治疗前列腺癌的免疫治疗方法

专利名称：治疗前列腺癌的免疫治疗方法
技术领域：
本发明涉及前列腺癌及其转移的治疗领域。更具体地，本发明涉及免疫原性多肽和编码这种多肽的核酸，所述免疫原性多肽包括前列腺肿瘤细胞相关(糖)蛋白或其免疫学活性变体的至少一部分。这种多肽和核酸序列可用于前列腺癌及其转移的治疗性和预防性治疗的疫苗和药物组合物。
背景技术：
前列腺癌是男性中排在第四位最普遍的癌症。在北美和北欧，它是男性中最常见的癌症，并且在男性中是癌症死亡的第二主要原因。仅仅在美国，每年超过40，000人死于该疾病，仅次于肺癌。尽管这些数字巨大，但仍然没有转移性前列腺癌的有效疗法。大量临床证据显示，人前列腺癌具有向骨转移的倾向，该疾病显示不可避免的从雄激素依赖性向雄激素难治性状况发展，导致增加的患者死亡率。尽管对该疾 病的疗法进行了相当的研究，前列腺癌仍然是难治疗的。手术前列腺切除术，放射治疗，激素去除疗法，手术阉割和化疗仍然是主要的治疗方式。不幸的是，这些方法在很大比例的病例中没有效果。人的年龄和基本健康状况，转移程度，显微镜下外观，和对初步治疗的癌症应答在确定疾病和潜在治疗的结果中是重要的。是否带有治愈目的来治疗局部前列腺癌(包含在前列腺内的肿瘤)的决定是根据患者存活和生活质量在预期有益和不良影响之间的患者权衡。新治疗靶标的鉴定对于改进前列腺癌患者的现有治疗非常重要。分子医学的最新发展增加了对肿瘤特异性细胞表面抗原(可用作不同免疫治疗或小分子策略的靶标)的兴趣。在免疫系统的多种组成中，T淋巴细胞可能是最擅长识别并去除表达外源或肿瘤相关抗原的细胞。细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表达CD8细胞表面标记，专用于诱导靶细胞裂解，它们通过穿孔素/粒酶和/或Fas/Fas-L途径与所述靶细胞反应。针对CTL抗原的T细胞受体(TCR)结合靶细胞表面的分子复合物(由来源于加工的外源或肿瘤相关抗原的小肽(8-11)残基形成)，其与主要组织相容性复合物(MHC)I型分子相关。其他主要T细胞亚型，辅助T淋巴细胞(HTL或T辅助细胞)，特征在于表达⑶4表面标记。T辅助细胞识别稍微更大的肽(11-20个残基)，其也来源于外源或肿瘤相关抗原，但是在MHC II型分子背景中，其只由专门化抗原呈递细胞(APC)如B淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞(DC)表达。作为通过APC上的肽/MHC复合物对初始CTL和HTL的TCR刺激的结果，CTL成熟为效应杀伤细胞，其能够裂解表达相应肽/MHC I型复合物的(肿瘤)细胞。活化的HTL增强CTL应答，通过使APC更有效的刺激初始CTL以及通过产生刺激CTL成熟和增殖的淋巴因子进行。T辅助细胞的增强作用在次级淋巴器官(在此免疫应答开始)和肿瘤部位(在此CTL应答需要维持直至肿瘤细胞被清除)均发生。因此，预测疫苗将会刺激肿瘤活性CTL和HTL产生有效的抗肿瘤免疫。适于免疫治疗癌症策略的抗原应当在癌症组织中高表达，并且理想的不在正常成人组织中表达。但是，在对生命来说不是必需的组织中的表达也是可以接受的。发明概述本发明人出人意料的发现,透明带(zona pellucid)(糖)蛋白提供了用于治疗前列腺癌及其转移的免疫治疗策略的合适抗原。根据本发明，能够诱导CD8+和/或CD4+T细胞应答的ZP抗原以及编码所述抗原的核酸序列适用于前列腺癌的治疗性和/或预防性治疗的免疫治疗策略。本发明基于以下发现，前列腺肿瘤细胞显示显著的ZP (糖)蛋白的表达，其程度为使得这些细胞被通过施用ZP(糖)蛋白来源的抗原引发的免疫应答有效靶向，导致原发前列腺肿瘤以及由其来源的转移的生长减缓或甚至大小减小。本策略同样适用于在受治疗的对象中预防前列腺肿瘤转移以及预防前列腺肿瘤复发。ZP3通常发现于所谓的“透明带”，其形成环绕发育中和排卵的卵母细胞和植入前胚胎的细胞外基质。这种透明带诱导精子的顶体反应，决定受精的种属特异性，并预防哺乳动物的多精受精。透明带包含4种主要糖蛋白，ZP1，ZP2，ZP3和ZP4之前从来没有证明ZP(糖)蛋白在前列腺(来源)的肿瘤细胞中的表达。因此现有技术中没有以下启示:前列腺肿瘤细胞实际上可以变成通过施用ZP(来源的)抗原引发的细胞免疫应答的靶。 因此本发明第一次提供了治疗人前列腺肿瘤的方法，包括用包括I型MHC-或II型MHC-限制性天然透明带T细胞表位的多肽或其免疫学活性变体的多肽源免疫所述人，以及提供了适用于这种方法的组合物。本发明将在下文更详细地描述。