点。图IE是野生型T3Rf3胰岛素六聚体的示意图，其包含上列(T3三聚体；圆角矩形)和下列(Rf3三聚体；尖角矩形)，其中每一列含有轴锌离子(灰色圆圈)。图IF是晶格中变体六聚体堆叠的示意图，其中三个桥连锌离子层(黒色圆圈)的每ー个均由每ー个T-态原体(圆角矩形)的HisA4和HisA8以及来自Rf-态原体(尖角矩形)的HisA4侧链(垂直片段)配位。图2a提供野生型胰岛素序列和(上面组)甘精胰岛素(Lantus' Sanofi -Aventis)的修饰位点及(下面组)本发明类似物。以黑色和灰色表示野生型A -链和B-链序列；以黑线标示ニ硫键(A6 - All、A7 - B7和A20 - B19)。甘精胰岛素含有B -链的两个残基延伸(ArgB31和ArgB32)和AsnA21 — Gly取代(上面组红色)。内源的皮下蛋白酶可从甘精胰岛素延伸B-链中缓慢去除一个或两个Arg残基，这部分缓和了其增强的有丝分裂原活性。本发明类似物含有成对的(i，i+4)取代GIua4 — His和Th, — His (下面组)。长效类似物地特胰岛素(Levemir ,Novo - Nordisk)通过附着于白蛋白_结合元件而起作用(未显示)。图2b提供胰岛素单体的带状模型，其描绘通过在Al-ASa -螺旋的外表面形成的推定的锌-离子结合位点部分。A-链和B-链条带分别用黑色和灰色表示。图2c描绘野生型T3Rf3胰岛素六聚体的结构。六聚体中两个轴锌离子在中心对齐，通过三聚体-相关HisB1°侧链(浅灰色)来配位。A-链以黑色表示，B-链以灰色表示(Rf-特异性的BI-B8 a -螺旋)。从蛋白数据库(登录号1TRZ)获得野生型的结构。 图2d描绘变体[HisA4，HisA8]T3Rf3胰岛素六聚体的结构。六聚体中两个轴锌离子在中心对齐，通过三聚体-相关HisB1°侧链(浅灰色)来配位。变体六聚体在T3三聚体表面(表面球体)含有三个非-典型的锌离子。灰色显示的为来自毗邻六聚体HisA4、HisA8和第三HisA4’的侧链。每种情况下都以黑色表示A -链，以灰色表示B -链(Rf -特异性的BI -B8 a -螺旋)。图2e阐明2F。- F。电子密度图(在I s处用轮廓表示的立体配对(stereo pair)),其显示T-态原体中由HisA4和HisA8形成的新的锌-离子结合位点。由残基A4’(属于毗邻六聚体中的Rf-态原体)完成变形的四面体配位。图3A描绘野生型六聚体-六聚体的组装。(左)在每一六聚体中上面的三聚体具有丁3构象，下面的三聚体为Rf3。显示了邻近残基A4和AS的界面水分子(较小的球体)和轴锌离子(较大的球体)。以灰色表示A -链，以黑色表示B -链。T -和R原体在BI - B9的二级结构上不同，其为延伸的(T)或螺旋的(R);残基BI和B2在“破损”Rf态中是无序的。(右)左边加框区域的放大。靠近底部的较大球体为底部六聚体中T3H聚体的轴锌离子。箭头标示了上面的Rf3三聚体中的Rf-态残基GluA4’。图3B描绘锌-介导的[HisA4，HisA8]-胰岛素的六聚体_六聚体组装上面的三聚体具有T3构象，下面的三聚体为Rf3。显示了轴锌离子和A4-A8-A4’配位的锌离子。以灰色表示A-链，以黑色表示B-链。(右)加框区域的放大。在六聚体-六聚体界面处观测到三个新的锌离子。箭头标示了 Rf-态侧链HisA4’(来自顶部六聚体的底部三聚体)，其使界面的锌-结合位点完善。图3C提供显示[HisA4，HisA8]-胰岛素六聚体的T和Rf面的CPK模型{左和右)。视图相对于组图3b旋转了 90°。显示了三个非-典型锌离子与HisA4和HisA8的侧链结合。白色十字叉标示氯离子的位置；其它的图解同图3B。图3D提供立体配对，其显示与Rf原体的HisA4’和T原体的HisA4 - HisA8有关的非-典型锌离子(深灰色的大球体)、氯离子(重叠的浅灰色球体)和三个结合的水分子(较小球体)。结合的水分子参与Rf中的氢键网络，其涉及GluB4’的侧链羧基(carboxylate)、TyrB26的对位_ OH和ProB28的羰基氧(标记的)。图3E描绘探测胰岛素或胰岛素类似物与IR的高亲和力结合(左边三条曲线；实线)以及与IGF-IR的低亲和力交叉结合(右边三条曲线；虚线)的竞争性取代测定结果。显示了每一组中的结果野生型胰岛素U)、甘精胰岛素_i和HisA4，HisA8_胰岛素IT)。HisA4，HisA8_胰岛素的受体结合选择性的提高是因为其IR -结合滴定向左偏移及其IGF - IR -结合滴定向右偏移。表2和3提供了相对亲和力和解离常数。在无锌离子存在下进行測定。图3F提供体内測定的結果。用野生型胰岛素(X)、甘精胰岛素《 、HisA4，HisA8-胰岛素げ丨或缓冲液对照(Lilly稀释液； )皮下注射链脲佐菌素(str印tozotocin)-诱导的糖尿病雄性大鼠。