S100a4抗体及其治疗用途的制作方法

专利名称：S100a4抗体及其治疗用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子免疫学和人类疾病的处理。特别地，其涉及针对人S100A4的抗体，包含这些抗体的药物组合物，及其治疗和预防用途。
背景技术：
癌症是人类恶性肿瘤的最常见类型，癌症的致死性主要是由原发性肿瘤细胞向远端的扩散及随后的转移形成而导致。已经通过数种途径证实了转移诱导的S100A4蛋白在肿瘤发生进行、血管发生和转移扩散中的因果关系，该S100A4蛋白是钙结合蛋白的SlOO家族的成员。S100A4在肿瘤细胞和其基质(包括成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌、炎症和神经细胞)之间发生的肿瘤-基质交叉干扰中扮演关键角色，所述的肿瘤细胞和其基质之间发生的肿瘤-基质交叉干扰主要由直接的细胞-细胞接触或自分泌/旁分泌细胞因子和生长因子信号传导介导的。例如，上皮细胞生长因子，肿瘤生长因子-β 1，和成纤维细胞生长因子-2都能够刺激 S100A4 的表达(Strutz et al.Kidney Int.2002; 61 (5):1714-1728) (Strutz等，《国际肾脏》2002;61 (5): 1714-1728);肿瘤或基质细胞向肿瘤环境释放的S100A4引发在月中瘤细胞中的转移前级联(Grum-Schwensen et al.Cancer Res.2005; 65 (9): 3772-3780)(Grum-Schwensen等，《癌症研究》2005; 65 (9):3772-3780);肿瘤细胞或肿瘤相关成纤维细胞，与正常成纤维细胞相比，表达高水平的S100A4 (Ambartsumian et al.0ncogene.1996;13 (8): 1621-1630) (Ambartsumian 等，《致癌基因》1996; 13 (8): 1621-1630);其它宿主源的肿瘤基质细胞，例如淋巴细胞和巨噬细胞，活化后增加S100A4表达(Grigorian et al.Electrophoresis.1994; 15 (3-4):463-468) Grigorian 等，《电泳》1994; 15 (3-4):463-468)。S100A4也作 为促血管生成因子通过刺激和重建细胞外基质(降解酶的生产)和上皮细胞的移动性而影响肿瘤的血管生成(Schmidt-Hansen et al.J.Biol.Chem.2004; 279 (23):24498-24504) (Schmidt-Hansen 等，《生物化学杂志》2004;279(23):24498-24504)。S100A4基因自身最初是作为在高度转移的小鼠乳腺癌中差异表达的基因被分离的(Ebralidze et al.Genes Dev.1989; 3 (7): 1086-1093) (Ebralidze 等《基因发展》1989; 3 (7): 1086-1093)。也已证明S100A4基因引入非转移性肿瘤细胞系以及其在转移细胞系中的基因抑制改变了这些细胞的发生肿瘤和转移的命运，从而证实了其与肿瘤进行和转移形成的相关性(Lloyd et al.0ncogene.1998; 17 (4): 465-473) (Lloyd 等,《致癌基因》1998;17(4):465-473)。临床上，S100A4表达的高水平与癌症患者的差预后之间的正相关性已经在以下癌症中得到证实:乳腺癌(Rudland PS et al.Cancer Res2000.60 (6): 1595-1603)(Rudland PS 等，《癌症研究》2000.60 (6): 1595-1603)，前列腺癌(Saleem M etal.PNAS2006.103(40):14825-30) (Saleem M 等，((PNAS)) 2006.103(40): 14825-30)，肺癌(Tsuna M et al.Anticancer Res2009.29(7):2547-54) (Tsuna M 等，《抗癌研究》2009.29(7):2547-54)，结肠癌(Cho Yet al.World J Gastroent2005.11(31):4852-6)(Cho Y 等，《世界肠胃炎杂志》2005.11(31):4852-6),胰腺癌(Rosty C et al.Am JPathol2002.160(1):45-50) (Rosty C 等，《美国病理学杂志》2002.160 (I):45-50)，肾癌(Bandiera Aet al.World J Surg2009.33 (7): 1414-20) (Bandiera A 等，《世界外科杂志》2009.33(7): 1414-20)，胃癌(Yonemura Y et al.Clin CancerRes2000.6(11):4234-42) (Yonemura Y 等，《临床癌症研究》2000.6(11):4234-42)，卵巢癌(Maelandsmo GM et al.Tumor Biol2009.30 (I): 15-25) (Maelandsmo GM 等，《肿瘤生物学》2009.30(1): 15-25)，乳头状甲状腺癌(Min HS et al.Mod Pathol2008.21 (6): 748-55)(Min HS 等，《现代病理学》2008.21(6): 748-55)，黑素瘤(Andersen K et al.ModPathol2004.17(8):990-997) (Andersen K 等，《现代病理学》2004.17(8):990-997),肝细胞性肝癌(Cui J et al.J Can Res Clin0ncol2004.130(10):615-22) (Cui J 等，《癌症研究与临床肿瘤学杂志》2004.130(10):615-22)，膀胱癌(Agerbaek M et al.EurUro12006.50(4):777-785) (Agerbaek M 等，《欧洲泌尿学》2006.50(4): 777-785)，脂肪肉瘤浸润性癌(Pazzaglia L et al.Anticancer Res2004.24 (2B): 967-972) (PazzagliaL 等，《抗癌研究》2004.24 (2B):967-972),成神经细胞瘤(Bjornland K et al.J PediatrSurg2001.36(7): 1 040-44) (Bjornland K 等，《儿科外科杂志》2001.36(7): 1040-44)，食管鱗状细胞癌(Ninomiya