发明详述本发明的第一个方面涉及一种治疗对象前列腺癌及其转移的方法，通过诱导针对ZP(糖)蛋白的初次免疫应答进行，所述方法包括给所述人施用多肽源的步骤，所述多肽包括I型MHC-和/或II型MHC-限制性天然透明带T细胞表位(其能够在体内引发T细胞介导的免疫应答)或其免疫学活性变体。在本发明一个尤其优选的实施方案中，所述方法是用于治疗性治疗的方法。关于ZP糖蛋白组分的命名很多年来相当不一致，使用了数个标准，包括表观分子量，蛋白序列长度和序列相同性比较，其导致混淆的命名法。Harris等[(1994)DNAseq.96:829-834]建议了命名的统一系统，其中ZP基因根据它们编码的蛋白序列从最长到最短的长度次序进行命名。因此，在这些标准下，小鼠ZP基因落入次序ZP2，随后ZPl然后ZP3，引入新系统，其中ZP2变成ZPA，ZPl变成ZPB和ZP3变成ZPC。除此之外，更近的 Hughes 等[(1999) BBA-Gene Structure and Expressionl447:303-306]报道了已知小鼠ZPl基因的真正人直系同源物不是ZPB，但存在不同的人ZPl基因。现在普遍接受的是存在4种不同的(人)ZP糖蛋白家族ZP1，ZP2，ZP3和ZPB[参见Lefievre等(2004)Hum.Reprod.19:1580-1586] ο根据这一命名法，ZPB糖蛋白现在也称为ZP4。这一命名法例如用于 Uniprot/SWISSprot, ensEMBL, BLAST (NCBI)，SOURCE, SMART, STRING, PS0RT2, CDART, UniGene 和 SOSUI 数据库，都应用于 Bioinformatic Harvester (http: //harvester, embl.de)。据此，术语ZP1，ZP2, ZP3和ZP4在本文用于表示4种ZP糖蛋白家族，其中ZP2，ZP3和ZP4分别对应于根据Harris等所提命名法的ZPA，ZPC和ZPB。更具体来说，如本文使用的术语hZPl，hZP2，hZP3 和 hZP4 是指分别具有序列记录 SEQ ID N0.1, SEQ ID N0.2, SEQ IDN0.3和SEQ ID N0.4的多肽骨架及其等位基因变体的(糖)蛋白。
因此，可在人类中存在的ZP1，ZP2, ZP3和ZP4序列的等位基因变体也包括在相应的术语(h)ZPl，(h)ZP2, (h)ZP3和(h)ZP4中。等位基因变体特别包括源于单核苷酸多态性(SNP)的变体。SNP可以属于基因的编码序列，基因的非编码区，或位于基因间的基因间区域。编码序列内的SNP不是必需改变所产生蛋白的氨基酸序列。其中两种形式均产生相同多肽序列的SNP被称为同义的(有时称为沉默突变)一如果产生不同的多肽序列，它们是非同义的。对于被认作SNP的变体，它必须存在于至少1%的群体中。在本发明中，“等位基因变体”还可以包括源于(非同义)突变的多肽序列变体，即在小于1%的群体中发生的源于点突变，插入，缺失等等的多肽变体。因此，根据本发明，术语(h)ZPl，(h)ZP2, (h)ZP3和(h) ZP4包括由于少数序列改变而分别不同于 SEQ ID N0.1, SEQ ID N0.2, SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4 的 ZP(糖)蛋白。这种改变包括但不限于:一个或一些氨基酸变化，包括缺失(例如肽的截短形式)，插入和/或取代。通常，当如利用缺省参数通过程序GAP或BESTFIT是最优比对时，等位基因变体与上述序列具有至少某一百分比的序列相同性。GAP使用Needleman和Wunsch全局比对算法在它们的全长比对两条序列，将匹配数目最大化，并将缺口数目最小化。通常，使用GAP缺省参数，缺口产生罚分=8，缺口延伸罚分=2。对于蛋白来说，缺省评分矩阵是Blosum62 (Henikoff&Henikoff, 1992，PNAS89, 915-919)。序列比对和百分比序列相同性的评分可以使用计算机程序确定，如GCG Wisconsin Package, Versionl0.3,获自AccelrysInc., 9685Scranton Road, San Diego, CA92121-3752, USA。或者，百分比相似性或相同性可以通过在数据库如FASTA，BLAST等中检索确定。“等位基因变体”在本文中表示与SEQ IDN0.1, SEQ ID N0.2，SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4 中的任一个具有至少 90%，优选至少 95%，更优选至少98%，仍然更优选至少98%，仍然更优选至少99%，仍然更优选至少99.5%和最优选至少99.9%的氨基酸序列相同性。