在0时的剂量为3.44纳摩尔野生型胰岛素(loo - m注射体积中20 mg)、12纳摩尔甘精胰岛素(相当于2.0 U Lantus )、13. 7纳摩尔[Hi sA4, Hi sA8]-胰岛素和100 - W无蛋白缓冲液(Lilly稀释液)。在指定的时间测量来自尾巴尖端的血糖浓度。在5只大鼠中测试每一类似物(平均值土 SEM);实验重复2次，具有相似結果。注射后6 -8小时大鼠进食。图4提供链脲佐菌素-诱导的糖尿病雄性大鼠在注射以下物质后血糖水平(mg/dL)随时间变化的图示作为对照的胰岛素稀释液(圆形)、甘精胰岛素(Lantus ，方形)、 赖脯胰岛素(Humalog ，“X”)，或含有位点A4和A8的His取代和Humalog的Iispro取代的胰岛素类似物(A4A8 - lispro+Zn，倒三角形)，其它与上图3f所提供的一祥。图5是使用组氨酸取代以允许锌-介导的蛋白质缔合以产生目的蛋白质的长效贮库的示意图。发明详述
本发明涉及创新利用胰岛素六聚体之间的非轴界面锌离子，以延长胰岛素类似物制剂作用的持续时间。本发明提供用于产生延长的皮下贮库的新系统。其利用新的非轴锌离子在胰岛素类似物六聚体表面和胰岛素类似物六聚体之间结合，并延长这些类似物贮库释放单体胰岛素类似物到血流中所需的时间。本发明亦提供与I型IGF受体的绝对和相对结合同时降低的胰岛素类似物。该性质的联合将提高糖尿病治疗的功效和安全性，尤其是在癌症的风险方面。为此目的，本发明提供在位点A4和AS含有成对组氨酸氨基酸取代的胰岛素类似物及含锌的制剂，其为PH 4下的透明溶液，或为约中性pH下的微结晶混悬液。成对的A4 - A8取代可与位点A21的取代(例如Gly、Ala、Ser或Thr)联合。本发明胰岛素类似物亦可含有其它修饰。如本说明书和权利要求书中所用，可按照惯例来注释胰岛素类似物的各种取代，所述惯例标示被取代的氨基酸，接着是氨基酸的位置，任选以上标的形式。目的氨基酸位置包括取代所处的胰岛素A-链或B-链。例如，本发明胰岛素类似物亦可含有天冬氨酸(Asp或D)或赖氨酸(Lys或K)对B-链的氨基酸28 (B28)即脯氨酸(Pro或P)的取代，或Pro对B -链的氨基酸29 (B29)即Lys的取代或其组合。这些取代亦可分别记为AspB28、LysB28和ProB29。相似地，本发明胰岛素可在A -链的氨基酸AO (即N -末端到GlyA1)含有精氨酸(Arg或R)、组氨酸(His或H)或赖氨酸(Lys或K)添加。这些添加可分别记为ArgA°、HisA°或LysA°。而且，本取代可与取代Phem — His的引入联合。除非另外或上下文任何地方明显指出，否则应认为本文所指的氨基酸为L-氨基酸。本文所用“金属—钉(metal-staple) ”或“金属-拉链(metal-zipper) ”是当来自两个或多个分子或分子复合物中的两条或多条氨基酸侧链与目的金属缔合时形成的金属-结合位点。例如，来自第一分子的一条侧链可与来自第二分子的两条侧链联合以形成锌-结合位点。因此，本领域熟知，胰岛素三聚体为由轴锌离子连在一起而具有“锌-钉”。然而，先前并不知道可引入锌-键合点来引起某些胰岛素类似物六聚体形成六聚体之间的锌-钉。本发明提供胰岛素类似物，该胰岛素类似物形成新型具“锌-钉”胰岛素六聚体-复合物，表现出对IGF - IR的亲和力降低但保持其对IR的至少部分亲和力并因此保持生物学活性。本发明亦提供具有高相对浓度的锌的这些类似物的制剂，其形成具“锌-钉”六聚体复合物，甚至在更高浓度的锌时，形成这些六聚体-复合物的缓慢-样晶体。在一些实施方案中，胰岛素类似物含有至少4、至少5、至少6、至少7或至少8个锌离子/胰岛素类似物六聚体。用于治疗患者的方法包括将胰岛素 类似物给予患者。在一个实例中，胰岛素类似物为含有A-链修饰的胰岛素类似物，其伴随性导致等电点(pi)向中性上移，容许具锌-钉胰岛素六聚体的装配。在另一实例中，所述修饰亦降低无锌单体对IGF - IR的亲和力。在另一实例中，胰岛素类似物亦在位点A21含有取代，其保护在酸性条件下制成的胰岛素类似物免受化学降解。用注射器、计量笔或其它适宜装置通过皮下注射来给予所述胰岛素类似物。亦设想有可能的是,将在位点A4和A8引入的成对组氨酸取代应用到用足够浓度锌离子在酸性条件下制成的类似物中，这可能通过两种共存机制使得类似物在PH 7. 4时不可溶向较高等电点(约6. 5 - 6. 6)的偏移，其主要是由于GIua4中负电荷的去除；和锌胰岛素六聚体的净等电点的进一步偏移，其由除典型轴锌离子外的非轴锌离子的结合所致。为了降低皮下贮库中胰岛素类似物的溶解度而引入的在A4和AS的相同取代，亦可降低可能的癌症风险，已提出所述可能的癌症风险与胰岛素和胰岛素类似物与I型IGF受体的交叉结合相关。