专利名称：杯状病毒病毒样颗粒上靶定异源抗原的呈递的制作方法
技术领域：
·
本发明涉及病毒学、分子生物学和疫苗开发的领域。具体而言，本发明涉及杯状病毒衣壳蛋白，其可以修饰为将异源抗原表位插入该蛋白质序列中，使得异源抗原表位可以在自经修饰衣壳蛋白生成的病毒样颗粒表面上展示。此类经修饰的衣壳蛋白和病毒样颗粒可用于疫苗配制剂。
背景技术：
许多目前的疫苗采用减毒的微生物来诱导针对病原体的保护性免疫应答。虽然这些类型的疫苗通常产生強烈的免疫应答，但是由于有回复到有毒力的微生物的可能性，存在有感染的潜在风险，并且因此这些疫苗在ー些患者群体中可能是禁忌的。利用重组抗原的其它疫苗避免了感染的风险，但是一般产生比活的减毒疫苗弱的免疫应答。认为用重组抗原的此类弱免疫应答是由于抗原对免疫系统的无效呈递。如此，需要能够更好地模拟如在天然感染期间发生的抗原向免疫系统的呈递的疫苗平台。在最近几年中，已经使用病毒样颗粒(VLP)或假病毒体来呈递抗原以诱导有效的免疫应答。VLP和假病毒体在结构上类似天然存在的、感染性颗粒，但是不含复制必需的病毒遗传信息。对VLP或假病毒体上呈递的抗原的免疫应答通常比对可溶性抗原的应答大得多。虽然VLP似乎是ー种用于将抗原有效呈递给免疫系统的有用平台，但是已经证明了 VLP的有效生成对于有些病毒是难以实现的。此外，病毒衣壳蛋白序列的操作和外来抗原性蛋白或片段向病毒颗粒的掺入经常消除或降低完整VLP的有效生成。如此，本领域中不断需要开发可行的、安全的疫苗平台，其在没有活减毒疫苗的有关风险的情况中将抗原有效呈递给免疫系统。此外，可以容易地掺入感兴趣的任何抗原或来自不同病原性生物体的多种抗原的疫苗平台是期望的。发明概述本发明部分基于如下的发现，即可以将异源抗原性表位插入杯状病毒的衣壳蛋白中，使得衣壳蛋白保留形成VLP的能力。因而，本发明提供了包含杯状病毒衣壳蛋白和至少ー种异源抗原或其片段的嵌合蛋白，其中嵌合蛋白能够在宿主细胞中表达时形成VLP。在一个实施方案中，将至少一种异源抗原或其片段插入杯状病毒衣壳蛋白的P2域中。在另ー个实施方案中，将至少一种异源抗原或其片段插入杯状病毒衣壳蛋白的P2域的ー种或多种暴露于溶剂的环(solvent-exposed loop)中。例如，杯状病毒可以是诺如病毒(Norovirus)、札幌病毒(Sapovirus)、兔病毒(Lagovirus)、或囊泡病毒(Vesivirus)。可以在不从衣壳序列删除任何氨基酸的情况中将异源抗原或其片段直接插入杯状病毒衣壳序列的氨基酸序列中。或者，异源抗原或片段替换杯状病毒衣壳蛋白的ー个或多个残基。异源抗原可以源自各种病原体，诸如病毒、细菌和真核病原体。在一些实施方案中，异源抗原可以源自肿瘤关联抗原或变应原。异源抗原可以是T细胞或B细胞刺激性表位。本发明还包括包含本发明的嵌合衣壳蛋白的病毒样颗粒及编码新型嵌合衣壳蛋白的分离的核酸和载体。在一些实施方案中，嵌合衣壳蛋白包含源自诺如病毒的衣壳蛋白和至少ー种异源抗原或其片段。例如，诺如病毒可以是基因群I或基因群II诺如病毒。本发明提供了包含含有本发明的嵌合蛋白的病毒样颗粒的疫苗配制剂。在ー些实施方案中，疫苗配制剂进一歩包含佐剂。疫苗配制剂可以是液体配制剂或干粉末配制剂。本发明还涵盖通过施用如本文中所描述的疫苗配制剂诱导对外来作用剂(foreign agent)的免疫应答的方法。 本发明还包括生成嵌合病毒样颗粒的方法。在一个实施方案中，该方法包括在宿主细胞中表达如本文中所描述的嵌合蛋白，并在形成病毒样颗粒的条件中培养宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是昆虫细胞。附图简述图I. A. GI. I诺如病毒诺瓦克(Norwalk)VPl亚基中溶剂可及的P2域环。GI. I诺瓦克VPl衣壳蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO: I)。P2域残基画有灰色阴影，而此域内的溶剂可及的环残基加下划线且加粗。B.诺如病毒GII. 4共有VPl亚基中的溶剂可及的P2域环。GII. 4共有VPl衣壳蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO: 2)。P2域残基画有灰色阴影，而此域内的溶剂可及的环残基加下划线且加粗。图2.诺如病毒GII. 4共有VPl亚基的结构模型，其中鉴定的溶剂可及的P2域环关出显不。图3. A.使用诺瓦克VPl原子结构作为模板得到的札幌病毒Hu/横滨16-4/2007/JP VPl亚基的结构模型。B.使用SMSV VPl原子结构作为模板得到的札幌病毒Hu/横滨16-4/2007/JP VPl亚基的结构模型。图4. A.使用诺瓦克VPl原子结构作为模板得到的札幌病毒Hu/横滨16-4/2007/JP VPl亚基中溶剂可及的P2域环。札幌病毒Hu/横滨16-4/2007/JPVP1衣壳蛋白的氨基酸序列(SEQ ID N0:3)。基于诺瓦克VPl模板，P2域残基画有灰色阴影，而此域内的溶剂可及的环残基加下划线且加粗。B.使用SMSV VPl原子结构作为模板得到的札幌病毒Hu/横滨16-4/2007/JP VPl亚基中溶剂可及的P2域环。札幌病毒Hu/横滨16-4/2007/JP VPl衣壳蛋白的氨基酸序列(SEQ ID N0:3)。基于SMSV VPl模板，P2域残基画有灰色阴影，而此域内的溶剂可及的环残基加下划线且加粗。图5.诺如病毒诺瓦克(SEQ ID NO: I)与囊泡病毒圣米盖尔海狮(San Miguel sealion) (SMSV ；SEQ ID N0:4) VPl衣壳蛋白间的氨基酸序列比对。星号表示相同的残基；冒号表示保守替代；句点表示半保守替代；而空格表示非保守替代。图6.诺如病毒GI. I诺瓦克VPl亚基中外来表位的残基替换和插入位点(突出显示)。
图7.嵌合诺瓦克VLP的表位插入和部分替换位点。将源自流行性感冒血凝素抗原的9个氨基酸的表位(SEQ ID NO: 5)在标示的氨基酸残基后直接插入或者替换诺瓦克VPl蛋白序列中标不的残基。图8.对嵌合诺瓦克VLP生成的SDS-PAGE分析。将源自流行性感冒血凝素抗原的9个氨基酸的表位在诺瓦克VPl蛋白序列中氨基酸残基362或296后直接插入。自经修饰的VPl序列生成病毒样颗粒，并通过SDS-PAGE分析。第I道，分子量标准品；第2道，362插入离心后上清液；第3道，362离心沉淀级分；第4道，362插入滤液；第5道，296插入离心后上清液；第6道，296离心沉淀级分；和第7道，296插入滤液。约57kDa的蛋白质条带代表嵌合诺瓦克VPl蛋白。图9.对嵌合诺瓦克VLP生成的Western印迹分析。用抗诺瓦克抗体(左侧小图)或抗HA抗体(右侧小图)探查含有血凝素(HA)表位的嵌合VLP的Western印迹。第I道，分子量标准品；第2道，在VPl残基336处具有HA表位插入的嵌合VLP ;第3道，具有VPl残基337-341的HA表位替换的嵌合VLP ;和第4道，野生型诺瓦克VPl。约57kDa的蛋白质·条带代表嵌合诺瓦克VPl蛋白。
图10.通过连续流动离心(CFC)纯化嵌合诺瓦克VLP。星号代表完整的嵌合诺瓦克 VLP。图11.通过大小排阻层析分析嵌合诺如病毒VLP。红色迹线_220nm吸收；蓝色迹线-280nm吸收。图12.通过电子显微术对嵌合诺如病毒VLP的分析。图13.通过连续流动离心(CFC)纯化嵌合诺瓦克VLP (含有29个残基的RSV-F蛋白表位)。星号代表完整的嵌合诺瓦克VLP。图14.通过电子显微术对嵌合诺如病毒VLP(含有29个残基的RSV-F蛋白表位)的分析。图15. OD的倍数增加作为血清稀释的函数，其中6只动物中的2只显示抗RSV-FIgG抗体大于4倍的增加。图16.对含有2个经修饰的表面环的嵌合诺瓦克VLP生成的SDS-PAGE分析。将源自RSV-F抗原的9个氨基酸的表位在残基338和363处同时插入，或者同时替换残基337-341并在残基363处插入。自经修饰的VPl序列生成病毒样颗粒，并通过SDS-PAGE分析。第I道，分子量标准品；第2道，338和363插入离心后上清液；第3道，338和363插入离心沉淀级分；第4道，338和363插入插入滤液；第5道，337-341替换和363插入离心后上清液；第6道，337-341替换和363插入离心沉淀级分；和第7道，337-341替换和363插入滤液。约57kDa的蛋白质条带代表嵌合诺瓦克VPl蛋白。图17.将HA蛋白序列在诺瓦克VPl蛋白的氨基酸338和339间插入或者其替换VPl的氨基酸337-341。在第0天和第7天在没有佐剂的情况中腹膜内施用HA-NVLP。在第14天收集血清，并通过ELISA对其分析抗原特异性IgM的存在。显示各个結果，其中水平棒代表组的几何均值。图18.来自图17的小鼠接受在第37天用A10H/MPL配制的HA-NVLP额外免疫。第64天收集血清，并通过ELISA对其分析HA特异性IgG的存在。显示各个结果，其中水平棒代表组的几何均值。
发明详述本发明基于如下的发现，即可以将异源肽插入杯状病毒衣壳蛋白的特定的、暴露于溶剂的区域中，使得衣壳蛋白保留形成VLP的能力。本发明人已经开发出工程化改造杯状病毒衣壳蛋白，使得在自经修饰的衣壳蛋白形成的VLP表面上有效展示一种或多种异源抗原的有效策略。如此，本发明提供了包含源自杯状病毒的衣壳蛋白和至少ー种异源抗原或其片段的新型嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白能够在宿主细胞中表达时形成VLP。
如本文中所使用的，“嵌合蛋白”指包含来自两种或更多种生物体的肽的融合蛋白。两种或更多种肽可以在其氨基或羧基端融合。或者，一种或多种肽可以在另一种肽内的内部位置处融合。优选地，本发明的嵌合蛋白包含源自杯状病毒的衣壳蛋白或其一部分。杯状病毒或杯状病毒科(Caliciviridae)包括囊泡病毒、诺如病毒、兔病毒和札幌病毒属。本发明的嵌合蛋白的衣壳蛋白可以源自来自这四种属之任一的衣壳蛋白。例如，在ー些实施方案中，衣壳蛋白源自圣米盖尔海狮病毒，一种囊泡病毒。在一个实施方案中，衣壳蛋白具有SEQ ID NO:4的序列。在某些实施方案中，衣壳蛋白源自诺如病毒。诺如病毒属分成5种基因群(genogroup) (GI、GII、GIII、GIVjP GV)。GI、GII 和 GIV 诺如病毒在人类中是传染性的，而GIII诺如病毒主要感染牛物种。最近已经自小鼠分离了 GV(Zheng等(2006)Virology,第346卷:312-323) 代表性的GIII是耶拿(Jena)和纽卡斯尔(Newbury)毒株，而Alphatron、劳德代尔堡(Fort Lauderdale)和圣克劳德(Saint Cloud)毒株是GIV的代表。GI和GII组可以基于遗传分类进一歩分成遗传簇或基因型(Ando等(2000)J. Infectious Diseases,Vol.181 (Supp2):S336-S348;Lindell 等(2005)J. Clin. Microbiol.，第43卷(3) : 1086 - 1092)。如本文中所使用的，术语遗传簇与术语基因型可互換使用。在基因群I内，至今已知8种GI簇(具有原型病毒株名称)GI. 1(诺瓦克(NV-USA93)) ；GI. 2 (Southhampton (S0V-GBR93)) ；GI. 3(沙原(Desert Shield) (DSV-USA93)) ；GI. 4(旅游客船(Cruise Ship)病毒/千叶(Chiba)(千叶-JPN00)) ；GI.5 (318/Musgrove(Musgrov-GBROO)) ；GI. 6(海塞(Hesse)(海塞-DEU98)) ；GI. 7 (Wnchest-GBROO)；和 GI. 8 (Boxer_USA02)。在基因群 II 内，至今已知19种GII簇(具有原型病毒株名称)GII.1(夏威夷(夏威夷-USA94)) ;GII.2(雪山/梅尔克舍姆(Melksham) (Msham_GBR95)) ；GII. 3(多伦多(多伦多-CAN93))； GII. 4 (布里斯托尔(Bristol)/Lordsdale (布里斯托尔-GBR93)) ；GII. 5(290/ 希灵登(Hillingdon) (Hilingd-GBROO)) ；GII.6 (269/Seacroft(Seacrof-GBROO))；GII. 7(273/ 利兹(Leeds)(利兹-GBR00)) ；GII. 8(539/ 阿姆斯特丹(Amsterdam)(Amstdam-NLD")) ;GII. 9 (378 (VABeach-USAOl))、GII. 10(爱尔福特(Erfurt)-DEUOl)；GII. 11(SW9180JPNOI) ；GII. 12(沃特列(Wortley)-GBROO) ；GII. 13(Faytvi1-USA02)；GII. 14(M7-USA03) ；GII. 15(J23-USA02) ；GII. 16(Tiffin-USA03) ；GII. 17(CSE1-USA03)；GII. 18(QW101/2003/US) GII. 19 (Qff 170/2003/US) 在一个实施方案中，衣壳蛋白源自基因群I或基因群II诺如病毒。