I et al.1nt J 0ncol2001.18 (4): 715-20) (NinomiyaI等，《国际肿瘤学杂志》2001.18(4):715-20)，骨肉瘤(Mathisen B et al.ClinExpMetastasis2003.20(8):701_ll)(Mathisen B 等，《临床与实验转移》2003.20(8):701-11)，胆囊癌(Nakamura T et al.1nt J 0ncol2002.20(5):937-41) (Nakamura T 等，《国际肿瘤学杂志》2002.20 (5):937-41), 口腔鳞状细胞癌(Moriyama-Kita M et al.0ral0ncol2004.40(5):496-500) (Moriyama-Kita M 等，《口腔肿瘤学》2004.40(5):496-500)，子宫内膜癌(Xie R et al.Lab Invest2009.89(8):937-947) (Xie R 等，《实验室投资》2009.89(8):937-947),和成神经管细胞瘤(Hernan R et al.CancerRes2003.63 (I): 140-148) (Hernan R 等，《癌症研究》2003.63 (I): 140-148)等等。多个研究小组已经证实S100A4在多种非恶性病理学状态中的关联，特别是，在病理学例如自体免疫炎症和心血管、神经和肺系统的紊乱(Grigorian Metal.Current Molecular Medicine2008.8(6):492-6) (Grigorian M 等，《当今分子医学》2008.8(6):492-6)ο因此S100A4是临床应用的备选靶标。然而，由于S100A4的生物功能的复杂性和其未知的完整的作用机理，尚不存在封闭该蛋白的细胞内或细胞外功能的抑制剂。基于抗体的疗法作为多种疾病的有效治疗的主要部分已经出现。在上个十年，单克隆抗体已经成为在恶性和非恶性疾病的处理中的主要治疗试剂。 迄今为止，针对S100A4引起的单克隆和多克隆抗体已经由不同的公司和研究小组所提供(Zhang et al, Calcium Binding Proteins2006.1:4, 219-223 (Zhang 等，《.丐结合蛋白》2006.1:4, 219-223);来自德国抗体在线GmbH的ABIN167355和ABIN171123 ;来自丹麦DakoCytomation的A5114 ;等等)。尽管科学和专利研究推测了这些抗体的治疗性应用，据发明人所知，尚没有公开的证据表明该领域现有的抗体已经实际地解决了治疗癌症和非恶性疾病的难题。W02000064475 (Research Corporation Technologies, Inc.)公开了诊断恶性癌症的方法(i)通过使用针对mts-1蛋白的抗体(抗体可以缀合至毒素)抑制mts-1蛋白或
(ii)通过提供编码反义mts-Ι核苷酸序列的核酸。
因此，本领域目前需要提供新的治疗途径用以治疗癌症，特别是治疗血管生成和转移，靶向于S100A4蛋白。另外，在诊断水平上，S100A4被认为是正常细胞向肿瘤细胞的分化过程的良好标记，并且因此其成为肿瘤的细胞生物学检查的良好生物标记。然而，在肿瘤组织中检测S100A4的表达显示出需要患者活组织检查的缺陷。因此，本领域目前需要提供更简单和更少创伤性的方法以用于通过检测对象中S100A4的水平的途径而进行癌症的临床诊断。

发明内容
在第一方面，本发明涉及具有抗血管生成活性的特异性抗-S100A4抗体或其基本上保留了所述抗体的抗血管生成活性的片段，其中的抗体选自下述抗体组:(i)识别包含序列ELPSFLGKRT (SEQ ID N0:3)的S100A4的表位的抗体，(ii)识别包含序列EGFPDKQPRKK (SEQ ID NO:24)的S100A4的表位的抗体，和(iii)由杂交瘤ECACC11051804产生的抗体。在另一个方面，本发明涉及杂交瘤细胞系，其选自保藏编号为ECACC10022401，ECACCl 1051801，ECACCl 1051802，ECACCl 1051803 和 ECACCl 1051804 的保藏细胞系组。在另一个方面，本发明涉及包含药物组合物，其包含药学上有效量的如本发明所述的至少一种抗体或其片段和至少一种药学上可接受的载体。在另外一个方面，本发明涉及如本发明所述的抗体或其片段用于预防和/或治疗选自转移性疾病和与不期望的血管生成相关的疾病。在另一方面，本发明涉及缀合物，其包含如本发明所述的抗体或其片段和第二组分，所述第二组分选以下组:(a)抗血管生成试剂(b)抗转移试剂(C)细胞毒素剂(d)抗炎症试剂以及其在预防和/或治疗疾病的用途，所述疾病选自转移瘤、与不期望的血管生成相关的疾病和与发炎相关的疾病组。在另一个方面，本发明涉及获取如本发明所述的抗体的方法，其包含在可以产生所述抗体的条件下培养选自以保藏编号为ECACC10022401，ECACCl 1051801，ECACC11051802, ECACCl 1051803和ECACC11051804保藏的细胞系的杂交瘤细胞系。在另外的方面，本发明涉及包含特异性抗S100A4抗体和抗代谢物的组合物以及其在预防和/或治疗癌症或转移瘤中的用途。在另一个方面，本发明涉及特异性结合S100A4蛋白的抗体或其能够结合抗原的片段在制备用于预防和/或治疗与炎症相关的疾病的药物中的用途。还在另外一个方面，本发明涉及在对象中诊断癌症或与炎症相关的疾病的体外方法，其包含:(a)检测所述对象的生物流体中S100A4蛋白或其变体的水平，其是通过利用选自ECACC10022401，ECACCl 1051801，ECACCl 1051802，ECACCl 1051803 和 ECACCl 1051804 的杂交瘤组的杂交瘤产生的单克隆抗体或所述抗体的功能性变体实现的(b)将所述水平与对照值比较其中，相对于对照值，S100A4蛋白或其变体的水平的增加表示该对象患有癌症或与炎症相关的疾病。在另外一个方面，本发明涉及在样品中检测S100A4的方法，其包含:(i)将怀疑含有S100A4的样品与本发明定义的特异性抗S100A4抗体或其片段接触(ii)检测S100A4和抗体或其片段之间形成的免疫复合物其中检测到S100A4和抗体之间的免疫复合物表示在样品中的存在S100A4。在另一个方面，本发明涉及在生物流体中诊断癌症或与炎症相关的疾病的试剂盒，其包含至少一种如本发明所述的抗体或其片段。在另一个方面，本发明涉及为诊断患有癌症的对象设计定制疗法的体外方法，其包含在用相同的单 克隆抗体的疗法之前或之后，检测所述对象的生物流体样品中S100A4蛋白或其变体的水平，所述检测是通过利用选自ECACC10022401，ECACCl 1051801，ECACCl 1051802,ECACCl 1051803和ECACCl 1051804的杂交瘤组的杂交瘤产生的单克隆抗体或所述抗体的功能性变体实现的，其中相对于S100A4或其变体的水平，疗法之后S100A4蛋白或其变体的水平的增加表示该患者需要原来施加的疗法之外的可选疗法。本发明的一个目的是提供特异性结合人或鼠类S100A4而不结合其它SlOO家族蛋白的抗体。本发明的一个目的是提供敏感地结合人或鼠类S100A4的抗体，其检测限为纳克
