专利名称：基于酰胺的胰岛素前药的制作方法
基于酰胺的胰岛素前药相关申请的交叉引用
本申请要求2010年6月24日提交的美国临时专利申请号61/358，192的优先权，其特此通过引用整体并入。通过引用电子形式提交的材料的并入
通过引用整体并入计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表，所述序列表与本文一并提交并如下标识:于2011年6月23日创建的名称为“IN216461”的一个27 KB ACII (文本)文件。
背景技术：
胰岛素是一种由二链异源二聚体组成的肽激素，所述异源二聚体以生物合成的方式由低效能单链胰岛素原前体通过酶加工获得。人胰岛素由通过二硫键结合在一起的两条肽链(“A链”(SEQ ID NO:1)和“B链”(SEQ ID NO: 2))组成，共有51个氨基酸。B链的C末端区和A链的两个末端区以三维结构缔合装配成以高亲和力结合胰岛素受体的部位。对于几乎所有形式的糖尿病，胰岛素都显示出无以伦比的降低葡萄糖的能力。遗憾的是，其药理学并不是葡萄糖敏感性的，以至于它能够产生可导致危及生命的低血糖症的过度作用。不一致的药理学是胰岛素疗法的标志，使得要使血糖正常化而又不发生低血糖症极为困难。此外，天然胰岛素的作用持续时间短，而且天然胰岛素需要经过修饰使之适用于基础葡萄糖的控制。已确立的延迟胰岛素起效的方法包括降低溶解度和白蛋白结合。例如，已制备了两种市售的胰岛素衍生物以提供较长的作用特征。更具体地讲，制备了胰岛素衍生物[GlyA21，ArgB31，ArgB32]胰岛素，以使胰岛素的pi由5.4变为6.7，导致该肽在生理pH下沉淀，由此迟缓吸收和作用时间(参见Bolli等，Diabetologia 1999,42，1151-1167)。然而，这种胰岛素衍生物的IGF-1亲和力升高，导致增殖作用增强和肿瘤发生的可能性增加。另一种市售的胰岛素衍生物是[LysB29-十四烷酰基，des(B30)]胰岛素,其中 LysB29 已经用 C14 脂肪酸酰化(Mayer 等Science,88,5,687-713)。脂肪酸链的存在促进肽与血清白蛋白的结合，导致血浆半衰期延长。然而，这种衍生物具有体内效能降低的缺点。另外，两种胰岛素衍生物的生物学作用在一名患者与另一患者之间表现出差异。前药化学法为在从给药部位清除并在血浆中以高度限定的浓度平衡后精确控制胰岛素作用的开始和持续时间提供了机会。与现有的长效胰岛素类似物和制剂相比，该方法的主要优点是胰岛素贮库不是其中进行注射的皮下脂肪组织，而是血液隔室。这就排除了现有技术延迟起效胰岛素衍生物所遇到的吸收变化性。这还使通过皮下注射以外的途径施用该肽激素成为可能。胰岛素与其受体结合将引起生物刺激，但也将通过胰岛素肽的酶促降解而引发胰岛素诱导的药理学的后续失活。使用胰岛素前药衍生物的额外优势是这类方法还基于抑制前药被相应受体识别的策略来延长胰岛素的生物半衰期。尽管存在与前药衍生物相关的这些优势，但是制备这类前药的复杂特性至今一直妨碍有效胰岛素前药衍生物的制备。为了开发成功的前药激素，需要活性部位结构地址(structural address),其可形成用于前药结构元件可逆附着的基础。该结构地址需提供两个关键特征；(I)选择性化学修饰的潜力，和(2)在脱去前药结构元件时以天然形式提供高度活性的能力。将本文公开的胰岛素前药以化学法转化为可被受体识别的结构，其中该化学转化的速度将决定体内生物作用的开始和持续时间。本申请公开的前药化学法有赖于分子内的化学反应，该反应不依赖其它化学添加剂或者酶或酶抑制剂。理想的前药在生理条件(例如pH 7.2和37°C )下应可溶于水，并且以粉末形式长期保存时应保持稳定。与母体药物相比，前药还应是免疫沉默的，并显示出低活性。通常，前药将显示出不超过母体药物活性的10%,在一个实施方案中，与母体药物相比,前药显示出小于10%、小于5%、约1%或小于1%的活性。此外，当注射到体内时，前药应在规定时段内定量转化为活性药物。申请人首次公开了符合这些目标中的每一项的胰岛素前药类似物。