还设想有可能的是，将在位点A4和AS引入的联合取代，以及具有或不具有在A21的取代，应用到其它种类的胰岛素类似物制剂中(例如但不限于普通、NPH、半慢性和慢性胰岛素，包括这些类型的混合物)，以实现降低所述类似物与I型IGF受体的交叉结合目的中的一种或多种。为了在PH 7. 4下形成普通可溶制剂，成对的组氨酸取代必须与A-链或B-链中其它位置的取代联合，所述其它位置的取代去除一个或多个正电荷或添加一个或多个负电荷，从而充分降低Pl以使在本领域所知的赋形剂存在时，在PH 7. 4下的溶解性与人胰岛素相似，所述赋形剂包括但不限于氯化锌、苯酚、间甲酚、甘油、磷酸钠缓冲液和注射用水。当与A4和AS的成对组氨酸取代联合时将降低pi的取代的实例包括但不限于G1uA14、AspA21、G1uA21、AspB9、G1uB9、AspB1°、Glumo, AlaB22、SerB22、AspB28、AspB28 - ProB29、AspB28 - AlaB29、AlaB29 和 ProB29,或其组合。业已发现在位点A4和AS的成对的组氨酸取代可降低胰岛素类似物与I型IGF受体的交叉结合，并在保持对胰岛素受体的天然亲和力的同时引起Pl向中性向上偏移。亦发现在pH 7. 4的无锌条件下制得的[HisA4，HisA8]-胰岛素高度可溶，而每6个胰岛素类似物分子中加入4-6个锌离子导致锌-蛋白质复合物的沉淀。这种复合物在pH 7. 0 - 8. 4时不可溶或微溶,但在约pH 4时可溶。不希望受理论的限制,很可能这种pH-依赖性的不溶性是由于含有轴和非-轴结合的锌离子二者的锌蛋白质复合物的体外等电沉淀所致。亦发现在pH 4. 0的非缓冲溶液中制成的、含有摩尔比为5. 2个锌离子/6个胰岛素类似物分子的[HisA4，HisA8]-胰岛素，在经皮下注射雄性Lewis大鼠(用链脲佐菌素使其患糖尿病)后，将以类似于Lantus 的药理作用的持续时间和范围，引导血糖浓度的延长控制。不希望受理论的限制，可能这种延长作用是由于含有轴和非-轴结合的锌离子二者的锌蛋白质复合物的皮下等电沉淀所致。亦发现[HisA4，HisA8]-胰岛素晶体可易于生长成为锌胰岛素类似物六聚体，其含有两个轴锌离子/六聚体和三个非-轴锌离子(结合在R3晶格中的连续六聚体之间)；后者的界面锌离子表现出由一个六聚体中的HisA4和HisA8、毗邻六聚体的HisA4’和结合的氯离子的四面体配位。三个结合的锌-和氯离子分别给六聚体添加+6和_3的形式电荷(formal charge),净形式电荷为+3。这些另外的电荷通过用His取代GIua4而扩大+6的形式电荷。不希望受理论的限制，很可能三个非-轴锌离子/六聚体的存在导致上述PH-依赖性的不溶性和推测的锌蛋白质复合物的皮下等电沉淀。一般而言，脊椎动物胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐，包含含有胰岛素A -链和胰岛素B-链的胰岛素类似物。本发明的胰岛素类似物亦可含有其它修饰，例如B- 链残基BI和/或B31的碱性氨基酸延伸的取代。在一个实例中，脊椎动物胰岛素类似物是哺乳动物胰岛素类似物，例如人、猪、牛、猫、犬或马的胰岛素类似物。本发明的胰岛素类似物亦可含有其它修饰，例如B-链的C-末端和A-链的N-末端之间的系链(tether)，其在共同未决的美国专利申请号12/419，169中更详细阐述，所述专利的公开内容通过引用并入本文。药物组合物可包含所述胰岛素类似物，为了获得延长的作用持续时间，必须包括锌离子或另ー种能引导蛋白质装配和六聚体界面缝合(stapling)的ニ价金属离子。锌离子可以以摩尔比为4. 0-7. 0或5. 0-6. 0个锌离子/胰岛素类似物六聚体的水平包括在所述组合物之中。亦可包括以更高摩尔比的锌离子以产生甚至更慢吸收的六聚体-复合物，在所述高摩尔比下，除界面[HisA4，HisA8]-相关的锌-钉结合位点外，锌离子还将占据弱的锌-结合位点。在所述制剂中，胰岛素类似物的浓度通常为约0.1-约0.3 mM。赋形剂可包括甘油、甘氨酸、其它缓冲剂和盐及抗微生物防腐剂例如苯酚和间甲酚；已知后者防腐剂可增强胰岛素六聚体的稳定性。可使用所述药物组合物以通过将生理学上有效量的组合物给予患者来治疗患有糖尿病或其它医学病况的患者。包含编码多肽的序列的核酸编码胰岛素类似物，所述核酸含有编码在A4和AS具有组氨酸联合取代、在A21具有或不具有另外取代的A-链的序列。具体的序列可取决于将要引入所述核酸序列的物种中偏好的密码子选择。核酸亦可编码野生型胰岛素的其它修饰。核酸序列可编码在多肽或修饰的胰岛素原类似物的其它位点含有不相关取代或延伸的经修饰A-链或B-链序列。