甚至皮克。本发明的一个重要目的是提供针对S100A4的治疗性抗体，其具有证实的针对恶性和非恶性疾病的活性。本发明的一个重要目的是提供针对S100A4的治疗性抗体，其具有证实的针对恶性和非恶性疾病的体内活性，而在其在体内发挥效果之前不被代谢或降解。本发明的一个重要目的是提供针对S100A4的治疗性抗体，其具有证实的针对恶性或非恶性疾病的活性，而影响最小或没有毒性作用。本发明的一个目的是提供针对S100A4的抗体，其抑制肿瘤生长。本发明的一个目的是提供针对S100A4的抗体，其抑制肿瘤发展。本发明的一个目的是提供针对S100A4的抗体，其抑制血管生成和肿瘤血管生成。本发明的一个目的是提供针对S100A4的抗体，其抑制上皮细胞转移。本发明的一个目的是提供针对S100A4的抗体，其抑制癌症干细胞。本发明的一个目的是提供针对S100A4的抗体，其抑制炎症性过程。


图1.通过蛋白质印迹分析测定的S100A4蛋白的表达。(A)在来自不同来源的肿瘤细胞系和小鼠胚细胞成纤维细胞系NIH3T3的总提取物中，S100A4表达水平。(B)在来自源于HCT116，MiaPACA-2和PxPC3异种移植模型的肿瘤的总提取物中，S100A4表达水平。(C)在来自肿瘤细胞系MDA-MB-231和源自这些细胞系的癌症干细胞的总提取物中，S100A4表达水平。图2.S100A4表达的免疫组织化学分析。S100A4表达和分布的比较性免疫组织化学分析，在源自两个胰腺癌细胞系Panel和BxPC3的肿瘤中，在5C3和最常引用的针对S100A4的兔多克隆抗体(Dako)之间用于组织学分析。图像(A-D)在放大率X40下获得。图像(E-H)在放大率X120下获得。(A)该案例显示了在源自BxPC3细胞系异种移植模型的样品中，在浸润性前部中相比在肿瘤的中心S100A4有更强的表达，以小鼠单克隆抗体5C3染色。(B)该案例显示了该案例显示了在源自BxPC3细胞系异种移植模型的样品中，在浸润性前部中相比在肿瘤的中心S100A4具有更强的表达，以来自Dako的兔多克隆抗体染色。(C)在源自BxPC3细胞系异种移植模型的肿瘤中，用不相关的小鼠单克隆抗体染色作为阴性对照。(D)在源自BxPC3细胞系异种移植模型的肿瘤中，不用初级抗体染色的阴性对照。(E)在源自Panc-1细胞系的异种移植模型的肿瘤的细胞质和细胞核中的S100A4的强烈表达，以小鼠单克隆抗体5C3染色。(F)在源自Panc-1细胞系的异种移植模型的肿瘤的细胞质和细胞核中的S100A4的强烈表达，以来自Dako的兔多克隆抗体染色。(G)在源自Panc-1细胞系异种移植模型的肿瘤中用不相关的小鼠单克隆抗体抗多组氨酸染色作为阴性对照。(H)在源自Panc-1细胞系异种移植模型的肿瘤样品中，不用初级抗体染色的阴性对照。图3.5C3使S100A4诱导的MMP9蛋白水解活性失效。在HUVEC条件培养基中MMP的蛋白水解活性。以不同的刺激处理HUVEC24小时。离心上清液以消除碎片并进行明胶酶谱分析。较清晰的条带代表MMP9和MMP2活性。(A)S100A4以剂量依赖性方式增加了 MMP9的活性形式的分泌。(B)单克隆抗体5C3使由重组S100A4蛋白诱导的MMP9的活性形式的产生失效。图4.在HUVEC转移中，数种针对S100A4的单克隆抗体的抑制效果。在转移诱导之前，抗体用 S100A4 蛋白在 37°C下孵育 2 小时。HUVEC 用 S100A4 (I μ M)、VEGF (3ng/ml)、另加S100A4的VEGF的组合或这些蛋白与抗体(5C3，1E2，8B6，6B9，5A3，5H4)的组合处理24小时。(A)细胞用5C3 (0.25，0.5，1，2，和4μΜ)和5H4 (4μΜ)处理24小时。每个数据点用代表100%转移的阳性 对照(左侧棒)校准。阳性对照对应于以EBM加补充物(EGM)和FCS (完全培养基)孵育的细胞。(B)细胞用5C3，1E2，8B6，6B9，5A3 (2 μ Μ)处理24小时。每个数据点用代表100%转移的VEGF加S100A4诱导的转移校准。数据棒图显示了平均值土 s_d。**ρ〈0.005 (“曼-惠特尼 U 检验(Mann-Whitney U 检验)”)。图5.在人胰腺(MiaPACA-2)肿瘤中5C3抗体的抗肿瘤活性。在第O天，雌性无胸腺裸小鼠以0.1ml不含补充物的培养基皮下灌输5x106MiaPACA-2至小鼠的右上肋腹部。当肿瘤达到MiaPACA-2细胞65-160mm3，开始处理。处理组由10只动物。PBS (阴性对照)或5C3 (25mg/kg)在一周内(1010100)腹膜内给予3次。最后制剂缓冲液作为载体对照给予。肿瘤大小每周测量3次，肿瘤体积根据以下公式计算:肿瘤大小=宽度2.长度/2。实验末尾(MiaPACA-2细胞的第30天)，承受肿瘤的小鼠被处死并移除和称重肿瘤。(A，B)MiaPACA_2实验的结果。相对肿瘤体积和肿瘤质量的图表显示为平均值土s-d ns p>0.05，*p〈0.05，***ρ〈0.001 (“Mann-Whitney U 检验，，)。图6.裸小鼠中单克隆抗体5C3的剂量时间表。图7.肿瘤微脉管系统的量化。来自MiaPACA-2肿瘤的微脉管系统(鼠⑶31单克隆抗体)的免疫组织学分析。脉管系统的水平在实验结束(第30天)测量，比较PBS对照组和用单克隆抗体5C3处理的动物。(A)在确定的肿瘤区域的脉管密度(MVD)，以每mm2的脉管剖面(V.P.)的平均值表达。(B)在肿瘤中的导管区域(Aa)的量化。量化通过每个切片的8和39图之间的分析而得出，基于X120放大率的肿瘤大小。图像用NIH ImageJ成像软件分析。图表显示为平均值土 sd*p〈0.05 (“Mann-Whitney U检验”)。图8.单克隆抗体5C3显示了体内非毒性效果。在第O天，雌性无胸腺裸小鼠以0.1ml不含补充物的培养基皮下灌输5x106MiaPACA-2细胞或1x106HCT116细胞至小鼠的右上肋腹部。当肿瘤达到MiaPACA-2的65_160mm3或HCT116细胞的155_370mm3，开始处理。