在另ー个实施方案中，衣壳蛋白源自基因群I、基因型KGI. I)或基因群II、基因型4(GII.4)诺如病毒。优选地，掺入本发明的嵌合蛋白中的诺如病毒衣壳蛋白是VP1，即由可读框(ORF) 2编码的主要衣壳蛋白。在一个实施方案中，衣壳蛋白具有SEQ ID N0:1的氨基酸序列。新型嵌合蛋白的衣壳蛋白组分可以源自任何已知诺如病毒株的主要衣壳蛋白。见例如GenBank条目诺如病毒基因群I株Hu/NoV/西切斯特(West Chester)/2001/USA,GenBank 登录号 AY502016 ;诺如病毒基因群 2 株 Hu/NoV/fcaddock Heights/1999/USA,GenBank 登录号 AY502015 ;诺如病毒基因群 2 株 Hu/NoV/Fayette/1999/USA，GenBank 登录号 AY502014 ;诺如病毒基因群 2 株 Hu/NoV/ 费尔菲尔德(Fairfield)/1999/USA，GenBank登录号AY502013 ;诺如病毒基因群2株Hu/NoV/桑达斯基(Sandusky)/1999/USA，GenBank登录号AY502012 ;诺如病毒基因群2株Hu/NoV/坎顿(Canton)/1999/USA, GenBank登录号AY502011 ;诺如病毒基因群2株Hu/NoV/蒂芬(Tiffin)/1999/USA，GenBank登录号AY502010 ;诺如病毒基因群 2 株 Hu/NoV/CS-El/2002/USA，GenBank 登录号 AY50200 ;诺如病毒基因群 I 株 Hu/NoV/威斯康星(Wisconsin)/2001/USA，GenBank 登录号 AY502008 ；诺如病毒基因群I株Hu/NoV/CS-841/2001/USA，GenBank登录号AY502007 ;诺如病毒基因群2株Hu/NoV/海勒姆(Hiram)/2000/USA，GenBank登录号AY502006 ;诺如病毒基因群 2 株 Hu/NoV/Tontogany/1999/USA，GenBank 登录号 AY502005 ;诺瓦克病毒，完整基因组，GenBank 登录号 NC. sub. —001959 ;诺如病毒 Hu/GI/Otofuke/1979/JP 基因组 RNA，完整基因组，GenBank 登录号 AB187514 ;诺如病毒 Hu/北海道(Hokkaido)/133/2003/JP,·GenBank 登录号 AB212306 ;诺如病毒 Sydney 2212，GenBank 登录号 AY588132 ;诺瓦克病毒株SN2000JA，GenBank登录号AB190457 ；Lordsdale病毒完整基因组，GenBank登录号X86557 ;诺瓦克样病毒基因组RNA，Gifu’ 96，GenBank登录号AB045603 ;诺瓦克病毒株越南 026，完整基因组，GenBank 登录号 AF504671 ;诺如病毒 Hu/GII. 4/2004/N/L, GenBank 登录号 AY883096 ;诺如病毒 Hu/GII/Hokushin/03/JP，GenBank 登录号 AB195227 ;诺如病毒Hu/GII/Kamo/03/JP，GenBank 登录号 AB195228 ;诺如病毒 Hu/GII/Sinsiro/97/JP，GenBank登录号 AB 195226 ;诺如病毒 Hu/GII/Ina/02/JP，GenBank 登录号 AB195225 ;诺如病毒 Hu/NLV/GII/Neustrelitz260/2000/DE, GenBank 登录号 AY772730 ;诺如病毒 Hu/NLV/ 德累斯顿(Dresden) 174/pUS-NorII/1997/GE，GenBank 登录号 AY741811 ;诺如病毒 Hu/NLV/牛津 /B2S16/2002/UK，GenBank 登录号 AY587989 ;诺如病毒 Hu/NLV/ 牛津 /B4S7/2002/UK，GenBank 登录号 AY587987 ;诺如病毒 Hu/NLV/ 威特尼(Witney)/B7S2/2003/UK，GenBank登录号 AY588030 ;诺如病毒 Hu/NLV/ 班伯里(Banbury) /B9S23/2003/UK, GenBank 登录号 AY588029 ;诺如病毒 Hu/NLV/ 奇平诺顿(ChippingNorton) /2003/UK, GenBank 登录号 AY588028 ;诺如病毒 Hu/NLV/Didcot/B9S2/2003/UK，GenBank 登录号 AY588027 ；诺如病毒 Hu/NLV/ 牛津 /B8S5/2002/UK，GenBank 登录号 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;诺如病毒基因群 2 株 Hu/NoV/CS-G4/2002/USA, GenBank 登录号 AY502022 ；诺如病毒基因群2株Hu/NoV/CS-G2/2002/USA，GenBank登录号AY502021 ;诺如病毒基因群2株Hu/NoV/CS-G12002/USA，GenBank登录号AY502020 ;诺如病毒基因群2株Hu/NoV/安克雷奇(Anchorage) /2002/USA, GenBank登录号AY502019 ;诺如病毒基因群2株 Hu/NoV/CS-Dl/2002/CAN，GenBank 登录号 AY502018 ;诺如病毒基因群 2 株 Hu/NoV/Germanton/2002/USA, GenBank 登录号 AY502017 ;人杯状病毒 NLV/GII/Langenl061/2002/DE，完整基因组，GenBank登录号AY485642 ;鼠诺如病毒I多蛋白，GenBank登录号AY228235 ;诺瓦克病毒，GenBank登录号 AB067536 ;人杯状病毒NLV/Mex7076/1999，GenBank登录号AF542090 ;人杯状病毒NLV/奥伯豪森(Oberhausen) 455/01/DE，GenBank登录号 AF539440 ;人杯状病毒 NLV/Herzberg 385/01/DE, GenBank 登录号 AF539439 ;人杯状病毒NLV/Boxer/2001/US，GenBank登录号AF538679 ;诺瓦克样病毒基因组RNA，完整基因组，GenBank登录号AB081723 ;诺瓦克样病毒基因组RNA，完整基因组，隔离群=SaitamaU201，GenBank登录号AB039782 ;诺瓦克样病毒基因组RNA，完整基因组，隔离群SaitamaU18, GenBank登录号AB039781 ;诺瓦克样病毒基因组RNA，完整基因组，隔离群=SaitamaU25, GenBank 登录号 AB039780 ;诺瓦克病毒株U25GII，GenBank 登录号 AB067543 ;诺瓦克病毒株U201GII，GenBank 登录号 AB067542 ；诺瓦克样病毒株 416/97003156/1996/LA, GenBank 登录号 AF080559 ;诺瓦克样病毒株 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AF414409 ;它们所有的序列(如到本申请的提交日前录入的)通过提及收入本文。其它诺如病毒序列在下列专利公开文本中披露W02005/030806、WO 2000/79280、JP2002020399、US2003129588、美国专利No. 6，572，862、WO 1994/05700和WO 05/032457，通过提及而将它们都完整收入本文。还可见 Green 等(2000) J. Infect. Dis.，第 181 卷(增刊 2) :S322-330 ;Wang 等(1994) J. Virol.，第 68 卷:5982-5990 ；Chen 等(2004) J. Virol.，第 78 卷6469-6479 ；Chakravarty 等(2005) J. Virol.,第 79 卷554-568 ;Hansman 等(2006) J. Gen. Virol.,第 87 卷:909-919 ；Bull 等(2006)J. Clin. Micro.,第 44 卷(2) :327-333 ;Siebenga 等
(2007)J. Virol.，第 81 卷(18):9932-9941，及 Fankhauser 等(1998)J. Infect. Dis.，第178卷1571-1578 ;以供序列比较和讨论诺如病毒的遗传多祥性和系统发生分析。在其它实施方案中，嵌合蛋白的衣壳蛋白组分是源自两种或更多种诺如病毒流行(circulating)毒株的复合衣壳蛋白。掺入来自两种或更多种诺如病毒流行毒株的氨基酸序列的复合衣壳蛋白序列记载于2009年8月10日提交的国际申请No. PCT/US2009/053249，通过提及而将其收入本文。在一个实施方案中，复合衣壳蛋白源自两种或·更多种基因群II. 4诺如病毒的流行毒株。在ー个具体的实施方案中，复合衣壳蛋白具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在某些实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含源自札幌病毒的衣壳蛋白。札幌病毒属可以进ー步分类成5种不同基因群(GI-GV)。衣壳蛋白可以源自5种基因群之任一中的札幌病毒的VPl衣壳蛋白。例如，在一些实施方案中，衣壳蛋白源自札幌病毒、伦敦/29845病毒、Hu/横滨16-4/2007/JP病毒、曼彻斯特(Manchester)病毒、休斯顿/86病毒、休斯顿/90病毒和派克维尔(Parkville)病毒的衣壳蛋白。在ー个具体的实施方案中，衣壳蛋白具有SEQ ID N0:3的氨基酸序列。新型嵌合蛋白的衣壳蛋白组分可以源自任何已知札幌病毒株的主要衣壳蛋白。例如，GenBank条目札幌病毒MclO,GenBank登录号NC. sub.—010624 ；札幌病毒，GenBank登录号U65427 ;札幌病毒MclO，GenBank登录号AY237420 ;札幌病毒SaKaeo-15/ 泰国，GenBank 登录号 AY646855 ;札幌病毒，GenBank 登录号 NC. sub. —006269 ；札幌病毒 C12，GenBank 登录号 NC. sub. —006554 ;札幌病毒 C12，GenBank 登录号 AY603425 ；札幌病毒Hu/德累斯顿/pJG-Sap01/DE，GenBank登录号AY694184 ;人杯状病毒SLV/旅游客船 /2000/USA，GenBank 登录号 AY289804 ;人杯状病毒 SLV/Arg39，GenBank 登录号AY289803 ;猪肠杯状病毒株LL14，GenBank登录号AY425671 ;猪肠杯状病毒，GenBank登录号NC. sub. —000940 ;人杯状病毒株Mc37，GenBank登录号AY237415 ;貂肠杯状病毒株加拿大 151A，GenBank 登录号 AY144337 ;人杯状病毒 SLV/Hou7_l 181，GenBank 登录号 AF435814 ；人杯状病毒 SLV/Mex 14917/2000，GenBank 登录号 AF435813 ；人杯状病毒 SLV/Mex340/1990，GenBank登录号AF435812 ;猪肠杯状病毒，GenBank登录号AF182760 ;札幌病毒-伦敦/29845，GenBank登录号U95645 ;札幌病毒-曼彻斯特，GenBank登录号X86560 ;札幌病毒-休斯顿/86，GenBank登录号U95643 ;札幌病毒-休斯顿/90，GenBank登录号U95644 ；和人杯状病毒株HuCV/波茨坦(Potsdam)/2000/DEU，GenBank登录号AF294739 ;它们所有的序列(如到本申请的提交日前录入的)通过提及收入本文。还可见Schuffenecker等(2001)Arch Virol.,第 146 卷(11) :2115-2132 ;Zintz 等(2005)Infect. Genet. Evol.,第5 卷:281-290 ； Farkas ^ (2004) Arch. Virol.，第 149 卷:1309-1323 ;以供序列比较和札幌病毒的遗传多祥性和系统发生分析的讨论。