发明内容
基于肽的药物是十分有效的药物，其作用持续时间相对较短并且治疗指数可变。本公开内容涉及胰岛素前药，其中将前药衍生物设计成延迟起效，而且药物半衰期延长。起效延迟是有利的，因为允许前药在其活化前系统分布。因此，施用前药排除了在给药时由峰值活性引起的并发症，并提高母体药物的治疗指数。根据一个实施方·案，将二肽通过酰胺键与胰岛素肽的活性部位共价连接来制备胰岛素的前药衍生物。在一个实施方案中，二肽在干扰胰岛素与胰岛素受体和IGF-1受体相互作用的能力的位置上与胰岛素肽共价结合。随后在生理条件下且缺乏酶活性时，通过导致二酮哌嗪或二酮吗啉形成的分·子内反应除去二肽，恢复多肽的完整活性。在一个实施方案中，提供具有U-O-胰岛素的通用结构的胰岛素前药，其中U为氨基酸或羟酸，0为通过在U-O和胰岛素肽的胺之间形成酰胺键而与胰岛素肽连接的N-烷基化氨基酸。在一个实施方案中，U-O 二肽在A链或B链各自的N端或与A链或B链各自的A19、B16或B25位对应的氨基酸侧链上通过酰胺键结合。在一个实施方案中，选择U-O的结构，其中在生理条件下的PBS中，在约I小时至约720小时内U-O自胰岛素肽的化学裂解完成至少约90%。在一个实施方案中，在生理条件下的PBS中，U-O自胰岛素肽的化学裂解半衰期(t1/2)为至少约I小时至约I周。在一个实施方案中，选择U和0以抑制存在于哺乳动物血清中的酶从胰岛素肽上酶促切割U-O 二肽。在一个实施方案中，选择U和/或0，使得在生理条件下的PBS中，从胰岛素肽对U-O的裂解半衰期不大于在包含DPP-1V蛋白酶的溶液中从胰岛素肽对U-O的裂解半衰期的两倍(即在DPP-1V蛋白酶存在和生理条件下从胰岛素前药中裂解U-O不会以超过2倍的更快速率发生(与不存在该酶的相同条件相比))。在一个实施方案中，U、0或U-O与之连接的胰岛素肽的氨基酸为非编码氨基酸。在一个实施方案中，U和/或0为呈D立体异构体构型的氨基酸。在一些示例性的实施方案中，U为呈D立体异构体构型的氨基酸，而0为呈L立体异构体构型的氨基酸。在一些示例性的实施方案中，U为呈L立体异构体构型的氨基酸，而0为呈D立体异构体构型的氨基酸。在一些示例性的实施方案中，U为呈D立体异构体构型的氨基酸，而0为呈D立体异构体构型的氨基酸。在一个实施方案中，0为N-烷基化氨基酸，但不是脯氨酸。
在一个实施方案中，二肽前药元件包含具有以下式I通用结构的化合物:
权利要求
1.一种包含以下结构的前药:A-B-Q ； 其中Q是包含A链和B链的胰岛素肽，其中所述A链包含序列Giveqccx1Sicslyqlenx2Cx3 (seq id no: 3)，且所述b链包含序列x14-x4lcgx5x6lvealx7lvcgERGFX8 (SEQ ID NO: 14)， 其中 X14是键，或选自下述的1-4个氨基酸的序列:FVNQ (SEQ ID NO: 11)、VNQ、NQ和Q ; X1选自苏氨酸和组氨酸； X2为以下通用结构的氨基酸
2.根据权利要求1所述的前药，其中B选自甘氨酸(N-甲基)、甘氨酸(N-乙基)、甘氨酸(N-丙基)、甘氨酸(N- 丁基)、甘氨酸(N-戊基)、甘氨酸(N-己基)、甘氨酸(N-庚基)和甘氨酸(N-辛基)。
3.根据权利要求2所述的前药，其中B为甘氨酸(N-甲基)。
4.根据权利要求2所述的前药，其中B为甘氨酸(N-己基)。