MiaPACA-2或HCT116细胞的处理组分别有10只或7只动物。PBS(阴性对照)或5C3(25mg/kg)在一周内(1010100)腹膜内给予3次。最后制剂缓冲液作为载体对照给予。体重随着实验每周测量3次。体重的图表显示为平均值土sd。图9.S100A4的血浆水平的测定。在无胸腺小鼠中多个异种移植模型上(MiaPACA-2, HCTl 16，MDAMB-231, Colo205) S100A4蛋白的血浆水平相比于无肿瘤的动物中(Basal-02) S100A4 水平通过夹心 ELISA 方法来测定。MiaPACA_2+5C3 和 HCT116+5C3 条件展示了血浆中S100A4的水平，不结合5C3单克隆抗体。血浆水平在实验结束进行测量。血浆水平的图表显示为平均值土sd。图10.吉西他宾(Gemcitabine)与单克隆抗体5C3结合在细胞生存中的协同效果。吉西他宾单独或与单克隆抗体5C3结合在细胞生存中的效果通过氨基己糖苷酶活性来测量。吉西他宾的细胞毒性剂量响应效果通过组单克隆抗体5C3的组合而得到协同性改善。MiaPACA-2细胞用化学治疗药物以不同剂量孵育，具有或不具有5C3，在40nM或IOOnM的恒定浓度下，持续72小时。生存能力没有化合物(吉西他宾或5C3)的细胞的阳性对照校准，该阳性对照代表100%的生存。图11.单克隆抗 体5C3对THP-1单核细胞中S100A4诱导的IL-8释放的抑制影响。(A)孵育24小时后S100A4对由THP-1单核细胞分泌的IL-8的剂量响应，对比LPS诱导的分泌(阳性对照)。(B) 5C3的效果，对于用S100A4以3 μ M处理24小时的THP-1单核细胞中的IL-8释放。细胞总是用抗-小鼠IgG (Fe特异性)处理以避免Fe受体-诱导的IL-8释放。来自上清的IL-8用ELISA分析。数值表示为平均值土sd。
具体实施例方式发明详述本发明的作者发现，出乎意料地，针对S100A4蛋白的单克隆抗体在体外移动性分析中能够中和S100A4诱导的内皮细胞的转移(参见实施例9)并且在异种移植肿瘤模型中中和由S100A4诱导的血管生成能力(参见实施例11)。这些结果表明抗-S100A4抗体可用于预防和/或治疗与不期望的血管生成和转移相关的疾病，例如癌症。本发明提供了针对人和鼠类S100A4蛋白的单克隆抗体，标注为5C3，1E2，6B9，5A3和8B6，其特异性结合并阻断S100A4血管生成活性。发明人令人惊讶地发现这些抗体具有有价值的药学活性，因为它们阻断肿瘤发展、肿瘤血管生成，并且此外在体内没有或具有最小化的毒副作用。有趣的是，发明人进行的工作已经揭示了所述抗体在由S100A4诱导的内皮细胞转移中的作用的新的阻断机理。本发明的作者另外证明了生物流体中S100A4的水平适合于癌症的早期检测的诊断标记。因此，本发明也涉及通过用所述抗体检测患者生物流体中的S100A4水平而诊断癌症的体外方法和试剂盒。本发明抗血管生成抗体在第一方面，本发明涉及具有抗血管生成活性的特异性抗-S100A4抗体或其基本上保留了所述抗体的抗血管生成活性的片段，其中的抗体选自如下抗体组:(i)识别包含序列ELPSFLGKRT (SEQ ID N0:3)的S100A4的表位的抗体，(ii)识别包含序列EGFPDKQPRKK (SEQ ID NO:24)的S100A4的表位的抗体，和(iii)由杂交瘤ECACC11051804产生的抗体。如本文所用的本发明的第一方面，术语“抗体”指这样的单体或多聚体蛋白，其包含至少一个具有结合确定的抗原的能力并且包含免疫球蛋白分子的轻链或重链可变区的全部或部分的多肽。术语抗体包括已知任何类型的抗体，例如，多克隆抗体，单克隆抗体和遗传工程抗体，例如嵌合抗体，人化抗体，灵长目源化抗体，人抗体和双特异性抗体。术语“抗体”的更广泛的定义可以在“定义”部分找到。术语“多克隆抗体”和“单克隆抗体”在“定义”部分进行定义。在具体实施例，抗体是单克隆抗体。“嵌合抗体”理解为用一个物种(通常是哺乳动物，单克隆抗体在其中产生)的抗体可变区和另一个物种(嵌合抗体要用于其中的物种)的恒定区构建的抗体。所述构建的目的是获得这样的抗体，其具 有原始的单克隆抗体但是有更低免疫原性并在要治疗的对象中具有更好耐受性，具有改进的血清半衰期并且可以被免疫学效应器机制所识别，即补体，细胞毒性细胞的Fe受体或其它特异性免疫球蛋白受体，它们表现出物种特异性。在一个优选的实施方式中，嵌合蛋白由鼠类可变区和人恒定区形成。“人源化抗体”被理解为来自非人生物体的抗体，典型地是鼠类抗体，其保留了亲代抗体的抗原结合特性，但是在人类中具有更低的免疫原性。这可以通过不同的方法获得，其包括(a)将完全的非人可变区移植至人恒定区以获得嵌合抗体；(b)将仅仅非人互补决定区(CDR)移植至人框架区和恒定区，保留或不保留关键的框架区残基；和(C)移植完全的非人可变区结构域，但是通过替换表面残基用人类可变区结构域类似的部分“隐藏它们”。“灵长目源抗体”被理解为遗传加工的含有猴抗体(或是其他灵长类)的轻链和重链可变区的重组抗体，特别是食蟹猴抗体，并含有人恒定区的序列，优选人Y I或4免疫球蛋白的恒定区(或PE变异体)。所述抗体的制备描述于Newman et al., Biotechnology,10:1458-1460(1992) (Newman 等，《生物技术》，10:1458-1460 (1992))；和专利文件US5, 658，570和US6，113，898。已经描述了这些抗体显示与人抗体具有高度的同源性，即，85-98%，其具有人效应器功能，具有较低的免疫原性，并能显示对人抗原的高亲和力。产生重组抗体的另一个非常有效的途径描述于Newman, Biotechnology, 10:1455-1460 (1992)(Newman,《生物技术》，10:1455-1460(1992))。“人抗体”理解为完整地含有人轻链和重链以及恒定区的抗体，通过任何已知的标准方法而产生。更广泛的定义可以在“定义”部分发现。术语“双特异性抗体”或“双功能抗体”在“定义”部分定义。