核酸序列亦可为表达载体的一部分，可将该载体插入到宿主细胞中，例如原核宿主细胞，例如大肠杆菌佐coli)细胞系，或真核细胞系，例如酿酒酵母{S. cereviciae)或巴斯德毕赤酵母(Pischia pastoris)菌株或细胞系。还设想的是，不相关的取代或链延伸可与本发明的类似物联合，以改变其等电点，所述等电点通过位点B13的取代或通过位点AO、A22、BO或B31的Arg或Lys的链延伸而进ー步上升，或通过插入负电荷或去除正电荷的取代而下降。例如，取代可与AlaB31 -HisB32 - HisB33 - ArgB34、HisB31 - HisB32、HisB31 - HisB32 - ArgB33 或 AlaB31 -HisB32-HisB33联合。在这些较后的情况中，另外的六聚体内的锌结合补充本发明六聚体之间的锌结合，以提高锌与六聚体的比率并进一步稳定六聚体-复合物。本发明的取代亦可与增加IGF - IR交叉结合的B -链修饰联合以减轻这种不利性质，实例包括用一个或两个碱性残基(例如ArgB31、LysB31、ArgB31 - ArgB32> ArgB31 - LysB32、LysB31 - ArgB32和LysB31 - LysB32)延伸B -链，或用Asp或Glu取代Hism0o提供的实例(但不限于)为甘精胰岛素(Lantus )，其在pH 4下制成，但在生理pH下在皮下贮库中遭受聚集。还设想的是，本发明成对的组氨酸取代亦可与现有的胰岛素类似物或修饰的胰岛素中存在的任何变化，或与各种药物制剂例如普通胰岛素、NPH胰岛素、慢性胰岛素或超慢胰岛素联合利用。本发明的胰岛素类似物亦可含有存在于人胰岛素类似物中的取代，其尽管在临床上未使用，但在实验上有用，例如含有取代AspB1°、LysB28和ProB2 9或AspB9取代的DKP-胰岛素。然而，本发明不限于人胰岛素及其类似物。亦设想这些取代亦可在动物胰岛素例如(作为非限制性实例)猪、牛、马和犬胰岛素中进行。此外，考虑到人和动物胰岛素之间的相似性，和过去将动物胰岛素用于人糖尿病患者，亦设想可在胰岛素序列中引入其它较小修饰，尤其是那些被认为是“保守”取代的取代。例如，可在具有相似侧链的氨基酸组内进行另外的氨基酸取代而不偏离本发明。这些包括中性疏水氨基酸丙氨酸(Ala或A)、缬氨酸(Val或V)、亮氨酸(Leu或L)、异亮氨酸(lie或I)、脯氨酸(Pro或P)、色氨酸(Trp或W)、苯丙氨酸(Phe或F)和甲硫氨酸(Met或M)。同样地，中性极性氨基酸可在组内相互替代甘氨酸(Gly或G)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、酪氨酸(Tyr或Y)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Glu或Q)和天冬酰胺(Asn或N)。认为碱性氨基酸包括赖氨酸(Lys或K)、精氨酸(Arg或R)和组氨酸(His或H)。酸性氨基酸为天冬氨酸(Asp或D)和谷氨酸(Glu或E)。为比较目的提供了人胰岛素原的氨基酸序列，其为SEQ. ID. NO. I。提供了人胰岛素A-链的氨基酸序列，其为SEQ. ID. NO. 2。为比较目的提供了人胰岛素B -链的氨基酸序列，其为SEQ. ID. NO. 3。SEQ. ID. NO. I (胰岛素原)
Phe-Val - Asii<lIn4ii^Lee^y^-Cif y-Ser-His-Leii-Val-Cllu-Ala-i-eu-Tyr-Ley-Val-Cy^"
Cl I y -Cl I u- A rg-G Iy-Ph e- Ph e -T y r-Th r- Pro ~ I -Th r- A rg- A rg -Cl Iu-Ai a- 0 Iu-A sp-1 .e u-Ciln- Val<Hy4lln-Vai^iki-Le Ii 4jly<iIy4jly"Pro<ily Ala4lly'-Ser-Leu-Ciln-Pro-LeLi-Ab- Ltni-Glu-Gly-Ser-Leu-GI!vLy:s-Arg-Gly-l!e-Vd-Glu-Glii-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile^
Le u -Tyr-G I n-Leu-G Iu-A^ rt-Tyr-C ys- Asn
SEQ. ID. NO. 2 (A -链)
Gly-lle-Val<ilii-GtriCys<%yH Thr-Stn-lle-Cy^Ser-lxii T>ir*Cln-Leu-Gli,i"A^n-T>T-Cys^
Asn
SEQ. ID. NO. 3 -链)