杯状病毒的主要衣壳蛋白组织成独特的域壳或“ S”域，和突出域或“ P”域，其进一歩分成Pl和P2域。衣壳单体的“S，，域聚结以形成病毒外壳的売，而茎样Pl域和球状P2域自拱状结构的壳向外突出。关于杯状病毒结构的表征，见Prasad等(2000) Journalof Infectious Diseases,第181卷S317-S321。P2球状域位于病毒衣壳表面上，并且认为含有抗原决定簇，而且规定宿主特异性(见例如Crisci等(2009) Virology,第387卷:303-312 ；Kumar 等(2007)Journal of Virology,第 81 卷:1119-1128 ；Katpally 等
(2008)Journal of Virology,第82卷:2079-2088)。Pl域和P2域的各部分是稳定化衣壳结构需要的。本发明人已经鉴定出P2域的特定的暴露于溶剂的环区(见实施例I)，其中 可以在不破坏衣壳结构的情况中插入来自异源抗原的氨基酸序列。如此，在一个实施方案中，将至少一种异源抗原或其片段插入杯状病毒衣壳蛋白的P2域中以形成本发明的嵌合蛋白。在一些实施方案中，将至少一种异源抗原或其片段插入杯状病毒衣壳的P2域的至少ー个暴露于溶剂的环中。如本文中所使用的，“暴露于溶剂的”或“溶剂可及的”指在単体在装配好的VLP中折叠成其天然构象时位于衣壳単体的外部表面(而不是疏水性核心、VLP内部、或蛋白质-蛋白质界面)上的氨基酸残基。本发明人采用如本文中所描述的序列比对、3D结构分析和3D结构建模来鉴定杯状病毒衣壳蛋白中的P2域及暴露于溶剂的环域(见实施例I)。可以依照本发明使用类似的方法和软件应用，诸如Geno3D2和Swiss PDB观察器(viewer)来鉴定衣壳蛋白中其它合适的暴露于溶剂的环残基。在某些实施方案中，诺如病毒衣壳蛋白中可以插入异源抗原或其片段的合适的暴露于溶剂的环包括但不限于SEQ ID NO: I的氨基酸293-300、SEQID N0:1的氨基酸305-313,SEQ ID NO: I 的氨基酸 335_342、SEQ ID NO: I 的氨基酸 348_351、SEQ ID NO: I 的氨基酸 362-368、SEQ ID NO: I 的氨基酸 380-386、SEQ ID NO: I 的氨基酸 397-405、SEQ IDNO: 2 的氨基酸 293-300、SEQ ID NO: 2 的氨基酸 306-317、SEQ ID NO: 2 的氨基酸 338-346、SEQ ID NO:2 的氨基酸 354-357、SEQ ID NO:2 的氨基酸 366-375、和 SEQ ID NO:2 的氨基酸388-405(见例如，图IA和B中加下划线的、粗体区)。在其它实施方案中，札幌病毒衣壳蛋白中可以插入异源抗原或其片段的合适的暴露于溶剂的环包括但不限于SEQ ID N0:3的氨基酸 296-315、SEQ ID NO:3 的氨基酸 327-334、SEQ ID NO:3 的氨基酸 355-363、SEQ IDNO: 3 的氨基酸 374-377、SEQ ID NO: 3 的氨基酸 388-394、SEQ ID NO: 3 的氨基酸 404-410、SEQ ID NO:3 的氨基酸 414-429、SEQ ID NO:3 的氨基酸 281-297、SEQ ID N0:3 的氨基酸304-307,SEQ ID NO:3 的氨基酸 313_317、SEQ ID NO:3 的氨基酸 327_339、SEQ ID N0:3 的氨基酸 349-354、SEQ ID NO: 3 的氨基酸 365_389、SEQ ID NO: 3 的氨基酸 396-402 和 SEQ IDNO: 3的氨基酸421-424(见例如，图4A和B中加下划线的、粗体区)。可以将ー种或多种异源抗原或其片段插入暴露于溶剂的环或用其替换暴露于溶剂的环中ー个或多个或所有氨基酸。可以将ー种或多种异源抗原或其片段插入P2域的多个暴露于溶剂的环，诸如P2域的2、3、4、5、6、或7个暴露于溶剂的环。可以将相同异源抗原序列的多个拷贝插入多个暴露于溶剂的环中。另外/或者，可以将不同异源抗原序列插入不同暴露于溶剂的环中以创建嵌合蛋白，其含有来自多种生物体的肽序列、来自ー种或多种生物体的多种蛋白质、或来自ー种或多种蛋白质的多个区。在一些实施方案中，为了形成本发明的嵌合蛋白，在不删除衣壳氨基酸残基的情况中将异源抗原或肽的氨基酸序列直接插入杯状病毒衣壳序列中。优选地，将异源氨基酸序列在P2域的暴露于溶剂的环区内直接融合。在某些实施方案中，将至少一种异源抗原序列插入GI. I诺瓦克VPl衣壳序列(SEQ ID NO: I)中。异源抗原序列向诺瓦克VPl衣壳序列的优选插入位点包括直接在SEQ ID NO: I的第295位天冬酰胺残基、第296位甘氨酸残基、第308位脯氨酸残基、第336位甘氨酸残基、第338位丝氨酸残基、第362位天冬酰胺残基、第363位甘氨酸残基、第382位脯氨酸残基、第383位丝氨酸残基、第399位异亮氨酸残基、或第402位丙氨酸残基后的插入。在其它实施方案中，异源抗原或肽的氨基酸序列替换本发明的嵌合蛋白中杯状病毒衣壳蛋白的一个或多个氨基酸。例如，至少ー种异源抗原或其片段替换衣壳蛋白的约I至约50个氨基酸、约2至约40个氨基酸、约4至约20个氨基酸、约8至约15个氨基酸、或约10至约30个氨基酸。在ー个具体的实施方案中，至少ー种异源抗原或其片段替换衣壳蛋白的约5个氨基酸。在一些实施方案中，用至少ー种异源抗原序列替换诺瓦克VPl衣壳序列(SEQ ID NO: I)的至少ー个氨基酸。在一个实施方案中，用异源氨基酸序列替换SEQ ID NO: I的氨基酸337-341。在其它实施方案中，用异源氨基酸序列替换SEQ ID N0:1的氨基酸294-298、氨基酸307-311、氨基酸362-366、氨基酸381-385或氨基酸401-405。在一些实施方案中，异源氨基酸序列替换衣壳蛋白的暴露于溶剂的环中的所有氨基酸。本发明的嵌合蛋白包含任选地经由接头序列(例如，约I至约10个氨基酸或更多)与衣壳蛋白序列融合或在衣壳蛋白序列内融合的至少ー种异源抗原或其片段。“异源抗原”指来自与衍生衣壳蛋白的物种不同的物种的免疫原性蛋白质或肽。在一些实施方案中，异源抗原或其片段包含抗原性表位。“抗原性表位”指由免疫系统的抗体或细胞识别的三维结构。如本文中所使用的，抗原性表位包括T细胞和B细胞表位及抗体结合表位。在一个实施方案中，异源抗原或其片段包含模拟表位。模拟表位是ー种线性氨基酸序列，其模拟表位的结构，并且因此被结合表位的抗体识别。在另ー个实施方案中，异源抗原或其片段包含代表不连续表位的复合线性氨基酸序列或含有不连续表位的一部分的线性氨基酸序列。例如，可以将包含不连续表位的各部分的异源抗原序列插入相邻的暴露于溶剂的环区中，使得插入序列彼此接触以生成不连续表位。对于常见的病原性作用剂，抗原性表位和模拟表位是本领域中已知的。例如，可用于本文中所描述的发明的T细胞表位可以是呼吸道合胞病毒(RSV)的F蛋白上的免疫优势T细胞表位(Levely等(1991)Journal of Virology,第65卷3789-3796)或来自RSV的核蛋白特异性细胞毒性T细胞表位(Venter 等(2003) Journal of Virology,第 77 卷7319-7329)。熟练技术人员可以使用本领域中的常规方法，包括但不限于使用蛋白质微阵列、ELISP0T測定法和ELISA測定法的表位定位、噬菌体展示分析和抗原/抗体复合物的结构建模确定插入本发明的嵌合蛋白中的其它合适的表位。在某些实施方案中，可以将多个表位插入本发明的嵌合蛋白中以提供ー种或多种表位文库以供随后筛选。在另ー个实施方案中,在杯状病毒衣壳蛋白中插入的外来序列包含对于特定外来抗原的高亲和カ结合位点。对于此方法，高亲和カ结合位点的识别可以是外来抗原的固有特性或者可以生成构建体，其中将外来抗原与识别高亲和カ结合位点的蛋白质融合。例如，高亲和カ结合位点可以是抗体中结合外来抗原的互补位(paratrope)或抗原结合位点或者它可以是蛋白质中与外来抗原，诸如受体相互作用的结合区。在一些实施方案中，高亲和力结合位点可以是短的、线性结合基序，诸如聚脯氨酸基序(由SH2域识别)、亮氨酸拉链(由也含有亮氨酸拉链基序的结合配偶体识别)或表位(由抗体片段的抗原结合位点识别)。在此类实施方案中，将外来抗原附接于识别短的、线性肽结合基序(工程化改造入VPl亚基中)的结合位点，并且非共价结合包含含有外来抗原结合位点的嵌合蛋白的病毒样颗粒。 异源抗原或其片段可以是任何长度的，更具体地，长度为约5至约70个氨基酸，长度为约8至约50个氨基酸，长度为约10至约40个氨基酸，长度为约15至约35个氨基酸，或者长度为约20至约30个氨基酸。在一些实施方案中，异源抗原或其片段的长度为约5至约20个氨基酸。可以经由任选的接头序列将异源抗原或其片段与杯状病毒衣壳序列融合。接头序列可以是约I至约10个氨基酸或更多。异源抗原或其片段可以源自多种病原性作用剂，诸如病毒、细菌、和真核病原体。例如，在一个实施方案中，异源抗原源自病毒。可以衍生出异源抗原的病毒包括逆转录病毒科(Retroviridae)(例如人免疫缺陷病毒，诸如HIV-1 (又称为HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV、或 HIV-III);和其它隔离群，诸如 HIV-LP);小 RNA 病毒科(Picomaviridae)(例如脊髓灰质炎病毒(polio virus)、甲肝病毒；肠道病毒(enteroviruses)、人柯萨奇病韋(Coxsackie viruses)、鼻病韋(rhinoviruses)、艾柯病韋(echoviruses));杆状病毒科(Calciviridae)(例如引起胃肠炎的毒株，包括诺瓦克及相关病毒)；披盖病毒科(Togaviridae)(例如马脑炎病毒、风疫病毒(rubella viruses));黄病毒科(Flaviridae)(例如登革病毒(dengue viruses)、脑炎病毒(encephalitis viruses) >黄热病病韋(yellow fever viruses));冠状病韋科(Coronoviridae)(例如冠状病韋(coronaviruses));弹状病韋科(Rhabdoviradae)(例如水泡性 ロ 膜炎病韋(vesicularstomatitis viruses) > $E M ^ (,rabies viruses)) ；(Filoviridae)
(例如埃博拉病毒(ebola viruses));副粘病毒科(Paramyxoviridae)(例如副流感病毒、腿腺炎病毒(mumps virus)、麻疫病毒(measles virus)、呼吸道合胞病毒、偏肺病毒(metaneumovirus));正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如流感病毒)；布尼亚病毒科(Bungaviridae)(例如汉坦病毒(Hantaan viruses)、布尼亚病毒(bunga viruses)、白 岭病韋(phleboviruses)和内罗病韋(Nairo viruses));沙粒病韋科(Arenaviridae)(出血热病毒(hemorrhagic fever viruses));呼肠孤病毒科(Reoviridae)(例如呼肠孤病韋、环状病韋(orbiviurses)和轮状病韋)；双RNA病韋科(Bimaviridae) J1FDNA病毒科(Hepadnaviridae)(こ肝病毒)；细小病毒科(Parvovirida)(细小病毒)；乳多空病毒科(Papovaviridae)(乳头瘤病韋(papilloma viruses),多瘤病春(polyomaviruses));腺病韋科(Adenoviridae)(大多数腺病韋)；抱疫病韋科(Herpesviridae)(单纯疱疹病毒(HSV)I和2、水痘帯状疱疹病毒(varicella zoster virus)、巨细胞病毒(cytomegalovirus, CMV)、疱疫病毒(herpes virus));痘病毒科(Poxviridae)(类天花病毒(variola viruses)、痘苗病毒(vaccinia viruses)、痘病毒(pox viruses));和虹彩病毒科(Iridoviridae)(例如非洲猪痕病毒(African swine fever virus));和未分类的病毒(例如海绵状脑病的病原学因素、丁型肝炎(delta hepatitis)的因素(认为是こ肝病毒的一种缺陷性卫星)、非甲型肝炎、非こ型肝炎的因素(I类=内部传播的；2类=胃肠外传播的(即丙肝)；和星状病毒(astixwiruses)。