本发明也包含上文提及的抗体的不同类型的片段的用途，其基本上保留了抗体的抗血管生成活性。术语“抗体片段”包括抗体片段例如Fab，F(ab’ )2, Fab’，单链Fv片段(scFv),双元抗体和纳米抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化产生了两种相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，分别具有单独的抗原结合位点，和残留的“Fe”片段，其名称反应了易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生了 F(ab’)2片段，其具有两个抗原结合位点并仍能够与抗原交叉连接。“Fv”是含有完整的抗原结合和抗原识别位点的最小抗体片段。该区域由可变轻链和重链二聚体的可变结构域以强烈的非共价作用而组成。在该构型中每个可变结构域的三个高变区相互作用以确定VH-VL 二聚体表面的抗原结合位点。从整体来看，六个高变区使其具有抗体的抗原-抗体特异性。然而，即使单一的可变区(或Fv的一半，其仅仅包含了三个抗原特异性的高变区)也具有抗原识别和结合能力，尽管具有比完全结合位点更低的亲和力。Fab片段也含有轻链的恒定区和重链的第一恒定区(CHI)。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于在重链的CHl结构域的羧基末端添加了一些残基，包括抗体铰链区的一或多个半胱氨酸。“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域在单一的多肽链中存在。优选地，Fv多肽另外包含VH和VL结构域之间的接头多肽，其使scFv形成抗原结合的期望结构。对于scFv的综述,参见Pluckthun in The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies，vol.113，Rosenburgand Moore eds.，Springer-Verlag, N.Y.，pp.269-315 (1994) (Pluckthun 单克隆抗体药理学，第 113 卷，Rosenburg 和 Moore 编辑，Springer-Verlag, N.Y.，pp.269-315 (1994))。术语“双元抗体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，这些片段包含相同多肽链(VH-VL)内的重链可变区(VH)连接至轻链可变区(VL)。通过利用太短以至于不能使相同链内的两个结构域之间配对的接头，结构域被迫与另一个链的互补结构域配对并建立两个抗原结合位点。双元抗体的进一步细节描述于，例如，文献EP404，097 ;W093/11161 ;和Hollinger et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 90:6444-6448 (1993) (Hollinger 等，《美国科学院院刊》90:6444-6448 (1993))。术语“纳米抗体”指由免疫球蛋白的重链的抗原结合区域(VH片段)独自形成的小尺寸结构(15kDa)。所述纳米抗体主要在免疫骆驼科的动物之后产生，例如骆驼，美洲驼和单峰骆驼，主要是美洲驼；也包括鲨鱼科，其具有天然缺乏轻链并通过重链可变区识别抗原的抗体的特性。然而，来自这些来源的纳米抗体需要人源化过程处理以用于其治疗应用。另一个获得纳米抗体的潜在来源是源自不同人样品的抗体，通过分离可变区的VH和VL结构域。纳米抗体具有的优点例如相对于完全抗体的生产成本下降，更稳定和免疫原性下降。其它抗体片段列在“定义”部分。如本发明所述的抗体具有抗血管生成活性。如本文所用，“具有抗血管生成活性”的表达，是指抗体抑制S100A4诱导的血管生成的能力。抗血管生成活性可以在体外通过测定抗体或其片段阻断S100A4诱导的转 移HUVEC细胞的转移的能力而测定得到，如本申请的实施例9所述，或者在体内通过测定抗体阻断源自植入过表达S100A4的肿瘤细胞的癌症中肿瘤脉管系统的形成而测定得到，如本申请的实施例11所述。根据本发明，如果其阻碍S100A4蛋白的至少100%，至少90%，至少80%，至少70%，至少60%，至少50%，至少40%，至少30%,至少20%，或至少10%的血管生成活性，那么抗-S100A4抗体就认为是抗血管生成的。本发明的第一方面之中包括的抗体片段，其保留了其来源的完整抗体结合S100A4抗原的能力，并且也保留了抑制S100A4蛋白的血管生成活性的功能。术语“保留特异性抗-S100A4蛋白的抗血管生成活性”，如本文所用，指的是抗体片段显示相比完全抗体的基本上的抗血管生成活性。抗血管生成活性可以在体外通过测定抗体或其片段阻断S100A4诱导的转移HUVEC细胞的转移的能力而测定得到，如本申请的实施例9所述，或者在体内通过测定抗体阻断源自植入过表达S100A4的肿瘤细胞的癌症中肿瘤脉管系统的形成而测定得到，如本申请的实施例11所述。肿瘤脉管系统的形成的抑制可以测量为与未使用抗体处理的动物相比微管数目的减少，或者与未使用抗体处理的动物相比微管密度的减小。如果抗体片段显示抗体的至少100%，99%，98%，97%，96%，95%，94%，93%，92%，91%，90%, 85%，80%, 75%，70%, 65%，60%, 55%或50%的活性，那么抗体片段就保留了抗体的抗血管生成活性。本发明中可用的抗体必须是对S100A4蛋白特异性的。术语“特异性”指抗体特异性结合S100A4蛋白而不结合SlOO家族其它蛋白的能力。为了鉴别具有期 望特异性的抗体，可以使用免疫化学分析测定，例如免疫荧光，流式细胞仪，蛋白质印迹和ELISA分析，放射免疫分析，免疫组织化学分析，免疫沉淀或本领域已知的其它免疫化学分析测定。多种竞争性结合或免疫放射分析的方案是本领域已知的。所述免疫分析典型地涉及测量抗体和S100A4蛋白的免疫原之两者的复合物的形成。根据本发明的第一方面的抗体或其片段选自如下抗体组:(i)识别S100A4的包含序列ELPSFLGKRT (SEQ ID N0:3)的表位的抗体，(ii)识别S100A4的包含序列EGFPDKQPRKK (SEQ ID N0:2)的表位的抗体，和(iii)由杂交瘤ECACC11051804产生的抗体。表述“识别S100A4的抗原表位的抗体”表示该抗体能够表现特异性结合该抗原表位而表现基本上不结合到不包含该序列的其它抗原表位。测定抗体是否能够特异性结合抗原表位的合适方法在本发明的实施例14中显示，其中展现靶标蛋白的完整序列的肽针对抗体或其片段进行了测定。抗体被认为是特异性结合给定表位，如果其结合包含表位序列的肽上具有基本上更高的亲和力，相比结合不包含所述表位序列的肽。术语“基本上更高的亲和力”，如本文所用，指当用预期的测量仪器或方法检测时，对特定氨基酸序列的亲和力水平与对其它氨基酸序列的亲和力水平是显著不同的。优选地，抗体和包含表位的肽之间的结合的亲和力比抗体和不包含表位序列的肽之间的结合的亲和力高至少I个数量级、至少2个数量级、至少3个数量级、至少4个数量级、至少5个数量级、至少6个数量级。