5.一种包含以下结构的前药:A-B-Q ； 其中Q是包含A链和B链的胰岛素肽，其中所述A链包含序列Giveqccx1Sicslyqlenx2Cx3 (seq id no: 3)，且所述b链包含序列x14-x4lcgx5x6lvealx7lvcgERGFX8 (SEQ ID NO: 14)， 其中 X14是键，或选自下述的1-4个氨基酸的序列:FVNQ (SEQ ID NO: 11)、VNQ、NQ和Q ; X1选自苏氨酸和组氨酸； X2为以下通用结构的氨基酸
6.根据权利要求5所述的前药，其中R4选自CH3、CH2(C1-C4烷基)、CH2 (C1-C4)烯基、CH2 (C0-C4 烷基)0H、CH2 (C0-C4 烷基)SH、CH2 (C0-C3 烷基)SCH3XH2 (C0-C3 烷基)CONH2、CH2 (C0-C3烷基)C00H、CH2 (C0-C4 烷基)NH2 和 CH2 (C0-C3 烷基)NHC (NH2+) NH2。
7.根据权利要求6所述的前药，其中B选自丙氨酸(N-C1-Cltl烷基)、亮氨酸(N-C1-Cltl烧基)、甲硫氨酸(N-C1-Cltl烧基)、天冬酰胺(N-C1-Cltl烧基)、谷氨酸(N-C1-Cltl烧基)、天冬氨酸(N-C1-Cltl烧基)、谷氨酰胺(N-C1-Cltl烧基)、组氨酸(N-C1-Cltl烧基)、赖氨酸(N-C1-Cltl烷基)、精氨酸(N-C1-Cltl烷基)、丝氨酸(N-C1-Cltl烷基)和半胱氨酸(N-C1-Cltl烷基)。
8.根据权利要求7所述的前药，其中B选自丙氨酸(N-C1-C6烷基)、亮氨酸(N-C1-Qg基)、甲硫氨酸(N-C1-C6烧基)、天冬酰胺(N-C1-C6烧基)、谷氨酸(N-C1-C6烧基)、天冬氨酸(N-C1-C6烧基)、谷氨酰胺(N-C1-C6烧基)、组氨酸(N-C1-C6烧基)、赖氨酸(N-C1-C6烧基)、精氨酸(N-C1-C6烷基)、丝氨酸(N-C1-C6烷基)和半胱氨酸(N-C1-C6烷基)。
9.根据权利要求8所述的前药，其中B选自丙氨酸(N-甲基)、亮氨酸(N-甲基)、甲硫氨酸(N-甲基)、天冬酰胺(N-甲基)、谷氨酸(N-甲基)、天冬氨酸(N-甲基)、谷氨酰胺(N-甲基)、组氨酸(N-甲基)、赖氨酸(N-甲基)、精氨酸(N-甲基)、丝氨酸(N-甲基)和半胱氨酸(N-甲基)。
10.根据权利要求5所述的前药，其中R4选自CH2(Ctl-C3烷基)(C3-C6环烷基)、CH2 (Ctl-C3烷基)(C2-C5 杂环基)、CH2 (C0-C3 烷基)(C6-Cltl 芳基)R7、CH2 (C1-C3 烷基)(C3-C9 杂芳基)和CH2 (C0-C12烷基)(W1) C1-C12烷基，其中W1为选自N、S和O的杂原子，且其中R7选自H和OH。
11.根据权利要求10所述的前药，其中B选自苯丙氨酸(N-C1-Cltl烷基)、酪氨酸(N-C1-C10烷基)和色氨酸(N-C1-Cltl烷基)。
12.根据权利要求11所述的前药，其中B选自苯丙氨酸(N-C1-C6烷基)、酪氨酸(N-C1-C6烷基)和色氨酸(N-C1-C6烷基)。
13.根据权利要求12所 述的前药，其中B选自苯丙氨酸(N-甲基)、酪氨酸(N-甲基)和色氨酸(N-甲基)。
14.根据权利要求5所述的前药，其中B为脯氨酸。
15.—种包含以下结构的前药:A-B-Q ； 其中Q是包含A链和B链的胰岛素肽，其中所述A链包含序列Giveqccx1Sicslyqlenx2Cx3 (seq id no: 3)，且所述b链包含序列x14-x4lcgx5x6lvealx7lvcgERGFX8 (SEQ ID NO: 14)， 其中 X14是键，或选自下述的1-4个氨基酸的序列:FVNQ (SEQ ID NO: 11)、VNQ、NQ和Q ; X1选自苏氨酸和组氨酸； X2为以下通用结构的氨基酸