Phe-Val'%Asii-Gln-Hi s-l.A4iJ Cys-GIy*Scr*4---Ib-L4sii* Val-Gf o* Ala-Leu-Tyr*Le ii* VaIwCy^*
GI y-G In-A ra G I y-Ph e-Phe-T yr Thr Pro- Lys -Th r
设想本发明的胰岛素类似物具有与天然胰岛素相似的对胰岛素受体的亲和力，但表现出与I型IGF受体的亲和力降低。胰岛素或胰岛素类似物的活性可通过下文中更为详尽描述的受体结合测定来测定。相对活性可以以激素-受体解离常数(Kd)来定义，其通过竞争性取代测定的曲线拟合来获得；或以ED5。值来定义，即取代50%的特异性结合的经标记人胰岛素例如放射性标记的人胰岛素(例如1251 -标记的胰岛素)或放射性标记的高亲和カ胰岛素类似物所需的未标记胰岛素或胰岛素类似物的浓度。或者，活性可简单地表示为正常胰岛素的百分比。对胰岛素-样生长因子受体的亲和カ亦可用与所測量IGF-IR的取代的同样方式来測定。具体而言，期望胰岛素类似物具有的活性为胰岛素活性的20 - 200%,例如正常胰岛素的25、50、110、120、130、140、150或200%或更多，同时具有对IGF- IR的亲和カ小于或等于正常胰岛素的50%，例如正常胰岛素的10、20、30或50%或更少。即使体外受体-结合活性因较慢清除而低至20%，胰岛素类似物在糖尿病的治疗中仍有用。胰岛素类似物的合成。在0.1M甘氨酸缓冲液(pH 10.6,10 ml)中，在ニ硫苏糖醇(7 mg)存在下,通过A链(41 mg)和B -链类似物(21 mg)的S -磺化衍生物的相互作用来实现链联合。每ー种联合混合物的CM - 52纤维素色谱法可部分分离被游离B -链污染的氢氯化物形式的蛋白质。最终纯化由反相HPLC来完成。MALDI质谱证实了所预测[HisM, HisA8]-胰岛素的分子量。最终产量(6. I mg)与对照野生型胰岛素的合成所获得的最终产量相似。[HisA4，HisA8] -DKP-胰岛素的相应产量为8. 8 mg。等电点聚焦电泳。用预制的pH 3 - 10的IEF凝胶(125 x 125 mm, 300 ym，来自 SERVA Electrophoresis GmbH,Heidelberg的SERVALYT Precotes ,从Crescent ChemicalCo. Hauppauge, NY获得)通过IEF凝胶电泳，来测量天然状态胰岛素和胰岛素类似物的pi值。根据厂商实验方案，将Precotes 放置在水平IEF装置Multiphor II (PharmaciaBiotech)中。用循环式水浴锅(Brinkman)将该元件预冷至4°C，然后将PREC0TE IEF凝胶放到用轻质矿物油包被以实现有效热交换的电泳床上。在凝胶的两端用经PH 3的阳极液和pH 10的阴极液(都来自SERVA)浸湿的滤纸条将凝胶与电极连接。点样之前，用高压电源(LKB型号2197)以初始电压设置200伏和最终设置500伏将凝胶预聚焦30分钟。点完样品和IEF标准品(5-10 u L，装载蛋白质浓度5-10 Ug)后，在500 - 2000伏下实施等电聚焦达2小时或直至达到最终电压2000伏，此后再继续聚焦15分钟。IEF之后，根据SERVA手册的实验方案，将凝胶用200 ml 20%的三氯こ酸固定20分钟，用200 ml去离子水漂洗I分钟，用Serva Violet 17溶液染色，用86%的磷酸脱色。使用的IEF标准蛋白质(来自SERVA)如下，括号中为其各自的pi值马心细胞色素C (10. 7)、牛胰核糖核酸酶A(9. 5)、小扁豆外源凝集素(8. 3,8. 0,7. 8)、马肌肉肌红蛋白(7. 4,6. 9)、牛红细胞碳酸酐酶(6.0)、牛奶P -乳球蛋白(5. 3、5. 2)、大豆胰蛋白酶抑制剂(4. 5)、黑曲霉(Aspergillusniger)葡萄糖氧化酶(4. 2)、黑曲霉淀粉葡糖苷酶(3. 5)。通过比较迁移距离对IEF标准品的PH梯度的线性回归曲线，来測定蛋白质样品的pi。受体表达质粒。为表达带标签表位的IR和IGF - IR，从InVitrogen获得哺乳动物表达载体pcDNA3. IZeo+,通过将编码符合读框的三重FLAG M2表位(Asp - Tyr - Lys -Asp - Asp - Asp - Asp - Lys)的符合读框的寡核苷酸盒亚克隆到及丽奴廣XbaI的限制性位点之间，来修饰其C -末端表位标签。编码IGF - IR和IR的B -同エ型的各自cDNA如先前所述(Whittaker, J.等.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 第 84 卷，第 5237 - 5241 页(1987))。