以基本上高亲和力结合的结合常数(Ka)是例如，至少IO7M'优选至少IO8M'并更优选至少IO9M-1或更低。术语“S100A4”在“定义”部分定义。该术语也包括所有生理学相关的翻译后化学修饰形式，例如，糖基化，磷酸化或乙酰化，等等，只要蛋白的功能性被保留。所述术语包含任何哺乳动物物种的S100A4，包括但不限于家用和耕畜(奶牛，马，猪，绵羊，山羊，狗，猫或啮齿类动物)，灵长类和人。优选地，S100A4是人的。本发明的第一方面关注S100A4的功能性等价变体的用途。如本文所用，“S100A4的功能性等价变体”被理解为与S100A4共享至少本发明描述的与S100A4相关的血管生成功能的任何分子，包括在体外和在体内，并具有氨基酸序列上的最小的同一性。S100A4的变体可以是天然的或人工的。表述“天然变体”指在其它物种中天然存在的上文提及的人S100A4的所有这些变体，即，S100A4的直系同源体。所述天然变体包括但不限于奶牛的S100A4，对应于登记号DAA31755.1的预测序列(2010年5月21日版本)；大鼠的S100A4，对应于登记号NP_036750.1的预测序列(2011年4月10日版本)；小鼠的S100A4，对应于登记号NP_035441.1的预测序列(2011年5月29日版本)；狗的S100A4，对应于登记号NP_001003161.1的预测序列(2011年2月19日版本)。在本发明的第一方面适合用于的S100A4的天然变体也可以通过插入、取代或删除一或多个氨基酸获得的所述序列，并包括天然等位基因，天然存在的可选过程和分泌和截短形式产生的变体。因此，用于本发明的S100A4可以是天然序列，其包含具有与自天然获得的S100A4相同的氨基酸序列的多肽。这样的天然序列的多肽可以从天然分离或可以通过重组和/或合成途径来生产。因此，本发明的S100A4可以是通过在异源生物中表达编码S100A4的多核苷酸或其功能性等价变体而获得重组蛋白，所述在异源生物中例如在细菌，酵母或昆虫或哺乳动物细胞中。所述重组蛋白可以作为带有组氨酸氨基酸末尾的融合蛋白而获得，以利于后续的纯化。所述蛋白的表达和纯化可以根据本领域技术人员已知的方法和本领域中描述的方法来进行。在一个优选的实施方式中中，S100A4是人来源的，优选序列SEQ ID N0:21。在另一个优选的实施方式中中，S100A4来自融合蛋白的表达，所述融合蛋白包含人S100A4序列和三个额外氨基酸的氨基端尾， 其序列为SEQ ID N0:25。SEQ ID NO:251GSHMACPLEK ALDVMVSTFH KYSGKE⑶KF KLNKSELKEL LTRELPSFLG KRTDEAAFQK61LMSNLDSNRD NEVDFQEYCV FLSCIAMMCN EFFEGFPDKQ PRKK可选地，S100A4可以是S100A4的人工功能性等价变体，其可以通过重组和/或合成途径而获得。关于术语“变体”的更多信息可以参见“定义”部分。本发明的第一方面关注的S100A4变体显示至少S100A4的功能之一，例如，但不限于:-激活MMP9基质金属蛋白酶活性的能力，其可以通过本发明的实施例8中描述的方法来确定。-诱导内皮细胞转移的能力，其可以通过本发明的实施例9中描述的方法来确定。-在裸鼠中诱导肿瘤发展肿瘤发展的能力，其可以通过本申请的实施例10中描述的方法来确定。-血管生成能力或形成血管微脉管系统的能力，其可以通过本申请的实施例11中描述的方法来确定。-诱导在单核细胞中通过IL8的分泌介导的炎症应答的能力，其可以通过本申请的实施例16中描述的方法来确定。另外，本发明的第一方面关注的S100A4的功能性等价变体，包括显示与上述S100A4 的不同天然变体具有至少 60%, 65%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99%相似性或同一性。两个多肽之间同一性的程度用计算机中执行的算法和本领域技术人员已知的方法来确定。两个氨基酸序列之间的同一性优选利用BLASTP算法来确定(BLASTManual, Altschul, S.et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md.20894, Altschul, S., et al.,J., 1990,Mol.Biol, 215:403-410) (BLAST 手册，Altschul, S.等，NCBI NLM NIHBethesda,Md.20894, Altschul, S.，等，1990，《分子生物学》215:403-410)。计算同一性程度的方法在“定义”部分说明。“基本上保留所述抗体的抗血管生成活性的表达”意思是本发明的第一方面的抗体不能完全失去抗血管生成活性。通常，本发明的抗体的氨基酸序列的修饰也是受关注的。例如期望促进抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。抗体的氨基酸序列的变体通过在编码抗体的核酸中引入合适的核苷酸改变来制备，或通过肽合成的方法。所述修饰包括，例如，抗体的氨基酸序列中残基的消除和/或插入和/或取代。进行了消除、插入和取代的任何组合以获得最终的构建体，使得最终的构建体具有期望的特征，即，S100A4结合特异性和所述蛋白的抗血管生成活性拮抗剂。氨基酸的改变也可以改变抗体的翻译后过程，例如改变糖基化位点的数目或位置。一些氨基酸序列中的插入包括氨基末端和/或羧基末端融合，使其长度从一个残基一直到含有一百或更多残基的多肽的变化，以及序列内一或多个氨基酸残基的插入。末端插入的一些实例包括具有N-端甲硫氨酰基残基的抗体，或者细胞毒性多肽融合的抗体。通过插入抗体分子的其它变体包括与酶或者增加抗体血清半衰期的多肽在抗体N-或C-端融合。变体的另一个类型是通过氨基酸取代而产生的变体。这些变体具有抗体的至少一个氨基酸残基取代为不同的残基。通过抗体取代的突变产生的主要感兴趣的位点包括高可变区，但是FR内的改变也是受 关注的。在本发明的内容中，术语“抗原”是指S100A4。本发明的第一方面的特异性抗-S100A4抗体识别抗原S100A4的表位。发明人发现本发明的抗血管生成抗体识别包含在由S100A4的序列ELPSFLGKRT (SEQ ID NO:3)或序列EGFPDKQPRKK (SEQ ID NO:24)确定的区域内的表位。从而，在一个优选的实施方式中，抗体识别包含序列ELPSFLGKRT (SEQ ID NO:3)的S100A4表位。在另一个优选的实施方式中，抗体识别包含序列EGFPDKQPRKK (SEQ ID NO:24)的S100A4表位。表述“识别表位”意思是抗体可以结合到如“定义”部分所定义的表位。