16.根据权利要求15所述的前药，其中R4是OKC1-C8烷基)2或OKC1-C8烷基)0H。
17.根据权利要求16所述的前药，其中B选自异亮氨酸(N-C1-Cltl烷基)、缬氨酸(N-C1-C10烷基)和苏氨酸(N-C1-Cltl烷基)。
18.根据权利要求17所述的前药，其中B选自异亮氨酸(N-C1-C6烷基)、缬氨酸(N-C1-C6烷基)和苏氨酸(N-C1-C6烷基)。
19.根据权利要求18所述的前药，其中B选自异亮氨酸(N-甲基)、缬氨酸(N-甲基)和苏氨酸(N-甲基)。
20.根据权利要求1所述的前药，其中所述脂族氨基是在A链或B链的N端氨基酸上的α氨基。
21.根据权利要求1所述的前药，其中所述脂族氨基是在Q的侧链上的脂族氨基。
22.根据权利要求21所述的前药，其中所述B链包含序列FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 8)或FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT(SEQ ID NO: 9)，且所述脂族氨基是赖氨酸的侧链氨基。
23.—种包含以下结构的前药:A-B-Q ；其中Q是包含A链和B链的胰岛素肽，其中所述A链包含序列Giveqccx1Sicslyqlenx2Cx3 (seq id no: 3)，且所述b链包含序列x14-x4lcgx5x6lvealx7lvcgERGFX8 (SEQ ID NO: 14)， 其中 X14是键，或选自下述的1-4个氨基酸的序列:FVNQ (SEQ ID NO: 11)、VNQ、NQ和Q ; X1选自苏氨酸和组氨酸； X2为以下通用结构的氨基酸
24.根据权利要求23所述的前药，其中B选自甘氨酸(N-甲基)、甘氨酸(N-乙基)、甘氨酸(N-丙基)、甘氨酸(N- 丁基)、甘氨酸(N-戊基)、甘氨酸(N-己基)、甘氨酸(N-庚基)和甘氨酸(N-辛基)。
25.根据权利要求24所述的前药，其中B为甘氨酸(N-甲基)。
26.根据权利要求24所述的前药，其中B为甘氨酸(N-己基)。
27.—种包含以下结构的前药:A-B-Q ； 其中Q是包含A链和B链的胰岛素肽，其中所述A链包含序列Giveqccx1Sicslyqlenx2Cx3 (seq id no: 3)，且所述b链包含序列x14-x4lcgx5x6lvealx7lvcgERGFX8 (SEQ ID NO: 14)， 其中 X14是键，或选自下述的1-4个氨基酸的序列:FVNQ (SEQ ID NO: 11)、VNQ、NQ和Q ; X1选自苏氨酸和组氨酸； X2为以下通用结构的氨基酸
28.根据权利要求27所述的前药，其中R4选自CH3、CH2 (C1-C4烷基)、CH2 (C1-C4)烯基、CH2 (C0-C4 烷基)0H、CH2 (C0-C4 烷基)SH、CH2 (C0-C3 烷基)SCH3XH2 (C0-C3 烷基)CONH2、CH2 (C0-C3烷基)COOH、CH2 (C0-C4 烷基)NH2 和 CH2 (C0-C3 烷基)NHC (NH2+) NH2。
29.根据权利要求28所述的前药，其中B选自丙氨酸(N-C1-Cltl烷基)、亮氨酸(N-C1-Cltl烧基)、甲硫氨酸(N-C1-Cltl烧基)、天冬酰胺(N-C1-Cltl烧基)、谷氨酸(N-C1-Cltl烧基)、天冬氨酸(N-C1-Cltl烧基)、谷氨酰胺(N-C1-Cltl烧基)、组氨酸(N-C1-Cltl烧基)、赖氨酸(N-C1-Cltl烷基)、精氨酸(N-C1-Cltl烷基)、丝氨酸(N-C1-Cltl烷基)和半胱氨酸(N-C1-Cltl烷基)。