通过用定点突变在其3’端恰在终止密码子之前引入编码符合读框的C-末端Gly - Ser接头的ガ位点,对它们进行修饰以便亚克隆至修饰的表达载体中。受体cDNA的表达。如前所述来制备转染用DNA。用聚こ烯亚胺在PEAK快速细胞中瞬时表达受体cDNA。转染后三天，当受体表达量达最大时收集细胞。在由含有1% (v/v) Triton X - 100 和蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的 0. 15 M NaCl 和 0. IM Tris - Cl (pH8.0)组成的缓冲液中完成裂解。将裂解液在_80°C保存直至测定需要。受体结合测定。通过改良Whittaker及其同事先前阐述的微滴定板抗体捕获测定，来实施IGF - IR和IR - B各自的结合测定。将微量滴定条板(Nunc Maxisorb)与抗-FLAG IgG (100 Ul/孔的40 U g/ml磷酸盐缓冲盐水溶液)在4°C下孵育过夜。如前所述进行洗涤和封闭。通过小麦胚凝集素(WGA)色谱法来部分纯化293 PEAK细胞的去垢剂裂解液，以去除受体前体裂解物，所述细胞用编码带C -末端FLAG -标签的全长IR - B或IGF - IR的cDNA瞬时转染。然后将小麦胚洗出液在抗体包被的板上于室温下孵育I个小时，以固定受体。充分洗涤去除未结合的蛋白质后，使用标记的胰岛素示踪剂(125I - [TyrA14]-胰岛素)或标记的IGF - I示踪剂(125I - Tyr31 - IGF - I)和未标记的胰岛素类似物的竞争结合测定如所述来实施。在同一组测定中，使用胰岛素或IGF - I受体作为对照配体来测定所有的胰岛素类似物。用两-位点顺序模型通过非线性回归分析来分析同源竞争测定的结合数据，以获得胰岛素和IGF - I的解离常数。用Wang的方法来分析异源竞争实验的结合数据，该方法使用精确的数学表达式来描述两种不同配体与受体的竞争结合。 将本领域所知的胰岛素类似物的代表性结合研究概述于表I。因为胰岛素对IR(同工型B)的亲和力类似于IGF - I对IGF - IR的亲和力(每种情况下Kd约0. 04 nM)，第4列所给出的对IR和IGF-IR各自亲和力的百分比(第2和第3列)比率，提供了对胰岛素类似物的绝对特异性的估计。相对于人胰岛素的特异性的标准化(第I行)提供相对特异性的估计。相对特异性大于I (小于I)表明受体结合严格性的增加(减小)。在该测定中，Aspmo -胰岛素表现出对IGF- IR的亲和力增加，但因为对IR的亲和力的增加更加显著，所以相对特异性大于I。含有取代AsnA21 — Gly和B -链的两个残基延伸(ArgB31和ArgB32)的甘精胰岛素(Lantus )，表现出对IGF - IR的绝对亲和力增加，对IR的绝对亲和力降低，而受体结合的相对严格性降低。本发明的胰岛素类似物表现出相反的性质对IGF - IR的绝对亲和力降低，受体结合的相对严格性增加。表I
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a源自平均值标准误差的误差。b将野生型胰岛素对IR的相对亲和力(第2列)定义为100% ;IGF - I对IGF - IR的相对亲和力(第3列)亦定义为100%。各自的绝对解离常数类似。可通过变体A -链的总化学合成来制备含有A -链氨基酸取代的新型联合的胰岛素A-链类似物。野生型B-链由市售人胰岛素制剂经氧化亚硫酸分解(sulfitolysis)而得；DKP B-链同样由总化学合成来制备。每种情况下胰岛素类似物都是经胰岛素链联合之后再色谱纯化而获得。在每种情况下，通过质谱来证实预测的分子量。合成这样的胰岛素类似物，其在位点A4和AS含有成对的组氨酸取代、具有或不具有用Gly取代AsnA21，其在野生型人B-链(SEQ. ID. NO. 3)情况下，大体如SEQ. ID. NO.4所示。这些类似物与人胰岛素的性质比较表明，A1、A8取代的总效应为类似物对IGF - IR的亲和カ降低，并且对IR的亲和カ与对IGF - IR的亲和カ之比増加(表2)。SEQ. ID. NO. 4 (A4和A8的成对组氨酸取代)
权利要求
1.一种治疗患者的方法，所述方法包括将含有生理学上有效量的胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐的药物制剂给予所述患者，其中所述胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐含有胰岛素A -链序列，所述序列含有在A4和AS的成对的组氨酸取代，任选在A21的选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸的取代，并且所述药物制剂另外含有相对浓度为至少约4个锌离子/6个胰岛素类似物分子的锌离子。