在某些实施方案中，病毒选自下組轮状病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、和偏肺病毒。例如，可以使用源自呼吸道合胞病毒F蛋白的靶序列诸如26°lindmpitn268 (seq id no6)或25°ymltnsellslindmpitndqkklmsnnv278 (sEQ ID N0:7)生成嵌合杯状病毒VLP。在其它实施方案中，病毒是杯状病毒。例如，异源抗原可以源自本文中所描述的任何杯状病毒株。在一些实施方案中，异源抗原源自细菌病原体。可以衍生出异源抗原的細菌包括病原性巴斯德氏菌属(Pasteurella)物种(例如，多杀巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida))、葡萄球菌属(Staphylococci)物种(例如，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus))、链球菌属(Streptococcus)物种(例如，酿胺链球菌(Streptococcuspyogenes) (A 组链球菌)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae) (B 组链球菌)、链球菌属(绿色组(viridans group))、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、链球菌属(厌氧种(anaerobic sps.))、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae))、奈瑟氏球菌属(Neisseria)物种(例如，淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑月旲炎奈瑟氏球囷(Neisseria meningitidesノ)、埃·希氏菌属(Escherichia)物种(例如，肠毒性大肠杆菌(E. coli) (ETEC)、致肠病性大肠杆菌(EPEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)、和肠侵染性大肠杆菌(EIEC))、博德特氏菌属(Bordetella)物种、弯曲杆菌属(Campylobacter)物种、军团菌属(Legionella)物种(例如，侵肺军团菌(Legionella pneumophila))、假单胞菌属(Pseudomonas)物种、志贺氏菌属(Shigella)物种、弧菌属(Vibrio)物种、耶尔森氏菌属(Yersinia)物种、沙门氏菌属(Salmonella)物种、嗜血菌属(Haemophilus)物种(例如，流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae))、布鲁氏菌属(Brucella)物种、弗朗西丝氏菌属(Francisella)物种、拟杆菌属(Bacterioides)物种、梭菌属(Clostridia)物种(例如，艰难梭菌(Clostridiumdifficile)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、破伤风梭菌(Clostridiumtetani))、分枝杆菌属(Mycobacteria)物种(例如结核分枝杆菌(M. tuberculosis)、鸟分枝杆菌(M. avium)、胞内分枝杆菌(M. intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(M. kansaii)、戈登分枝杆菌(M. gordonae))、幽门螺杆菌(Helicobacter pyloris)、布氏疏螺旋体(Borelia burgdorferi)、单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、肠球菌属(Enterococcus)物种、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、广ノ、肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、月市炎兑這イ白氏菌(Klebsiella pneumoniae)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、念珠状链杆菌(StreptobaciIIus moniliformis)、彻白密螺旋体(Treponema palladium)、极细密螺旋体(Treponema pertenue)、钩端螺旋体属(Leptospira)、立克次氏体(Rickettsia)、和以色列放线 1 (Actinomyces israeli)。在本发明的其它实施方案中，异源抗原或其片段源自真核病原体，诸如病原性真菌和寄生物。可以衍生出异源抗原的真菌包括但不限于新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)、夹膜组织胞衆菌(Histoplasma capsulatum)、粗球抱子菌(Coccidioidesimmitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、白念珠菌(Candida albicans)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、烟曲霉(Aspergillus fumigate)、黄曲霉(Aspergillusflavus)、和申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)。可以衍生出异源抗原的其它真核病原体包括病原性原生动物、蠕虫(helminth)、疟原虫(Plasmodium)，诸如恶性痕原虫(Plasmodium falciparum)、三日痕原虫(Plasmodium malariae)、卵形痕原虫(Plasmodium ovale)、和间日痕原虫(Plasmodium vivax);鼠弓形体(Toxoplasmagondii);布 fc维虫(Trypanosoma brucei)、克氏维虫(Trypanosoma cruzi；;埃及血吸虫(Schistosoma haematobium)、曼氏裂体吸虫(Schistosoma mansoni)、日本裂体吸虫(Schistosoma japonicum);杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani);肠贾第虫(Giardiaintestinalis);小球隐抱子虫(Cryptosporidium parvum);等等。在本发明的某些实施方案中，异源抗原或其片段源自肿瘤关联抗原(TAA)。可以使用多种已知肿瘤特异性抗原或肿瘤关联抗原(TAA)之任一种作为要掺入本发明的嵌合蛋白中的一种或多种异源抗原或其片段(Hirohashi等(2009)Cancer Sci.,第100卷
(5):798-806)。可以在本发明的嵌合蛋白中使用的肿瘤关联抗原(或其含有表位的片段)包括但不限于MAGE-2、MAGE-3、MUC-I、MUC-2、HER-2、高分子量黑素瘤关联抗原MAA、⑶2、癌胚抗原(CEA)、TAG-72、卵巢关联抗原0V-TL3和M0V18、TUAN、a -胎蛋白(AFP)、0FP、CA-125、CA-50、CA-19-9、肾肿瘤关联抗原G250、EGP_40 (又称为EpCAM)、S100 (恶性黑素瘤关联抗原)、P53和p21ras。可以使用任何TAA (或其表位)的合成类似物，包括任何上述物质。在另ー个实施方案中，异源抗原或其片段源自变应原。可以衍生出ー种或多种异源抗原或其片段的变应原包括但不限于环境空气源性变应原；植物花粉诸如豚草/枯草热(hayfever);杂草花粉变应原；禾本科花粉变应原(grass pollen allergen);约翰逊草(Johnson grass);树花粉变应原；麦草；蜘蛛纲(arachnid)变应原，诸如房尘螨变应原(例如，Der p I、Der f I等)；储藏室螨(storage mite)变应原；日本柳杉(Japanesecedar)花粉/干草热(hay fever);霉孢子变应原；动物变应原(例如，犬、豚鼠、仓鼠、沙鼠、大鼠、小鼠等变应原)；食物变应原(例如，甲壳类；坚果，诸如花生；柑桔类水果的变应原);昆虫变应原；毒液(膜翅类(Hymenoptera)、黄色胡蜂(yellow jacket)、蜜蜂(honey bee)、黄蜂(wasp)、胡蜂(hornet)、火蚁(fire ant));来自蟑螂、跳蚤、蚊子等的其它环境昆虫变应原；细菌变应原诸如链球菌抗原；寄生物变应原诸如蛔虫抗原；病毒抗原；真菌孢子；药物变应原；抗生素；青霉素及相关化合物；其它抗生素；全蛋白诸如激素(胰岛素)、酶(链激酶);职业(occupational)变应原诸如面粉(例如，引起烤箱(Baker)哮喘的变应原)、蓖麻(castor bean)、咖B非豆；跳蚤变应原；和非人动物中的人蛋白质。特定的天然的动物和植物变应原的例子包括但不限于对下列属特异性的蛋白质犬(家犬(Canis familiaris));表皮螨属(Dermatophagoides)(例如粉尘螨(Dermatophagoidesfarinae));猫(Felis)(家猫(Felis domesticus));豚草(Ambrosia)(豚草(Ambrosiaartemiisfolia));黑麦草属(Lolium)(例如多年生黑麦草(Lolium perenne)或多花黑麦草(Lolium multifIorum));柳杉(Cryptomeria)(日本柳杉)；链格抱属(Altemaria)(互隔交链格孢(Altemaria altemata));植木(Alder);棺木属(Alnus)(欧洲植木)；桦木属(Betula)(抚皮样(Betula verrucosa));栎属(Quercus) (Quercus alba);木禪揽属(Olea)(油撤揽(Olea europa));蒿属(Artemisia)(北艾(Artemisia vulgaris))；车前属(Plantago)(例如长叶车前(Plantago Ianceolata));墙草属(Parietaria)(例如 Parietaria off icinalis 或 Parietaria judaica);小爐属(Blattella)(例如德国小爐(Blattella german ica));蜂(Apis)(例如 Apis multif Iorum);桕木属(Cupressus)(例如地中海柏木(Cupressus sempervirens)、绿干桕(Cupressus arizonica)和大果桕木(Cupressus macrocarpa));刺柏属(Juniperus)(例如 Juniperus sabinoides、北美Isl桕 yuniperus virginiana)、欧洲剌桕 yuniperus communis)和 Juniperus ashei)；Thuya(例如Thuya orientalis);扁桕属(Chamaecyparis)(例如日本扁桕(Chamaecyparisobtusa));大蠊属(Periplaneta)(例如美洲大爐(Periplaneta Americana));冰草属(Agropyron)(例如匍匍冰草(Agropyron repens));黑麦属(Secale)(例如黑麦(Secalecereale));小麦属(Triticum)(例如小麦(Triticum aestivum));鸭茅属(Dactylis)(例如鸭茅(Dactylis glomerata));羊茅属(Festuca)(例如 Festuca elatior);早熟禾属(Poa)(例如草地早熟禾(Poapratensis)或Poa compressa);燕麦属(Avena)(例如燕麦(Avena sativa));域毛草属(Holcus)(例如域毛草(Holcus Ianatus));黄花茅偶(Anthoxanthum) I 例如黄花矛(Anthoxanthum odoratum));燕麦草厲(Arrhenatherum)(例如燕麦草(Arrhenatherun elatius));剪股颖属(Agrostis)(例如小槺草(Agrostisalba));梯牧草属(Phleum)(例如梯牧草(Phleum pratense));藹草属(Phalaris)(例如·藹草(Phalaris arundinacea));雀稗属(Paspalum)(例如百喜草(Paspalum notatum))；高粱属(Sorghum)(例如石茅(Sorghum halepensis));和雀麦属(Bromus)(例如无芒雀麦(Bromus inermis；；。