表位可以由完整的序列 ELPSFLGKRT (SEQ ID NO:3)或 EGFPDKQPRKK (SEQ ID NO:24)或者由所述序列的一些氨基酸形成。本发明的第一方面的特异性抗-S100A4抗体也可以是单克隆抗体，其在之前定义和“定义”部分所定义。从而，在一个优选的实施方式，本发明的第一方面的特异性抗-S100A4抗体或其片段是单克隆抗体。本发明提供了由不同的杂交瘤细胞系生产的单克隆抗体。在一个优选的实施方式中，根据权利要求2所述的特异性抗-S100A4抗体或其片段由选自ECACC10022401，ECACCl 1051801,ECACCl 1051802,ECACCl 1051803 和 ECACCl 1051804 的杂交瘤组的杂交瘤生产，或其片段。在本发明的上下文中，“杂交细胞”或“杂交瘤”理解为独特干细胞的B-细胞克隆后代，与骨髓瘤细胞的融合产品。特别地，本发明的第一方面的单克隆抗体对应于在本文件的实验部分作为5C3，6B9，5A3，1E2和8B6涉及的抗-S100A4单克隆抗体，其分别从由发明人合成并鉴别为 5C3-1B8-1F4，6B9-1E8-2A8，5A3-4A6-5B6，1E2-2H4-2G8 和8B6-2F6-1H9-1H10的杂交瘤获得。所述杂交瘤在提交本专利申请之前已经保藏在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC),波顿当，索尔兹伯里里，SP40JG,英国(European Collection ofCellCultures (ECACC), Porton Down, Salisbury, SP40JG, United Kingdom),其是作为根据关于国际承认的微生物保藏的1977年4月28日布达佩斯条约的目的的合法认可的机构。保藏者是来自Leitat技术中心的Francesc Mit jans和Marc Masa,其地址为迪瑞,雷克萨奇 15-21 喜力士大楼，巴塞罗那,08028,西班牙(Baldiri Reixach15-2IHeIix Building,Barcelona,08028, Spain)。欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)向杂交瘤5C3-1B8-1F4,6B9-1E8-2A8，5A3-4A6-5B6,1E2-2H4-2G8 和 8B6-2F6-1H9-1H10 分别分配了保藏号 ECACC10022401,ECACCl 1051801，ECACCl 1051802，ECACCl 1051803 和 ECACCl 1051804。使所述杂交瘤系获得本发明的抗-S100A4单克隆抗体的培养条件描述在获得本发明的单克隆抗体的方法的部分中。在本文件中，杂交瘤5C3-1B8-1F4，6B9-1E8-2A8，5A3-4A6-5B6，1E2-2H4-2G8 和8B6-2F6-1H9-1H10和由所述杂交瘤产生的抗体分别以其缩写名称5C3，6B9，5A3，1E2和8B6的方式来表不。本发明也涵盖本发明的第一方面的所述抗-S100A4单克隆抗体的片段，其保留了结合S100A4的能力并具有抗血管生产能力。结合能力可以通过本领域技术人员已知的方法来检测，例如ELISA或蛋白质印迹，如本发明的实施例5、6和7中所描述的。保持抗血管生成能力的能力可以通过本领域技术人员已知的方法来检测，例如本发明的实施例9中描述的那些。所述“片段”指抗体序列的片段，其对应于涉及的单克隆抗体的氨基酸序列的一或多个部分，该单克隆抗体保留了结合S100A4的能力，并因此，该多肽必须包括6个CDR区域的序列，其可用于获得本发明的第一方面的内容中定义的抗体，例如，但不限于，遗传工程抗体例如嵌合抗体，人源化抗体或双特异性抗体。所述“片段”也可以用于获得抗体片段例如Fab，F(ab’)2，Fab’，单链Fv片段(scFv)，双元抗体或纳米抗体。另外，片段保留了阻断血管生成的能力。Fab和F(ab’)2片段可以通过本发明的第一方面的完整单克隆抗体的酶学切割或化学切割获得。对本发明的单克隆抗体进行木瓜蛋白酶消化产生了两个不同的抗原结合片段，被称为“Fab”片段，每一个分别具有单独的抗原结合位点。反过来，具有两个抗原结合位点的“F(ab’)2”片段，通过胃蛋白酶处理而获得。另外，“片段”可以是通过遗传工程技术的获得另一个类型的抗体片段，例如Fab’片段，单链Fv片段(sc Fv)或双元抗体。在一个优选的实施方式，特异性抗-S100A4抗体或其片段由杂交瘤ECACC10022401 生产的。本发明提供了包含SEQ ID NO:1的分离的氨基酸序列。该氨基酸序列包含了针对S100A4的单克隆抗体的可变区的轻链的FR和CDR。具体来说，可变区的轻链序列以及各自的FR和⑶R的序列如下所示:
权利要求
1.一种具有抗血管生成活性的特异性抗-S100A4抗体或基本上保留了所述抗体的抗血管生成活性的其片段，其中所述抗体选自如下组: (i)识别包含序列ELPSFLGKRT(SEQ ID NO:3)的S100A4表位的抗体， (ii)识别包含序列EGFPDKQPRKK(SEQ ID NO:24)的S100A4表位的抗体，和 (iii)由杂交瘤ECACC11051804产生的抗体。
2.根据权利要求1所述的特异性抗-S100A4抗体或其片段，其中所述抗体是单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的特异性抗-S100A4抗体或其片段，由选自ECACC10022401，ECACCl 1051801,ECACCl 1051802,ECACCl 1051803 和 ECACCl 1051804 杂交瘤组的杂交瘤或其片段产生。
4.根据权利要求 3所述的单克隆抗体或其片段，其由杂交瘤ECACC10022401产生。
5.根据权利要求4所述的抗体或其片段，其包含至少一个VL区和至少一个VH区，所述VL区包含序列SEQ ID NO:1或其功能性等价变体，所述VH区包含序列SEQ ID NO: 2或其功能性等价变体。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的抗体或片段，其具备中断人内皮细胞的转移能力。
7.一种杂交瘤细胞系，其选自保藏号为ECACC10022401，ECACC11051801,ECACC11051802, ECACCl 1051803 和 ECACC11051804 的细胞系组的的杂交瘤系。
8.—种药物组合物，包含药学上有效量的至少一种根据权利要求1-6的任意一项所述的抗体或其片段和至少一种药学上可接受的载体。