2.权利要求I的方法，其中所述胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐在pH6. 5 -7. 5时为微晶胰岛素混悬液。
3.权利要求I的方法，其中将所述胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐在pH3.5-5时配制为透明非缓冲溶液，所述透明非缓冲溶液含有相对浓度为4 - 6个锌离子/6个胰岛素类似物分子的锌离子、选自苯酚和间甲酚的防腐剂及赋形剂。
4.权利要求I的方法，其中将所述胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐配制为微晶胰岛素混悬液，其经修饰以包括4 - 6个锌离子/6个胰岛素类似物分子。
5.权利要求I- 4中任一项的方法，其中所述胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐通过用甘氨酸取代位点A21来修饰。
6.权利要求I- 4中任一项的方法，其中所述胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐通过用丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸取代位点A21来修饰。
7.权利要求6的方法，其中所述胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐亦通过延伸B -链以包括一个或两个C-末端碱性残基来修饰。
8.权利要求6的方法，其中所述胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐亦通过延伸B-链以包括至少一个N -末端碱性残基来修饰。
9.权利要求6的方法，其中所述胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐亦通过延伸A-链以包括至少一个N -末端碱性残基来修饰。
10.一种编码胰岛素A-链多肽的核酸，其中所述A-链多肽包含SEQ. ID. NO. 4。
11.一种表达载体,其包含权利要求10的核酸序列。
12.—种宿主细胞，其用权利要求11的表达载体转化。
13.一种药物制剂，其在含有至少约4个锌离子/6个胰岛素类似物分子的药学上可接受的缓冲液中包含胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐，其中所述胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐含有胰岛素A -链序列，所述序列含有在A4和AS的成对的组氨酸取代，和任选在A21的选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸的取代，其中所述制剂形成锌-依赖性的长效皮下贮库。
14.权利要求13的药物制剂，其中将所述胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐在pH 6. 5 - 7. 5时配制为微晶胰岛素混悬液。
15.权利要求13的药物制剂，其在pH3. 5-5时配制为透明非缓冲溶液，并进一步含有选自苯酚和间甲酚的防腐剂及赋形剂。
16.权利要求13的药物制剂，其中将所述胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐配制为经修饰包括4 - 6个锌离子/6个胰岛素类似物分子的微晶胰岛素混悬液。
17.权利要求14的药物制剂，其中所述胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐亦通过用Gly取代位点A21来修饰。
18.权利要求15的药物制剂，其中所述胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐亦通过用Gly取代位点A21来修饰。
19.权利要求16的药物制剂，其中所述胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐亦通过用Gly取代位点A21来修饰。
20.权利要求14、15或16中任一项的药物制剂，其中所述胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐通过用Ala、Ser或Thr取代位点A21来修饰。