本发明包括编码如本文中所描述的嵌合蛋白的分离的核酸和载体。在一个实施方案中，分离的核酸编码包含具有P2域的杯状病毒衣壳蛋白和至少ー种异源抗原或其片段的嵌合蛋白，其中所述至少一种异源抗原或其片段插入所述衣壳蛋白的所述P2域中。在另ー个实施方案中，本发明提供了包含编码如本文中所描述的嵌合蛋白的分离的核酸的载体。在又一个实施方案中，本发明提供了包含编码本发明的嵌合蛋白的载体的宿主細胞。宿主細胞可以是細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、或哺乳动物細胞。本发明的嵌合蛋白和编码其的分离的核酸可以通过本领域中已知的常规方法制备。衣壳蛋白可以通过自它们天然存在的特定杯状病毒分离并纯化来制备，或者它们可以通过重组技术来制备。一旦将期望颗粒形成性多肽的编码序列分离或合成，便可以将它们克隆入任何合适的载体或复制子中以进行表达。许多克隆/表达载体是本领域技术人员已知的，并且合适的克隆/表达载体的选择在普通技术人员的技术范围内。可以使用常规技术和分子生物学方法，包括DNA合成、PCR诱变、和限制性内切核酸酶消化，接着进行DNA连接来将ー种或多种异源抗原序列插入杯状病毒衣壳蛋白序列内的指定位置中。描述可应用于本发明的分子生物学技木，诸如克隆、突变等的通用教科书包括 Berge 和 Kimmel, Guiae to Molecular Cloning Techniques, Methods inEnzymology 弟 152 卷 Academic Press,Inc.,San Diego,Calif. (Berger);Sambrook等，Molecular Cloning—A Laboratory Manual (第 3 片反)，第 1-3 卷，ColdSpring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor，N. Y.，2000 ( ‘‘Sambrook，，)及 Current Protocols inMolecular Biology, F. M. Ausubel 等编，Current Protocols, a joint venture betweenGreene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc. , (‘‘Ausubel。这些教科书描述了诱变、使用载体、启动子和许多其它相关主题，其涉及例如嵌合衣壳蛋白的克隆和表达。本发明的嵌合蛋白能够在宿主细胞中表达时形成病毒样颗粒(VLP)。如此，本发明还包括包含如本文中所描述的嵌合蛋白的病毒样颗粒。发明人已发现了用于工程化改造杯状病毒的衣壳蛋白序列以掺入异源氨基酸序列同时保留衣壳蛋白形成VLP的能力的独特策略。在一些实施方案中，将嵌合蛋白与来自杯状病毒的一种或多种结构蛋白，诸如次要衣壳蛋白VP2共表达。其它结构蛋白可以来自衍生出嵌合蛋白的相同杯状病毒或者它们可以来自不同杯状病毒。 在某些实施方案中，VLP包含本发明的嵌合蛋白和来自杯状病毒的天然衣壳蛋白。仅举例而言，VLP可以包含嵌合蛋白和诺瓦克VPl衣壳蛋白。可以调节VLP中嵌合蛋白与天然衣壳蛋白的比率以增强VLP形成。例如，嵌合蛋白与天然衣壳蛋白的比率可以是约1:10至约10: I、约1:5至约5: I、或约1:1。可以如下生成含有嵌合的和天然的衣壳蛋白的混合物的VLP，即分开表达每种衣壳蛋白(即嵌合的和天然的)，纯化蛋白质，并以期望的比率混合两种纯化的衣壳蛋白以形成混合的VLP。或者，可以自两种不同启动子在宿主细胞中共表 达嵌合的和天然的衣壳蛋白。不同強度启动子的使用容许控制所得VLP中嵌合蛋白与天然衣壳蛋白的比率。在另ー个实施方案中，可以将本发明的嵌合蛋白进ー步修饰以增强VLP形成。例如，可以将衣壳氨基酸序列和/或异源抗原氨基酸序列的暴露于溶剂的环区工程化改造以含有ー种或多种基序，从而控制嵌合蛋白的构象。可以将此类稳定化基序设计为经由包括离子相互作用(诸如盐桥)、金属配位(诸如锌指)、疏水性相互作用(诸如亮氨酸拉链)或共价相互作用(诸如ニ硫键形成)的机制驱动期望的蛋白质接触。本发明涵盖生成嵌合VLP的方法。在一个实施方案中，该方法包括在宿主细胞中表达本发明的嵌合蛋白，并在形成VLP的条件中培养所述宿主细胞。使用编码如本文中所描述的嵌合蛋白序列的载体来转化合适的宿主细胞。合适的重组表达系统包括但不限于细菌(例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、和链球菌属(Streptococcus))、杆状病毒/昆虫、痘苗、塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus, SFV)、a 病毒(Alphaviruses)(诸如,辛德毕斯(Sindbis)、委内瑞拉马脑炎(Venezuelan Equine Encephalitis, VEE))、哺乳动物(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HEK-293细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、小鼠黑素瘤(SB20)、和猴肾细胞(COS))、酵母(例如酿酒酵母(S. cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(S. pombe)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastori)和其它毕赤酵母属(Pichia)表达系统)、植物、和非洲蟾蜍属(Xenopus)表达系统，及本领域中已知的其它表达系统。特别优选的表达系统是哺乳动物细胞系、细菌、昆虫细胞、和酵母表达系统。无细胞转录翻译系统代表生成嵌合VLP的别的方法。在某些实施方案中，自昆虫细胞，诸如埃及伊蚊(Aedes aegypti)、家蚕(Bombyxmori)、黑腹果妮(Drosophila melanogaster)、草地夜蛾(Spodoptera frugiperda) (Sf9)、和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)(例如，High Five、TniPro)制备嵌合VLP。在昆虫细胞培养物中生成VLP的规程是本领域中公知的(见例如，美国专利No. 6，942，865，通过提及而将其完整收入本文)。简言之，通过插入编码靶基因的合成的或克隆的阅读框构建携帯嵌合衣壳序列的重组杆状病毒。然后，使用重组杆状病毒感染昆虫细胞培养物(例如Sf9、HighFive和TniPix)细胞)，并可以自细胞培养物分离嵌合VLP。“嵌合VLP”是包含具有如本文中所描述的嵌合氨基酸序列的至少ー种多肽的VLP。若VLP在细胞内形成，则使用化学、物理或机械手段(其裂解细胞，而将VLP保持基本上完整)破坏细胞。此类方法是本领域技术人员已知的，并且记载于例如ProteinPurification Applications : A Practical Approach, (E. L. V. Harri s 矛ロ S. Anga丄编，1990)。然后，使用保持其完整性的方法，诸如通过密度梯度离心，例如蔗糖梯度、PEG-沉淀、粒化(pelleting)等(见例如 Kirnbauer 等 J. Virol. (1993)67:6929-6936),以及标准纯化技术，包括层析方法，例如离子交換和凝胶过滤层析分离(或基本上纯化)颗粒。在一些实施方案中，通过施用包含编码嵌合蛋白的分离的核酸的载体在体内生成嵌合VLP。合适的载体包括但不限于病毒载体，诸如水泡性ロ膜炎病毒(VSV)载体、马脑炎病毒(EEV)载体、痘病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒(AAV)、逆转录病毒载体、和表达质粒，诸如 pFastBacl、pWINEO、pSV2CAT、pOG44、pXTl、pSG、pSVK3、pBPV、pMSG、和 pSVL 。其它合适的载体会是熟练技术人员容易显而易见的。本发明提供了包含如本文中所描述的ー种或多种VLP的疫苗配制剂。在一个实施方案中，疫苗配制剂包含嵌合VLP，其中所述嵌合VLP包含嵌合蛋白，该嵌合蛋白含有具有P2域的杯状病毒衣壳蛋白和至少ー种异源抗原或其片段，其中所述至少一种异源抗原或其片段插入所述衣壳蛋白的所述P2域中。在某些实施方案中，嵌合蛋白中的杯状病毒衣壳蛋白是诺如病毒或札幌病毒衣壳蛋白。在ー个具体的实施方案中，嵌合蛋白包含来自诺如病毒基因群I或基因群II诺如病毒的衣壳蛋白。在另ー个实施方案中，嵌合蛋白包含来自GI. I或GII. 4诺如病毒的衣壳蛋白。在某些实施方案中，包含本发明的至少ー种嵌合VLP的疫苗配制剂不含佐齐U。在一些实施方案中，疫苗配制剂可以进ー步包含佐剂。大多数佐剂含有设计为保护抗原免于快速代谢的物质，诸如氢氧化铝或矿物油，和免疫应答刺激剤，诸如百日咳博德特氏菌(Bordatella pertussis)或结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)衍生的蛋白质。合适的佐剂是商品化的，如例如，弗氏不完全佐剂和完全佐剂(PifcoLaboratories, Detroit, Mich. ) ;Merck 佐别 65(Merck and Company, Inc. , Rahway, N. J.)；矿物盐，包括铝盐诸如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝和钙、铁或锌的盐；酰化酪氨酸酰化糖的不溶性悬浮液；阳离子或阴离子衍生化的多糖；聚磷腈；生物可降解微球体；和QuilA0合适的佐剂还包括但不限于toll样受体(TLR)激动剂、单磷酰基脂质A(MPL)、合成脂质A、脂质A模拟物或类似物、铝盐、细胞因子、皂苷、胞壁酰ニ肽(MDP)衍生物、CpG寡聚物、革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)、聚磷腈、乳剂、病毒体、蜗状佐剂(cochleates)、聚(丙交酷-共-こ交酷)(PLG)微粒、泊洛沙姆(poloxamer s)颗粒、微粒、脂质体、水包油乳齐[J、MF59和鲨烯。在一些实施方案中，佐剂是细菌衍生的外毒素。在其它实施方案中，可以使用刺激Th I型应答的佐剂，诸如3DMPL或QS21。在某些实施方案中，佐剂是MPL和氢氧化铝的组合。在某些实施方案中，佐剂是单磷酰基脂质A(MPL)。MPL是ー种来自沙门氏菌属(Salmonella)的无毒性脂质A衍生物，是已经作为疫苗佐剂开发的ー种有力的TLR-4激动剂(Evans等(2003)Expert Rev Vaccines,第2卷219_229)。在临床前鼠类研究中，已经显示了鼻内MPL增强分泌性及系统性体液应答(Baldridge等(2000) Vaccine,第18 卷2416-2425 ;Yang 等(2002) Infect Immun.,第 70 卷:3557-3565)。还已经在超过120，000名患者的临床研究中证明它作为疫苗佐剂是安全且有效的(Baldrick等(2002)Regul Toxicol Pharmacol,第 35 卷398-413)。MPL 经由 TLR-4 受体刺激先天性免疫的诱导，并且如此能够引发针对一大批感染性病原体，包括革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌两者、病毒、和寄生物的非特异性免疫应答(Persing等(2002)Trends Microbiol,第10卷S32-37)。在疫苗配制剂中纳入MPL应当提供先天性应答的快速诱导，自病毒攻击引发非特异性免疫应答，同时增强由疫苗的抗原性组分生成的特异性应答。在一些实施方案中，可以组合MPL与一种或多种其它佐剂。例如，可以组合MPL与氢氧化铝以创建适合于疫苗配制剂的肌肉内施用的佐剂。在其它实施方案中，佐剂是天然存在的油，诸如鲨烯。鲨烯是ー种由植物生成的三萜烃类油(C3tlH5tl),并且存在于许多食物中。人类也大量生成鲨烯，它对于人类充当胆固醇和类固醇激素的前体。它在肝和皮肤中合成，通过极低密度脂蛋白(VLDL)和低密度脂蛋白·(LDL)在血液中转运，并由皮脂腺大量分泌。因为鲨烯是人体的天然组分，并且是生物可降解的，所以它已经作为疫苗佐剂的组分使用。这些鲨烯佐剂之ー是MF59，即由Chiron开发的一种水包油乳剤。