9.根据权利要求1-6的任一项所述的抗体或其片段，用于预防和/或治疗选自以下疾病组的疾病的用途:转移，与不期望的血管生成相关的疾病，和与炎症相关的疾病。
10.抗体或其片段，在用于根据权利要求9所述的用途中，其中疾病是癌症。
11.抗体或其片段，在用于根据权利要求10所述的用途中，其中癌症选自胰腺癌和结肠直肠癌。
12.—种缀合物，包含根据权利要求1-6任一项所述的抗体或其片段和第二组分，所述第二组分选自以下的组: (a)抗血管生成试剂 (b)抗转移试剂 (C)细胞毒素试剂 (d)抗炎症试剂
13.根据权利要求12所述的缀合物，用于预防和/或治疗选自以下疾病的用途:转移瘤，与不期望的血管生成相关的疾病，和与炎症相关的疾病。
14.一种获得权利要求2-6任意一项所述的单克隆抗体的方法，其包含在能够生产所述抗体的条件下培养选自以保藏编号ECACC10022401，ECACC11051801, ECACC11051802,ECACCl 1051803和ECACC11051804细胞系的杂交瘤细胞系。
15.包含特异性抗-S100A4抗体和抗代谢物的组合物。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中抗代谢物是吉西他滨。
17.根据权利要求15或16所述的组合物，其中特异性抗-S100A4抗体是具有抗血管生成活性的抗-S100A4抗体或基本上保留了所述抗体的抗血管生成活性的其片段，其中所述抗体选自如下组: (i)识别包含序列ELPSFLGKRT(SEQ ID NO:3)的的表位的抗体， (ii)识别包含序列EGFPDKQPRKK(SEQ ID NO:24)的S100A4表位的抗体和 (iii)由杂交瘤ECACC11051804产生的抗体。
18.根据权利要去15-17的任意一项所述的组合物，其中特异性抗-S100A4抗体是由选自 ECACC10022401, ECACC11051801, ECACC11051802, ECACCl1051803 和 ECACCl1051804 杂交瘤组的杂交瘤产生的单克隆抗体。
19.根据权利要求18所述的组合物，其中特异性抗-S100A4抗体是由杂交瘤ECACC10022401产生的单克隆抗体。
20.根据权利要求15-19的任一项所述的组合物，其能够降低肿瘤细胞生存能力。
21.根据权利要求15-20的任一项所述的组合物，用于预防和/或治疗癌症或转移瘤。
22.能够结合该抗原的特异性结合S100A4蛋白的抗体或其的片段在制备用于治疗和/或预防与炎症相关的疾病的药物中的用途。
23.根据权利要求22所述的用途，其中特异性结合S100A4蛋白的抗体或其片段是具有抗血管生成活性的抗-S100A4抗体或基本上保留了所述抗体的抗血管生成活性的其片段，其中所述抗体选自如下组: (i)识别包含序列ELPSFLGKRT(SEQ ID NO:3)的S100A4表位的抗体，` (ii)识别包含序列EGFPDKQPRKK(SEQ ID NO:24)的S100A4表位的抗体，和 (iii)由杂交瘤ECACC11051804产生的抗体。
24.根据权利要求23所述的用途，其中特异性结合S100A4蛋白的抗体是由选自ECACC10022401，ECACC11051801，ECACC11051802，ECACC11051803 和 ECACC11051804 杂交瘤组的杂交瘤产生的抗体。
25.根据权利要求24所述的用途，其中特异性结合S100A4蛋白的抗体是由杂交瘤ECACC10022401产生的抗体。
26.—种在对象中体外诊断癌症或与炎症相关的疾病的方法，其包含 (a)检测所述对象的生物流体中S100A4蛋白或其变体的水平，其是通过利用由选自ECACC10022401,ECACCl 1051801,ECACCl 1051802,ECACCl 1051803 和 ECACCl 1051804 的杂交瘤组的杂交瘤产生的单克隆抗体或所述抗体的功能性功能性变体实现的， (b)将所述水平与参考值比较 其中，相对于参考值，S100A4蛋白或其变体的水平的增加表示对象患有癌症或与炎症相关的疾病。
27.根据权利要求26所述的方法，其中疾病是癌症。
28.根据权利要求26或27所述的方法，其中生物流体选自血液、血浆和血清。
29.—种检测样品中S100A4的方法，其包含: (i)将怀疑含有S100A4的样品与权利要求1-6任一项所定义的特异性抗-S100A4抗体或其片段接触，和 ( )检测S100A4和抗体或其片段之间的免疫复合物的形成 其中，检测到S100A4和抗体或其片段之间的免疫复合物表示样品中存在S100A4。
30.一种在生物流体中诊断癌症或与炎症相关的疾病的试剂盒，其包含至少一种根据权利要求1-6所述的抗体或其片段。
31.一种为诊断患有癌症的对象设计定制疗法的体外方法，其包含: (i)确定所述对象的生物流体中S100A4蛋白或其变体的水平和 (ii)比较S100A4蛋白的水平与参考值 其中，S100A4蛋白或其变体的水平相对于参考水平的增加表示该患者需要用具有抗血管生成活性的特异性抗-S100A4抗体或基本上保留所述抗体的抗血管生成活性的其片段治疗，其中抗体选自如下组: (a)识别包含序列ELPSFLGKRT(SEQ ID NO:3)的S100A4表位的抗体， (b)识别包含序列EGFPDKQPRKK(SEQ ID NO:24)的S100A4表位的抗体和 (c)由杂交瘤ECACC11051804产生的抗体。
32.根据权利要求31中所述的方法，其中步骤(i)中水平的确定是通过利用由选自ECACC10022401,ECACCl 1051801,ECACCl 1051802,ECACCl 1051803 和 ECACCl 1051804 杂交瘤组的杂交瘤产生的单克隆抗体或所述抗体的功能性变体来进行。
全文摘要
本发明涉及针对S100A4的抗体，制备这些抗体的方法，包含这些抗体的药物组合物，以及其的治疗和诊断用途。
文档编号A61K39/395GK103201290SQ201180039348
公开日2013年7月10日 申请日期2011年6月14日 优先权日2010年6月14日
发明者J·L·埃尔南德斯·米格斯, J·阿丹·布拉纳, J·M·马丁内斯·斯科拉, M·玛莎·阿尔瓦雷斯, R·梅塞格尔·皮伊波奇, F·莫伊特金斯·帕拉特, S·达希尔·普拉扎, A·科尔·曼扎诺, R·M·埃尔瓦斯·比列加斯, C·卡尔维斯·卡培, L·帕迪利亚·加西亚, L·T·罗克·纳瓦罗, L·巴贝拉·费兰多, M·里瓦斯·卡纳斯, L·A·戈麦斯·卡萨胡斯 申请人:莱克拉生物医学股份公司