21.权利要求13、17或20中任一项的药物制剂，其中所述胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐亦通过延伸B -链以包括一个或两个C-末端碱性残基来修饰。
22.权利要求13、17或20中任一项的药物制剂，其中所述胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐亦通过延伸B -链以包括一个或两个N -末端碱性残基来修饰。
23.权利要求13、17或20中任一项的药物制剂，其中所述胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐亦通过延伸A -链以包括一个或两个N -末端碱性残基来修饰。
24.一种胰岛素类似物的晶体制剂，其在含有至少约4个锌离子/6个胰岛素类似物分子的药学上可接受的缓冲液中，其中所述胰岛素类似物含有胰岛素A-链序列，所述序列含有在A4和A8的成对的组氨酸取代，和任选在A21的取代，其中所述制剂形成锌-依赖性的长效皮下贮库，其中所述胰岛素类似物在约pH 6 - 7. 4时形成结晶混悬液。
25.权利要求I的方法，其中所述胰岛素类似物在皮下注射时形成锌-依赖性的长效皮下贮库。
26.权利要求13、17或20中任一项的药物制剂，其中所述制剂在皮下注射时形成锌-依赖性的长效皮下贮库。
27.权利要求13、17或20中任一项的药物制剂，其中在无锌制剂中所述胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐与相同物种的野生型胰岛素相比，表现出对I型胰岛素-样生长因子受体的亲和力降低，并对相同物种胰岛素受体的亲和力表现出野生型胰岛素的至少20%。
28.一种药物制剂，其在含有至少约4个锌离子/6个胰岛素类似物分子的药学上可接受的缓冲液中包含胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐，其中所述胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐含有胰岛素A-链序列，所述序列含有在A4和AS的成对的组氨酸取代、在B28的赖氨酸或天冬氨酸取代、任选在B29的脯氨酸取代和任选在A21的选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸的取代，其中所述制剂形成锌-依赖性的中效皮下贮库。
29.一种药物制剂，其在含有至少约4个锌离子/6个胰岛素类似物分子的药学上可接受的缓冲液中包含胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐，其中所述胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐含有胰岛素A-链序列，所述序列含有在A4和AS的成对的组氨酸取代、在B28的除半胱氨酸、赖氨酸或天冬氨酸之外的氨基酸取代、任选在B29的脯氨酸取代和任选在A21的选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸的取代，其中所述制剂形成锌-依赖性的中效皮下贮库。
30.一种药物制剂，其在含有至少约4个锌离子/6个胰岛素类似物分子的药学上可接受的缓冲液中包含两种或多种胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐，其中至少一种胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐含有胰岛素A-链序列，所述序列含有在A4和AS的成对的组氨酸取代，其中所述制剂提供混合的锌-依赖性的长效、中效和/或短效皮下贮库。
全文摘要
一种包含胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐的药物制剂，其中所述胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐含有胰岛素A–链序列，该序列含有在A4和A8的成对的组氨酸取代，并任选在A21的取代。所述制剂还含有药学上可接受的缓冲液，所述缓冲液中含有至少约4个锌离子/6个胰岛素类似物分子。所述制剂在皮下注射时形成锌–依赖性的长效皮下贮库。在无锌制剂中，与其它不含HisA4和HisA8取代的相同胰岛素或胰岛素类似物相比，所述胰岛素类似物单体表现出对胰岛素–样生长因子受体的亲和力降低，并表现出对相同物种胰岛素受体至少20%的亲和力。
文档编号A61K38/28GK102770153SQ201180010561
公开日2012年11月7日 申请日期2011年2月22日 优先权日2010年2月22日
发明者M.维斯 申请人:卡斯西部储备大学