已经在多个临床前和临床研究中显示MF59显著增强对极其多种疫苗抗原的免疫应答。MF59是流感亚基疫苗(其自1997年起已经在多个欧洲国家得到许可)的一部分。已经给予超过2000万剂的此种疫苗，并且已经显示了它具有卓越的安全性概况。还已经通过使用来自こ肝病毒、丙肝病毒、巨细胞病毒、单纯疱疫病毒、人免疫缺陷病毒、尿路病原性(uropathogenic)大肠杆菌等的重组抗原在多个年龄组，包括I至3天龄新生儿的多个调查性临床研究显示了具有MF59佐剂的疫苗的安全性。术语“有效佐剂量”或“有效量的佐剂”会为本领域技术人员充分理解，并且包括能够刺激对施用抗原的免疫应答的一种或多种佐剂的量，即提高施用的抗原组合物的免疫应答的量，如按鼻清洗物中IgA水平、血清IgG或IgM水平、或B和T细胞增殖测量的。与没有任何佐剂的相同抗原组合物相比，免疫球蛋白水平的适当有效的升高包括大于5%，优选地大于25%，且特别地大于50%。在本发明的另ー个实施方案中，疫苗配制剂可以进ー步包含递送剂，其基于，但不限于由于宿主粘多糖部分脱水、递送剂的物理性质或通过递送剂与在暴露部位的宿主组织间的离子相互作用(其提供储存效应)的単一或组合效应所致的流体粘性升高而发挥增强抗原摄取的功能。或者，递送剂能増加抗原在投递部位的保留时间(例如，延迟抗原的排出)。此类递送剂可以是生物粘着剤。在一些实施方案中，生物粘着剂可以是选自下组的粘膜粘着剂糖胺聚糖(例如，硫酸软骨素、硫酸皮肤素软骨素、硫酸角质素、肝素、硫酸こ酰肝素、透明质酸)、碳水化合物聚合物(例如，果胶、藻酸盐、糖原、淀粉酶(amylase)、支链淀粉、纤维素、壳多糖、水苏糖、unulin、糊精、右旋糖苷)、聚(丙烯酸)的交联衍生物、聚こ烯醇、聚こ烯吡咯烷酮、多糖(包括粘蛋白、其它粘多糖、和'GelSite ，即ー种自芦荟植物提取的天然酸性多糖)、聚离子化合物(polyion)、纤维素衍生物(例如，羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素)、蛋白质(例如，凝集素、菌毛蛋白)、和脱氧核糖核酸。在一个实施方案中，疫苗配制剂包含多糖，诸如壳聚糖、壳聚糖盐、壳聚糖碱或天然多糖(例如GelSite^)。
壳聚糖(即ー种源自甲壳类(crustaceans)外壳中的壳多糖的带正电荷的直链多糖)是上皮细胞及其覆盖粘液层的生物粘着剤。用壳聚糖配制抗原増加其与鼻膜的接触时间，如此凭借储存效应提高摄取(Ilium等(2001)Adv Drug Deliv Rev,第51卷:81-96;Illum 等(2003)J Control Release,第 87 卷:187-198;Davis 等(1999)Pharm Sci Technol Today,第 2 卷450-456; Bacon 等(2000) Infect Immun.,第 68卷5764-5770; van der Lubben等(2001)Adv Drug Deliv Rev,第52卷139-144; van derLubben等(2001) Eur J Pharm Sci,第 14卷201-207; Lim等(2001) AAPS Pharm Sci Tech,第2卷20)。已经在动物模型和人两者中将壳聚糖作为鼻投递系统针对几种疫苗，包括流感、百日咳和白喉进行了测试(Ilium 等(2001)Adv Drug Deliv Rev,第 51 卷81-96; Ilium等(2003)J Control Release,第 87 卷187-198;Bacon 等(2000)Infect Tmmun.,第 68卷:5764-5770;Jabbal-Gill 等(1998)Vaccine,第 16 卷:2039-2046;Mills 等(2003)AInfect Immun,第 71 卷726-732;McNeela 等(2004) Vaccine,第 22 卷909-914 )。在这些试验中，显示了壳聚糖将系统性免疫应答提高到与胃肠外疫苗接种等同的水平。另外，还在粘膜分泌中測量到显著的抗原特异性IgA水平。如此，壳聚糖能极大增强鼻疫苗的效率。此外，由于壳聚糖的物理特征，其特别良好地适合于配制为粉末的鼻内疫苗(van derLubben 等(2001)Eur J Pharm Sci,第 14 卷201-207;Mikszta 等(2005)J Infect Dis,第 191卷278-288;Huang 等(2004)Vaccine,第 23 卷794-801)。在本发明的一些实施方案中，疫苗配制剂包含壳聚糖、壳聚糖盐、或壳聚糖碱等。壳聚糖的分子量可以是10kDa_800kDa，优选地100kDa_700kDa，且更优选地200kDa-600kDa。组合物中的壳聚糖浓度通常会多至约80%(w/w)，例如，5%、10%、30%、50%、70%或80%。壳聚糖是优选至少75%脱こ酰化，例如80-90%，更优选地82-88%脱こ酰化的壳聚糖，具体的例子是83%、84%、85%、86%和87%脱こ酰化。疫苗配制剂可以进ー步包含药学可接受载体。药学可接受载体，包括任何合适的稀释剂或赋形剂，包括任何其自身不诱导对接受该疫苗制剂的受试者有害的免疫应答产生并可在没有异常毒性情况下施用的药剂。如本文中使用的，术语“药学可接受的”意指经联邦或州政府的管理机构批准，或列于美国药典、欧洲药典或其它通常接受的药典以供在哺乳动物中(且更特别地，在人类中)使用。药学可接受载体包括但不仅限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、灭菌的等张水性缓冲液及其组合。药学可接受载体、稀释剂和其它赋形剂的透彻讨论在 Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co. N. J.当前版本)中给出。配制剂应适应施用模式。在一个优选实施方案中，所述配制剂适合于对人施用，优选地配制剂是无菌的、非颗粒的和/或无热原的。若需要的话，疫苗配制剂还可含有少量的润湿剂或乳化剤，或PH缓冲剂。本发明的VLP或嵌合蛋白可以配制为用于作为疫苗或抗原性配制剂施用。如本文中使用的，术语“疫苗”指含有如上文所述的本发明的VLP或嵌合蛋白的配制剂，其为能够对脊椎动物(例如哺乳动物)施用，并诱导足以诱导免疫以阻止和/或缓解感染和/或减少至少ー种感染症状和/或增强另ー剂VLP或嵌合蛋白的效カ的保护性免疫应答的形式。在一些实施方案中，疫苗配制剂不含佐剂。在其它实施方案中，疫苗配制剂可以含有如本文中所描述的佐剂。如本文中使用的，术语“抗原性配制剂”或“抗原性组合物”指当对脊椎动物，例如哺乳动物施用时，会诱导免疫应答的制剂。如本文中使用的，术语“免疫应答”指体液免疫应答和细胞介导的免疫应答两者。体液免疫应答涉及刺激B淋巴细胞产生抗体，其例如中和传染原、阻断传染原进入细胞、阻断所述传染原的复制和/或保护宿主细胞免受感染和破坏。所述细胞介导的免疫应答指脊椎动物(例如人)展现的，由T淋巴细胞和/或其它细胞如巨噬细胞介导的，针对传染原的免疫应答，其阻止或缓解感染或減少其至少ー种症状。具体而言，“保护性免疫”或“保护性免疫应答”指脊椎动物(例如人)展现的，针对传染原的免疫，或免疫应答的引发，其阻止或缓解感染或減少其至少ー种症状。具体而言，所述疫苗施用对保护性免疫应答的诱导因消除或降低与衍生出存在于嵌合蛋白中的异源抗原的病原性生物体有关的ー种或多种症状的存在而是明显的。疫苗制备一般性地描述于 Vaccine Design( ^The subunit and adjuvant approach，，(Powell M. F. & NewmanM. J.编)(1995)Plenum Press New York)。本发明的组合物可配制为例如通过粘膜或胃肠外(例如肌肉内、静脉内、表皮下、真皮内、真皮下或经皮)施用途径对受试者施用。此类粘膜施用可为，但不限于通过胃肠、鼻内、经ロ或阴道投递。在一个实施方案中，所述疫苗配制剂为鼻喷剂、滴鼻剂或干粉形式。在另ー个实施方案中，所述疫苗配制剂为适于肌肉内施用的形式。本发明的疫苗配制剂可为液体配制剂或干粉配制剂。当所述组合物意欲递送于呼 吸道(例如鼻)粘膜时，通常将其配制为水溶液以供作为气雾剂或滴鼻剂施用，或者，作为干粉例如用于快速沉积于鼻道中。用于作为滴鼻剂施用的组合物可含有ー种或多种通常包括在这类组合物中的类型的赋形剂，例如防腐剤、粘性调节剂、张カ调节剂、缓冲剂等。粘性剂可为微晶纤维素、壳聚糖、淀粉、多糖等。用于作为干粉施用的组合物还可含有一种或多种通常包括在这类组合物中的赋形剂，例如粘膜粘着剤、填充剂和用于递送适当粉末流动和大小特征的药剂。填充剂和粉末流动和大小药剂可包括甘露醇、蔗糖、海藻糖和木糖醇。在一个实施方案中，疫苗配制剂含有一种或多种嵌合VLP作为免疫原,佐剂诸如MPL 、鲨烯或MF59 、生物聚合物诸如壳聚糖或GelSite 以促进对粘膜表面的粘着，以及填充剂诸如甘露醇和蔗糖。例如，疫苗可以配制为含有ー种或多种如本文中讨论的嵌合VPL、MPL 佐剂、壳聚糖粘膜粘着剂以及作为填充剂并提供适当流动特征的甘露醇和蔗糖的IOmg的干粉。所述制剂可包含约7. 0mg(25至90%w/w范围)的壳聚糖,约I. 5mg甘露醇(0至50%w/w范围)，约 I. 5mg 鹿糖(0 至 50%w/w 范围)，约 25 ii g MPL" (0. I 至 5%w/w 范围)，以及约 100 u g嵌合VLP抗原(0. 05至5%w/w范围)。嵌合VLP/抗原可以以约0.01%(w/w)至约80%(w/w)的浓度存在。在一个实施方案中，VLP 可配制为约 5 u g、约 15 u g、约 25 u g、约 50 u g、约 75 u g、约 100 u g、约 150 u g、约 200iig、约 500iig 以及约 Img 每 IOmg 干粉制剂(0. 05,0. 15,0. 25、0. 5、I. 0、2. 0、5. 0和10. 0%w/w)的剂量以供给药至两个鼻孔中(姆个鼻孔IOmg)或约10 ii g、约30 ii g、约50ii g、约 IOOii g、约 200ii g、约 400ii g、约 Img 和约 2mg (0. 1、0. 3、0. 5、1. 0、2. 0、4. 0,10. 0和20.0%w/w)每20mg干粉制剂以供施用至ー个鼻孔。在毎次施用过程中，所述配制剂可给予ー个或两个鼻孔。可在第一次施用之后I至12周进行加强施用以改善免疫应答。疫苗和抗原性配制剂中每种VLP/抗原的含量可为I Ug至IOOmg的范围，优选为I-IOOOiig的范围，更优选5-500 ii g，最通常为10-200 ii g范围中。每剂施用的总VLP/抗原可为约10 y g、约30 u g、约200 u g、约250 u g、约400 u g、约500 u g或约1000 u g。总疫苗剂量可施用至一个鼻孔或分为两半以供施用至两个鼻孔。干粉特征为使得少于10%的颗粒直径小于10 u m。均值颗粒大小为直径范围是10至500 u m。在本发明的另ー个实施方案中，所述干粉配制剂可与ー种或多种装置组合以供施用一剂或多剂所述配制剂。此类装置可为一次性鼻施用装置。在另ー个实施方案中，所述ー剂或多剂为单位剂量。在一些实施方案中，所述抗原性和疫苗配制剂为液体配制剂以供后续对受试者施用。意欲用于鼻内施用的液体配制剂应包含嵌合VLP/抗原、佐剂和递送剂诸如壳聚糖。用于胃肠外(例如皮下、真皮内或肌肉内(i.m.))施用的液体配制剂应包含嵌合VLP/抗原、佐剂和缓冲液，而不含递送剂(例如壳聚糖)。优选地，本文中上述抗原性和疫苗制剂经冻干，并以无水形式储存直至其准备好·使用，在准备好使用的时间点将其用稀释剂重建。或者，组合物的不同组分可分别贮存于试剂盒中(任何或全部组分是冻干的)。所述组分可保持冻干形式用于干配制剂或经重建用于液体配制剂，并或者在使用前混合或者分别对患者施用。对于干粉施用，所述疫苗或抗原性配制剂可预加载入鼻内投递装置并贮存直至使用。优选地，此类鼻内投递装置会保护并确保其成分的稳定性。本发明提供了一种在受试者中诱导对外来作用剂的免疫应答的方法。在一个实施方案中，该方法包括对受试者施用如本文中所描述的疫苗配制剂，其中所述疫苗配制剂包含嵌合蛋白，其中存在于嵌合蛋白中的异源抗原或其片段源自来自所述外来作用剂的蛋白质。受试者可能有风险获得来自所述外来作用剂的感染，可能患有来自所述外来作用剂的感染，或者可能具有由外来作用剂引起的复发性感染。因而，本发明包括预防和治疗与外来作用剂有关的感染的方法，其通过施用包含本文中所描述的嵌合蛋白的本发明的疫苗或抗原性配制剂来进行，所述嵌合蛋白含有来自外来作用剂的异源抗原。在一些实施方案中，包含本发明的嵌合VLP的本发明的疫苗或抗原性配制剂不含佐剂。在其它实施方案中，疫苗或抗原性配制剂可以包含本文中所描述的佐剂。本发明现在会更详细地通过參照下述实施例中所述的具体实施方案来阐明。所述实施例的意图纯系对本发明的说明，并不意欲以任何方式限制其范围。