30.根据权利要求29所述的前药，其中B选自丙氨酸(N-C1-C6烷基)、亮氨酸(N-C1-C6烧基)、甲硫氨酸(N-C1-C6烧基)、天冬酰胺(N-C1-C6烧基)、谷氨酸(N-C1-C6烧基)、天冬氨酸(N-C1-C6烧基)、谷氨酰胺(N-C1-C6烧基)、组氨酸(N-C1-C6烧基)、赖氨酸(N-C1-C6烧基)、精氨酸(N-C1-C6烷基)、丝氨酸(N-C1-C6烷基)和半胱氨酸(N-C1-C6烷基)。
31.根据权利要求30所述的前药，其中B选自丙氨酸(N-甲基)、亮氨酸(N-甲基)、甲硫氨酸(N-甲基)、天冬酰胺(N-甲基)、谷氨酸(N-甲基)、天冬氨酸(N-甲基)、谷氨酰胺(N-甲基)、组氨酸(N-甲基)、赖氨酸(N-甲基)、精氨酸(N-甲基)、丝氨酸(N-甲基)和半胱氨酸(N-甲基)。
32.根据权利要求27所述的前药，其中R4选自CH2(Ctl-C3烷基)(C3-C6环烷基)、CH2 (C0-C3 烷基)(C2-C5 杂环基)、CH2 (C0-C3 烷基)(C6-Cltl 芳基)R7、CH2 (C1-C3 烷基)(C3-C9 杂芳基)和CH2 (Ctl-C12烷基)(W1)C1-C12烷基，其中W1为选自N、S和O的杂原子，且其中R7选自H和0H。
33.根据权利要求32所述的前药，其中B选自苯丙氨酸(N-C1-Cltl烷基)、酪氨酸(N-C1-C10烷基)和色氨酸(N-C1-Cltl烷基)。
34.根据权利要求33所述的前药，其中B选自苯丙氨酸(N-C1-C6烷基)、酪氨酸(N-C1-C6烷基)和色氨酸(N-C1-C6烷基)。
35.根据权利要求34所述的前药，其中B选自苯丙氨酸(N-甲基)、酪氨酸(N-甲基)和色氨酸(N-甲基)。
36.根据权利要求27所述的前药，其中B为脯氨酸。
37.一种包含以下结构的前药:A-B-Q ； 其中Q是包含A链和B链的胰岛素肽，其中所述A链包含序列Giveqccx1Sicslyqlenx2Cx3 (seq id no: 3)，且所述b链包含序列x14-x4lcgx5x6lvealx7lvcgERGFX8 (SEQ ID NO: 14)， 其中 X14是键，或选自下述的1-4个氨基酸的序列:FVNQ (SEQ ID NO: 11)、VNQ、NQ和Q ; X1选自苏氨酸和组氨酸； X2为以下通用结构的氨基酸
38.根据权利要求37所述的前药，其中R4是OKC1-C8烷基)2或OKC1-C8烷基)0H。
39.根据权利要求38所述的前药，其中B选自异亮氨酸(N-C1-Cltl烷基)、缬氨酸(N-C1-C10烷基)和苏氨酸(N-C1-Cltl烷基)。
40.根据权利要求39所述的前药，其中B选自异亮氨酸(N-C1-C6烷基)、缬氨酸(N-C1-C6烷基)和苏氨酸(N-C1-C6烷基)。
41.根据权利要求40所述的前药，其中B选自异亮氨酸(N-甲基)、缬氨酸(N-甲基)和苏氨酸(N-甲基)。
42.根据前述权利要求中任一项所述的前药，其中RJPR2独立地选自C1-Cltl烷基、C2-Cltl烯基、(C1-Cltl 烷基)OH、(C1-Cltl 烷基)SH、(C2-C3 烷基)SCH3、(C1-C4 烷基)CONH2、(C1-C4 烧基)COOH、(C1-C4 烷基)NH2、(C1-C4 烷基)NHC (NH2+) NH2、(C0-C4 烷基)(C3-C6 环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5 杂环基)、(C0-C4 烷基)(C6-Cltl 芳基)R7、(C1-C4 烷基)(C3-C9 杂芳基)和 C1-C12烷基(W1) C1-C12烷基，其中W1为选自N、S和0的杂原子，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基，且其中R7选自H和0H。