实施例实施例I :鉴定杯状病毒VLP中的抗原插入位点诺如病毒病毒样颗粒(VLP)的生物反应器生产和下游加工是充分表征的，并且已经用于最初的概念验证研究，其证明嵌合杯状病毒VLP的生成。对于GI. I诺瓦克VPl亚基，通过评估高分辨率X-射线晶体结构(PDB代码1IHM)实施了适合于插入外来表位的暴露于表面的环区的鉴定(见图1A)。在使用程序Geno3D2产生原子结构模型后进行了复合GII. 4诺如病毒衣壳蛋白(GII.4共有)的类似评估(见图1B)。此软件使用同源蛋白的原子结构作为模板(在GII. 2共有的情况中为Gl. I诺瓦克)，并且提供会类似地用于生成具有足够的序列相似性并且缺乏原子结构数据的任何杯状病毒衣壳蛋白的结构模型的策略。通过使用Swiss PDB观察器分析残基可及性实施对诺如病毒GI. I诺瓦克和GII. 4共有VPl亚基中P2域暴露于表面的环区的鉴定。先前已经鉴定出诺如病毒衣壳蛋白的 P2 域边界(见例如，Prasad 等(2000) Journal of Infectious Diseases,第 181卷S317-S321)。使用相同软件手动检查原子结构确认了 P2域表面环的合适分配。图I显示了 GI. I诺瓦克(1A;SEQ ID NO: I)和GII. 4共有(1B;SEQ ID NO:2)VPl亚基的氨基酸序列，其中P2域残基加有灰色阴影，而此域内的溶剂可及的环区加下划线并以粗体字体表示。图2显示GII. 4共有结构模型(90°旋转)，其中溶剂可及的P2域环突出显示。为了将上文概述的方法延伸至其它杯状病毒，另外对札幌病毒Hu/横滨16-4/2007/JP VPl亚基实施了结构建模和溶剂可及的P2域环的鉴定。选择此种特定的札幌病毒，因为它代表人胃肠炎中的ー种致病剂。对于杯状病毒家族，原子结构目前可用于诺瓦克(诺如病毒)和圣米盖尔海狮(SMSV ;囊泡病毒)VPl衣壳蛋白。如图3中所显示的，使用程序Geno3D2评估札幌病毒衣壳蛋白产生了源自诺瓦克(图3A)和SMSV(图3B)VP1亚基两者的原子结构模型作为结构模板。通过使用Swiss PDB观察器分析残基可及性实施对每种札幌病毒VPl结构模型鉴定P2域暴露于表面的环区。通过与用于结构建模的模板进行序列比对限定札幌病毒衣壳蛋白的P2域边界。图4显示了 Hu/横滨16-4/2007/JP VPl亚基的氨基酸序列(SEQ ID N0:3)，其中P2域残基加有灰色阴影，而此域内的溶剂可及的环区加下划线并以粗体字体表不。根据作为模板用于产生模型的原子结构，上述分析表明结构模型和鉴定的表面P2域环两者中的实质性差异。尽管有这两种衣壳蛋白属于杯状病毒家族的实情，根据相对较低的总体序列同一性和序列比对中的较大缺ロ，诺瓦克和SMSV VPl亚基间的显著结构差异不是意料之外的(图5 ;P2域残基加有灰色阴影)。使用可用的模板结构实施对其它杯状病毒亚基的原子结构模型的产生，所述模板结构显示与靶物的最大序列同源性。或者，在序列同系物是大致等同的情况中，其它杯状病毒亚基的结构模型使用许多可用的杯状病毒VPl结构。在与靶物的相似序列同源性的情况中设计使用多种结构模板以提高合适的表位插入位点的成功鉴定的可能性。实施例2 :在杯状病毒VPl可读框中插入外来表位采用两种独特的策略来广泛筛选向GI. I诺瓦克VPl亚基的优选位点中的外来表位插入1)在P2域的溶剂可及的环中多个残基位置处的简单插入；和2)P2域的溶剂可及的环残基的替换。使用合适的合成寡核苷酸作为诱变引物进行牵涉9个氨基酸的插入物的诱变，而通过基因合成生成具有较大插入物的构建体。一种用于生成具有较大插入物的嵌合VLP的备选策略牵涉将独特的限制性位点工程化改造入VPl阅读框的期望区中，以便连接编码合适的表位序列的合成的DNA或PCR产物。实施类似的策略用于在其它杯状病毒衣壳蛋白中的表位插入。对于第一代构建体，使用QuickChange Lightning诱变试剂盒(Stratagene; LaJolla, CA)，使用PCR诱变在诺瓦克VPl亚基中插入模式表位。使用含有诺瓦克VPl作为DNA模板的穿梭载体生成构建体，其中通过PCR和DNA序列分析确认所得的嵌合序列。然后，将嵌合VPl阅读框亚克隆入转移载体PVL1393中以实现重组杆状病毒的生成。若在生成供亚克隆用的插入物前使用PCR扩增，则通过DNA序列分析确认最終的阅读框。此方法容许快速且有效生成许多表位/插入位点组合。通过DNA合成生成具有较大表位插入的嵌合VPl阅读框，随后亚克隆入转移载体PVL1393中以实现重组杆状病毒的生成。图6显示了诺瓦克VPlx-射线结构(90°旋转)，其中已经用外来抗原替换的残基突出显示。图6中显示的第一代构建体代表P2域中已经用9个氨基酸模式表位替换的5个暴露于溶剂的环残基(见实施例3)。还已经生成如下的第一代构建体，其含有模式表位在图6中突出显示的环中的选定残基间的直接插入(即，没有删除任何VPl残基)。关于诺瓦克VPl氨基酸序列中暴露于溶剂的残基的位置，见实施例I和图1A。实施例3 :嵌合杯状病毒VLP的生成通过将转移载体(pVL1393-诺瓦克VPl)和线性杆状病毒DNA共转染入粘附Sf9昆虫细胞中，接着进ー步病毒扩张以生成高滴度储液来进行编码嵌合诺瓦克VPl亚基的重组杆状病毒的生成。作为对嵌合VLP生成的初始概念验证筛选，将源自流行性感冒血凝素抗原的模式表位(HA表位序列-YPYDVPDYA(SEQ ID NO: 5))直接在诺瓦克VPl残基296、336、362,383或399后插入。另外，对其中用此模式抗原替换诺瓦克VPl残基337-341或残基362-366的构建体进行表达试验。图7显示含有直接插入或已经用模式血凝素表位替换的诺瓦克VPl残基。·对于生成嵌合VLPdf Sf9昆虫细胞在50mL旋转器烧瓶(spinner-f Iask)培养中培养至2xl06个细胞/ml，然后以估计的感染复数(MOI)=L 0用重组杆状病毒的Pl储液感染。在感染后，通过在感染后T=96至120小时低速离心收获培养物并随后用0. 2iim滤器澄清，其中由于天然细胞裂解，将VLP释放入培养物上清液中。图8中显示的SDS-PAGE分析描绘了来自含有VPl残基296或362后插入的模式HA抗原的嵌合诺瓦克VLP的表达研究的结果(第I道，分子量标准品；第2道，362插入离心后上清液；第3道，362离心沉淀级分；第4道，362插入滤液；第5道，296插入离心后上清液；第6道，296离心沉淀级分；和第7道，296插入滤液)。362插入嵌合物的离心后上清液(第2道)和滤液(第4道)级分中以预期分子量(约57kDa)迁移的主要诺瓦克VPl条带展示与天然诺瓦克VPl相似的表达样式，而且表明此溶剂可及的P2环有效耐受外来抗原插入的能力。图8还显示了含有直接在诺瓦克VPl残基296后插入的模式HA表位的构建体的上述级分中低得多的VPl表达水平(第5道和第7道)。在这些研究中，296插入构建体的表达减少源自细胞裂解前对VPl亚基的蛋白水解(其可能源自VPl亚基的一部分缺乏VLP装配)，而且表明仅鉴定暴露于表面的环不足以确保嵌合VLP的有效生成。对于含有在VPl残基336后插入的或替换残基337-341的模式HA表位的诺瓦克VPl亚基，在图9中确认了使用上述策略生成嵌合VLP的能力。使用Western印迹分析证明以预期的分子量(约57kDa)迁移的SDS-PAGE条带，其显示与抗诺瓦克和抗HA表位单克隆抗体的特异性且合适的反应性(第I道，分子量标准品；第2道，在VPl残基336处具有表位插入的嵌合VLP ;第3道，具有VPl残基337-341的表位替换的嵌合VLP ;和第4道，野生型诺瓦克VPl)。对于嵌合诺瓦克VLP的小規模表达和纯化，将Sf9昆虫细胞在Sf-900II培养基(1L摇瓶培养)中培养至2x IO6个细胞/ml，然后以MOI=O. 5用重组杆状病毒感染。在VLP表达后(感染后96至120小吋)，通过低速离心收获培养物井随后使用0. 2 y m滤器澄清。因为装配好的VLP具有特征性高分子量(约IOMDa)，所以可以通过不依赖于表面化学的方法，诸如蔗糖梯度离心和大小排阻层析容易地纯化物质。图10显示了通过连续流动离心(CFC)纯化嵌合诺瓦克VLP (336插入)，其中使用TCF-32转子通过以100，OOOx g离心约16小时在0-60%线性蔗糖梯度上分离了纯化起始材料。此分析表明起始条件化培养基(CM)中嵌合VLP的高水平生成和在预期为病毒样颗粒的某个蔗糖密度显带的嵌合VPl亚基的主峰。实施例4 :嵌合杯状病毒VLP的表征为了确保嵌合杯状病毒VPl亚基的合适的蛋白质表达和VLP形成，使用多种分析方法以贯穿整个生成过程进行表征，包括SDS-PAGE、Western印迹分析、高分辨率率质谱术、大小排阻层析和电子显微术。SDS-PAGE和Western印迹分析的使用在实施例3中突出显不，其中这些方法表明嵌合诺瓦克VLP的合适的亚基分子量和外来抗原的存在。诺如病毒VLP的高分子量(大于IOMDa)容许通过大小排阻层析的直接分析，即使在粗制纯化起始材料中。图11中表明此方法用于评估VLP形成的效用，其中通过大小排阻层析分析诺瓦克VPl-HA嵌合物(336插入)的条件化培养基。在此研究中，具有预期保留时间(约8分钟)的峰的存在表明嵌合VLP的适当形成(红色迹线_220nm吸收(Y轴上显示)和蓝色迹线-280nm吸收)。 另外，通过电子显微术确认了合并的连续流动离心级分中VLP的适当形成(见实施例3)，其表明含有在VPl残基336后插入的或替换VPl残基337-341的模式HA表位的嵌合诺瓦克VLP的约32nm的预期颗粒(图12)。实施例5 :嵌合杯状病毒VLP的按比例放大生物反应器生产和下游加工使用Wave生物反应器平台和一次性可丢弃Wavebag作为生物反应器容器实施嵌合VLP的初始按比例放大生物反应器生产。这些研究聚焦于基本參数,包括感染前的细胞密度、感染复数、和收获前的感染时间的优化。初始优化还包括筛选多种昆虫细胞系/培养基组合和培养基补充物。这些研究用来开发可调整规模的生产策略和为下游加工供应材料两者。使用Wave生物反应器系统和多种昆虫细胞/无血清培养基组合，已经对诺如病毒VLP常规地观察到范围为大于50mg/L的生物反应器生产力。通过完善建立的且可调整规模的方法，包括常规层析、膜层析、和正切流动过滤实施对来自收获的生物反应器培养物的嵌合VLP的下游加工。对于层析筛选，小规模进行初始的试验性研究以优化结合/洗脱条件，评估流速的影响，估计步骤回收，并且就宿主细胞蛋白质/核酸表征纯化因子。实施例6 :用于呈递外来表位的其它方法如实施例I中概述的，插入外来表位的优选位点基于通过评估杯状病毒VPl原子结构模型鉴定溶剂可及的P2域表面环。作为鉴定表位插入的最佳位置的互补(complimentary)方法,将上述结构分析与氨基酸序列和生物化学数据组合以帮助鉴定允许的位点。在多重比对中使用氨基酸序列数据以鉴定落入通过结构分析鉴定的表面环区内的高变P2域残基。认为通过这两种措施鉴定的位置对于外来表位序列的直接插入是最佳的。类似地，认为具有落入通过结构分析鉴定的単一暴露于表面的环内的多个高变P2残基的位置对于VPl残基的部分替换是最佳的，并且会在建立VPl删除边界中提供指导。另外，使用生物化学数据(诸如鉴定杯状病毒逃逸突变体和/或抗体表位的P2域残基)用来突出显示适合于插入外来表位的位置。如实施例2-4中概述的，使用9个氨基酸的外来表位插入生成第一代嵌合诺瓦克VLP。为了优化VLP生成和/或外来表位免疫原性，评估各种长度的插入表位序列，包括5-10个残基、11-20个残基、21-30个残基、31-40个残基或41-50个残基的序列。因为杯状病毒残基的删除可以代表外来表位插入的一个至关重要的因素，所以评估各种长度的VPl删除，包括5-10个残基、11-20个残基、21-30个残基、31-40个残基或41-50个残基。嵌合VLP的重组表达可以牵涉将多种外来抗原同时插入杯状病毒P2域的两个或更多个溶剂可及的环中。因为几个鉴定的环以相对紧密的空间接近性存在，所以可以将多个环的插入工程化改造，使得插入序列有直接接触以形成不连续的表位。对于表达嵌合杯状病毒VLP,祀抗原可以源自模拟表位序列或代表不连续表位的复合线性序列。模拟表位序列是以高亲和カ结合中和性抗体，但是不代表存在于靶抗原中的实际氨基酸序列的线性肽。具有此性质的序列源自文献或者通过诸如噬菌体展示分析或组合肽文库等方法对中和性抗体进行表位定位来确定。代表不连续表位的复合线性序列可以类似地源自文献、组合方法或对抗体抗原复合物的结构分析。 为了增强嵌合VLP生成的效率，平台可以设计为在结构上限制外来表位序列的构象空间以更好地符合杯状病毒VPl表面环边界。通过将共价或非共价蛋白质-蛋白质相互作用基序工程化改造入VPl亚基的暴露于表面的环或外来抗原序列中实施此目的。上文所概述的方法的变型牵涉生成嵌合VLP，其中仅VPl亚基的亚部分(subfraction)在P2域的溶剂可及的环上展现出外来表位。此策略可以证明对于维持期望的VLP装配是至关重要的，特别在将相对较大的外来表位插入VPl亚基中的情况中。为了生成此性质的VLP，最初以适合于VLP装配的高度纯化的状态(即，完全变性的単体、含有类天然ニ级/三级结构的単体、或低级VPl装配状态)生成各杯状病毒VPl亚基(天然的和经修饰的两者)。然后，通过以期望的比率混合天然的和经修饰的亚基，并建立促进有效VLP装配的条件来生成嵌合VLP。或者，通过生成由两种不同启动子调节天然的和经修饰的亚基表达的构建体在培养物中直接生成具有此性质的VLP。使用此方法，将天然的VPl亚基放置在相对较强的启动子下以驱动超过经修饰亚基的表达水平的表达水平。在细胞中发生嵌合VLP的装配，其中经修饰的VPl亚基展示于VLP表面的亚部分中。可以创建更通用的展示平台的别的变型牵涉生成含有靶序列的诺如病毒VLP，所述靶序列促进期望的外来抗原(例如，含有互补结合基序)对溶剂可及的P2域表面的特异性高亲和カ结合。为了生成此性质的嵌合VLP，将诺如病毒亚基和靶抗原分开表达并纯化，然后在容许结合的条件下混合。使用此方法，将靶抗原结合至完全装配好的VLP上的VPl亚基或在VLP装配前结合至VPl亚基。为了评估提供最佳的VLP稳定性和抗原呈递的条件，通过在VPl亚基的每个拷贝或仅在某个亚组上表达靶序列生成嵌合VLP。实施例7 :用嵌合诺瓦克VLP免疫小鼠雌性C57/BL6小鼠(约10-12周龄)用30 y g天然诺瓦克VLP或实施例3中所描述的嵌合诺瓦克VLP之一(例如，诺瓦克VPl的296、336、362、383或399残基后插入的HA表位或用HA表位替换诺瓦克VPl残基337-341或残基362-366)腹膜内免疫。在免疫后第21天对小鼠放血，并在抗原特异性ELISA中測定血清以测定天然的和嵌合的诺瓦克VLP的抗体滴度。结果显示嵌合VLP在抗诺瓦克和抗HA抗体两者上生成显著的滴度。实施例8 :含有29个残基的医学相关外来抗原的嵌合杯状病毒VLP的生成、表征和免疫原性为了生成含有较大的医学相关外来抗原的嵌合诺如病毒VLP，将源自呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白的29个氨基酸的序列(RSV F表位序列-YMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNV (SEQ ID NO: 7)，其由中和性抗体Synagis识别)在诺瓦克VPl残基308、338、或363后直接插入。另外，生成如下的构建体，其含有替换诺瓦克VPl残基307-311、337-341或残基362-366的RSV F表位。在生成重组杆状病毒和Sf9昆虫细胞中VLP生成后，将嵌合VLP纯化，表征并检查免疫原性。图13显示通过连续流动离心(CFC)纯化嵌合诺瓦克VLP(308插入)，其中通过使用TCF-32转子以100，OOOx g离心约16小时在0-60%线性蔗糖梯度上分离了纯化起始材料。此分析表明起始条件化培养基(CM)中嵌合VLP的生成和对病毒样颗粒预期的蔗糖密度处显带的嵌合VPl亚基的主峰。通过透射电子显微术确认通过连续流动离心纯化的材料中的VLP形成(图14)。为了评估免疫原性，将CFC纯化的嵌合VLP以200 u g/mL在20mM组氨酸(pH_6. 5)、150mM NaCl中配制。在研究第0天用20 y g嵌合VLP (约I ii gRSV表位)免疫6只Balb/c小鼠，并在研究第21天用额外的20 y g嵌合VLP加强。在研究第35天收集血液，并使用RSV-F和诺瓦克蛋白特异性ELISA两者分析总体IgG滴度。在此研究中，以嵌合VLP给药的6只动物中的2只还显示了大于4倍的抗RSV-FIgG增加(图15)。实施例9 :含有多个经修饰的表面环的嵌合杯状病毒VLP的生成 为了生成含有多个经修饰的环的嵌合诺如病毒VLP JfRSV F蛋白的9个氨基酸的序列(RSV F表位序列-LINDMPITN(SEQ ID NO: 6))添加至同一构建体内的两个诺瓦克VPl表面环。在这些研究中，生成如下的构建体，其含有同时在残基338和363处插入的，或者同时替换337-341并在残基363处插入的RSV F表位。图16中显示的SDS-PAGE分析描绘了来自含有9个残基的RSV-F抗原的嵌合诺瓦克VLP的表达研究的结果(第I道，分子量标准品；第2道，338和363插入离心后上清液；第3道，338和363插入离心沉淀级分 ’第4道，338和363插入插入滤液；第5道，337-341替换和363插入离心后上清液；第6道，337-341替换和363插入离心沉淀级分；和第7道，337-341替换和363插入滤液)。每种嵌合物的离心后上清液(第2道和第5道)和滤液(第4道和第7道)级分中以预期的分子量(约57kDa)迁移的主要诺瓦克VPl条带展示与天然诺瓦克VPl相似的表达样式，而且表明此溶剂可及的P2环有效耐受外来抗原插入的能力。对于这些嵌合物，通过SEC数据指示了颗粒形成，并且这些研究支持实施例6中概述的概念。实施例10 :含有血凝素表位的嵌合杯状病毒VLP的免疫原性。将源自流行性感冒血凝素抗原的模式表位(HA表位序列-YPYDVPDYA (SEQ IDNO: 5))在VPl上的诺瓦克VPl残基氨基酸338-339间直接插入，并且在本文中称为“HA插入”。生成别的构建体，其中用HA表位替换VPl中诺瓦克VPl残基氨基酸337-341，并且在本文中称为“HA替换”。在免疫前对每种构建体测定总蛋白质含量。“HA插入”构建体測定为含有34ii g/ml总蛋白质，而“HA替换”构建体测定为含有42ii g/ml总蛋白质。将50微升自每管取出，并在第0天和第7天在小鼠中腹膜内注射。在第14天收集血清，但是通过ELISA未能检出可测量的抗原特异性IgG。然而，可以在几乎所有小鼠中检出低水平的HA特异性IgM(图17)。因为嵌合VLP的HA含量仅占总蛋白质的I. 7%，所以仅IgM响应的可能原因是低HA浓度(对于“HA插入”为29ng HA，而对于“HA替换”为36ng HA)。为了确定佐剂的存在是否会增强对HA的免疫应答，在第37天时对先前处理的小鼠给予吸附到AlOH/MPL上的嵌合VLP。在第64天时收集血清，并对其分析HA特异性IgG(图18)。佐剂的添加导致具有可检测的HA特异性IgG应答的用“HA插入”免疫的5只小鼠中的4只和用“HA替换”免疫的5只小鼠中的2只。此研究中的所有小鼠生成了与历史数值相似的诺瓦克特异性IgG。总之，HA表位对免疫系统呈递并且是免疫系统可见的。在此研究中使用的HA抗原的低浓度下，可以使用佐剂来提高免疫应答。或者，増加HA表位的量会提高免疫应答。本发明在范围上不受所描述的具体实施方案的限制，所描述的具体实施方案意欲作为本发明各方面的単一例示，而且功能上等同的方法和成分在本发明的范围内。实际上，根据上述描述和附图，仅使用常规实验，在本文所显示的和所描述的那些之外，对本发明的各种修饰对于本领域技术人员而言即会变得显而易见。此类修饰和等同方案意欲落在所附权利要求的范围内。通过提述将本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请并入本说明书，其程度就如具体并单独指明通过提述将每ー篇单独的出版物、专利或专利申请并入本文一祥。本文中对參考文献的引用或讨论不应解释为承认其为本发明的现有技木。·
权利要求
1.一种嵌合蛋白，其包含具有P2域的杯状病毒衣壳蛋白和至少一种异源抗原或其片段，其中所述至少一种异源抗原或其片段插入所述衣壳蛋白的所述P2域中，且其中所述嵌合蛋白能够在宿王细胞中表达时形成病毒样颗粒。
2.权利要求I的嵌合蛋白，其中所述至少一种异源抗原或其片段插入所述P2域的至少一个暴露于溶剂的环中。
3.权利要求2的嵌合蛋白，其中所述至少一种异源抗原或其片段替换所述衣壳蛋白的至少一个氨基酸。
4.权利要求3的嵌合蛋白，其中所述至少一种异源抗原或其片段替换所述衣壳蛋白的约2至约50个氨基酸。
5.权利要求4的嵌合蛋白，其中所述至少一种异源抗原或其片段替换所述衣壳蛋白的约4至约20个氨基酸。
6.权利要求5的嵌合蛋白，其中所述至少一种异源抗原或其片段替换所述衣壳蛋白的约5个氨基酸。
7.权利要求I的嵌合蛋白，其中所述杯状病毒是诺如病毒。
8.权利要求7的嵌合蛋白，其中所述衣壳蛋白是VP1。
9.权利要求8的嵌合蛋白，其中所述衣壳蛋白具有SEQID NO:l的氨基酸序列。
10.权利要求9的嵌合蛋白，其中所述至少一种异源抗原或其片段直接插入SEQIDNO: I中在第295位天冬酰胺残基、第296位甘氨酸残基、第308位脯氨酸残基、第336位甘氨酸残基、第338位丝氨酸残基、第362位天冬酰胺残基、第363位甘氨酸残基、第382位脯氨酸残基、第383位丝氨酸残基、第399位异亮氨酸残基、或第402位丙氨酸残基后。
11.权利要求9的嵌合蛋白，其中所述至少一种异源抗原或其片段替换SEQID NO: I的氛基酸294-298、氛基酸307-311、氛基酸337-341、氛基酸362-366、氛基酸381-385或氛基酸 401-405。
12.权利要求7的嵌合蛋白，其中所述衣壳蛋白是源自两种或更多种诺如病毒流行株的复合衣壳蛋白。
13.权利要求12的嵌合蛋白，其中所述复合衣壳蛋白具有SEQID NO:2的氨基酸序列。
14.权利要求7的嵌合蛋白，其中所述诺如病毒是基因群I或基因群II诺如病毒。
15.权利要求14的嵌合蛋白，其中所述诺如病毒是基因群I、基因型I诺如病毒或基因群II、基因型4诺如病毒。
16.权利要求I的嵌合蛋白，其中所述至少一种异源抗原或其片段的长度是约5至约70个氨基酸。
17.权利要求16的嵌合蛋白，其中所述至少一种异源抗原或其片段包含抗原性表位。
18.权利要求I的嵌合蛋白，其中所述至少一种异源抗原或其片段源自病毒、细菌、真核病原体、肿瘤关联抗原、或变应原。
19.权利要求18的嵌合蛋白，其中所述至少一种异源抗原或其片段源自选自下组的病毒轮状病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒和偏肺病毒。
20.一种病毒样颗粒，其包含权利要求I的嵌合蛋白。
21.一种疫苗配制剂，其包含权利要求20的病毒样颗粒。
22.权利要求21的疫苗配制剂，其进一步包含佐剂。
23.—种编码权利要求I的嵌合蛋白的分离的核酸。
24.—种包含权利要求23的分离的核酸的载体。
25.—种包含权利要求24的载体的宿主细胞。
26.权利要求25的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞、昆虫细胞、酵母细胞、或哺乳动物细胞。
27.—种生成嵌合病毒样颗粒的方法,包括 在宿主细胞中表达权利要求I的嵌合蛋白；并 在形成病毒样颗粒的条件中培养所述宿主细胞。
28.权利要求27的方法，其中所述至少一种异源抗原或其片段与所述P2域的至少一个暴露于溶剂的环融合。
29.权利要求28的方法，其中所述至少一种异源抗原或其片段替换所述衣壳蛋白的至少一个氨基酸。
30.权利要求29的方法，其中所述至少一种异源抗原或其片段替换所述衣壳蛋白的I-约50个氨基酸。
31.权利要求30的方法，其中所述至少一种异源抗原或其片段替换所述衣壳蛋白的约4-约20个氨基酸。
32.权利要求31的方法，其中所述至少一种异源抗原或其片段替换所述衣壳蛋白的约5个氨基酸。
33.权利要求27的方法，其中所述至少一种异源抗原或其片段的长度是约5至约70个氨基酸。
34.权利要求33的方法，其中所述至少一种异源抗原或其片段包含抗原性表位。
35.权利要求27的方法，其中所述杯状病毒是诺如病毒。
36.权利要求35的方法，其中所述诺如病毒是基因群I或基因群II诺如病毒。
37.权利要求36的方法，其中所述诺如病毒是基因群I、基因型I诺如病毒或基因群II、基因型4诺如病毒。
38.一种诱导对外来作用剂的免疫应答的方法，包括对受试者施用权利要求21的疫苗配制剂，其中所述至少一种异源抗原或其片段源自来自所述外来作用剂的蛋白质。
全文摘要
本发明提供了包含杯状病毒衣壳蛋白和一种或多种异源抗原序列的颗粒形成性嵌合蛋白。具体而言，本发明公开了工程化杯状病毒衣壳蛋白序列，其含有在内部位置处融合的异源表位，使得经修饰的衣壳蛋白保留在宿主细胞中表达时形成病毒样颗粒的能力。还描述了包含嵌合蛋白的病毒样颗粒和疫苗配制剂。
文档编号A61K39/125GK102791286SQ201180013873
公开日2012年11月21日 申请日期2011年1月21日 优先权日2010年1月21日
发明者B.斯特德曼, R.泰勒 申请人:莱戈赛特医药股份有限公司