43.根据权利要求42所述的前药，其中A是氨基异丁酸。
44.根据前述权利要求中任一项所述的前药，其中R1是H并且R2选自H、C1-C10烷基、C2-C10 烯基、(C1-C10 烷基)OH、(C1-C10 烷基)SH、(C2-C3 烷基)SCH3、(C1-C4 烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4 烷基)NH2、(C1-C4 烷基)NHC (NH2+) NH2、(C0-C4 烷基)(C3-C6 环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5 杂环基)、(C0-C4 烷基)(C6-Cltl 芳基)R7、(C1-C4 烷基)(C3-C9 杂芳基)和 C1-C12烷基(W1) C1-C12烷基，其中R7选自H和0H，其中W1为选自N、S和0的杂原子，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基，或者R2和R5与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环。
45.根据权利要求44所述的前药，其中A选自赖氨酸、半胱氨酸和丙氨酸。
46.根据权利要求44或45所述的前药，其中A具有d_立体化学。
47.根据前述权利要求中任一项所述的前药，其中A-B选自Aib-Gly(N-己基)、dLys-Gly (N-己基)、dCys-Gly (N-己基)、dAIa-GIy (N-己基)、Aib-Gly (N-甲基)、dLys-Gly (N-甲基)、dCys-Gly (N-甲基)、dAIa-GIy (N-己基)、Aib-Phe (N-甲基)、dLys-Phe (N-甲基)、dCys-Phe (N-甲基)或 dAIa-Phe (N-甲基)。
48.根据前述权利要求中任一项所述的前药，所述前药另外包含与所述前药共价连接的未水部分。
49.根据权利要求48所述的前药，其中所述亲水部分是聚乙二醇。
50.根据权利要求49所述的前药，其中所述聚乙二醇与A-B共价连接。
51.根据权利要求50所述的前药，其中所述聚乙二醇通过间隔物与A-B共价连接。
52.根据前述权利要求中任一项所述的前药，所述前药另外包含与所述前药共价连接的酰基或烷基。
53.根据权利要求52所述的前药，其中所述酰基或烷基与A-B共价连接。
54.根据权利要求53所述的前药，其中所述酰基或烷基通过间隔物与A-B共价连接。
55.根据前述权利要求中任一项所述的前药，其中B链羧基端经由8-12个氨基酸的肽接头与A链的氨基端连接，以形成单链胰岛素类似物。
56.根据权利要求55所述的前药，其中所述肽接头选自:GYGSSSRRAPQT;SEQ ID NO:23,GYGSSSX7X8 (SEQ ID NO: 71)或 GAGSSSRRAPQT (SEQ ID NO: 70)，其中 X7 和 X8 独立地为鸟氨酸、精氨酸或赖氨酸。
全文摘要
提供了胰岛素和胰岛素类似物的前药制剂，其中胰岛素肽已通过酰胺键连接二肽前药元件来修饰。本文公开的前药具有至少10小时、更通常大于2小时、20小时和小于70小时的延长的半衰期，并且在生理条件下通过由化学不稳定性驱动的非酶促反应转化成活性形式。
文档编号A61K38/00GK103119057SQ201180040875
公开日2013年5月22日 申请日期2011年6月23日 优先权日2010年6月24日
发明者R.D.迪马基, 寇宾宾, 程抒江 申请人:印第安纳大学研究及科技有限公司