在本文及其权利要求书中，动词“包括”及其连接词用于其非限制性含义，表示包括接着该单词的事项，但不排除未具体提及的事项。此外，通过不定冠词“一个”或“一种”修饰成分不排除超过一种成分存在的可能性，除非上下文明确要求存在一种并且只存在一种成分。因此不定冠词“一个”或“一种”通常表示“至少一个/ 一种”。如本文使用的术语“前列腺癌”是指原发性前列腺肿瘤以及所述原发性前列腺肿瘤的转移(其可以位于身体的任何地方)。通常，为本发明的目的，术语“前列腺癌”或“前列腺肿瘤”与“肿瘤性前列腺疾病”或“前列腺新生物(neoplasm)”是同义的。这些术语被认为可以完全互换，尽管应注意对于除了前列腺之外的一些组织的疾病，术语“新生物”与“肿瘤”可能被认为不是完全相同的。根据本发明，术语“前列腺癌”通常不包括肿瘤前病症，如增生，组织变形，发育异常等。本发明的一个重要方面是发现ZP(糖)蛋白在前列腺(肿瘤)细胞上表达，这允许引发针对所述细胞的免疫应答。无论如何，因为不同的肿瘤可能具有不同的或改变的基因表达模式，也可能存在不表达ZP(糖)蛋白到任何显著程度的一些前列腺肿瘤，这将是技术人员能够理解的。因此，通常，本发明涉及表达ZP(糖)蛋白优选ZP3的前列腺癌或其转移的治疗。
本发明的方法可以构成初步治疗或在使用任何常规方法治疗患者期间或之后用做辅助疗法，所述常规方法包括例如外科手术，冷冻手术，放射治疗，包括近距放射疗法和体外放射(external beam radiation),高强度聚焦超声(HIFU),激素疗法或化疗,或其一些组合。但是公知的是许多常规抗癌治疗，特别是化疗和放射可能是高度免疫抑制的。因此技术人员应当清楚，当在这类治疗之后时，本方法的效力可能降低。本发明提供了适用于治疗原发性前列腺癌及其转移(其在本文中被认为构成“治疗性治疗”或“治愈性治疗”)以及预防前列腺癌的转移和/或复发的方法，任选的在其他治疗方法之后或与其组合，如前所述，其在本文中被认为构成“预防性治疗”。在本发明尤其优选的实施方案中，本发明的方法与以下方法联合应用:外科手术，激素疗法和/或用选自多西紫杉醇，贝伐佐单抗，thalidome, cabzitaxel,阿比特隆,替莫唑胺的物质的治疗。对于本发明的方法，待治疗的对象优选是人类男性。根据本发明，根据所述方法给人施用的“多肽源”可以是或包括蛋白或糖蛋白，所述蛋白或糖蛋白的消化物和/或其片段，其可以是纯化形式或包括在粗组合物内，优选生物学来源的，如原核或真核细胞系的裂解物，超声处理物或固定物。或者，所述多肽源可以是或包括化学合成的(多)肽或体外酶法产生的(多)肽，其可以是纯化形式或包括在粗组合物内。多肽源也可以是或包括来自RNA或DNA模板的编码所述多肽的核酸。RNA或DNA分子可以是裸DNA，优选包含在小泡或脂质体中，或可以包含在载体中。载体可以是本领域已知的任意(重组)DNA或RNA载体，优选是质粒，其中编码潜在抗原的基因与调节序列可操作地连接，提供编码信使的表达和翻译。载体也可以是任意DNA或RNA病毒，如但不限于腺病毒，腺相关病毒(AAV)，逆转录病毒，慢病毒，修饰的痘苗安卡拉病毒(MVA)或鸡痘病毒，或任意其他病毒载体(能够提供包括针对宿主的潜在表位的多肽的表达)。DNA载体可以是非整合的，如附加体复制载体或可以是通过随机整合或同源重组整合到宿主基因组的载体。包括人ZP2cDNA的质粒(该质粒适合于本发明使用)构建的实例可以参见Martinez等[(1996) Journal of Reproduction and Fertility Supplement50:35-41],其援引加入本文。 包括编码本发明多肽的基因的DNA分子，任选地嵌入载体如病毒或质粒，可以整合到宿主的基因组中。在本发明优选的实施方案中，这种宿主可以是微生物。优选这种重组微生物是分枝杆菌，例如结核分枝杆菌(M.tuberculosis)或牛分枝杆菌(M.bovis)物种，和最优选牛分枝杆菌卡介苗(BCG)，能够向宿主输送本发明的多肽或其片段。重组BCG和重组方法是本领域已知的,例如W02004094469。可以将这种重组微生物配制为活的重组和/或活的减毒疫苗，例如Jacobs等1987，Nature, 327(6122):532-5。载体也可以包括在细菌来源的宿主中，如但不限于活的减毒和/或重组的志贺氏菌或沙门氏菌。如本文使用的术语“表位”是指抗原的一部分，通常由肽确定，当其在体内生理相关环境中存在时，能够引发细胞或体液免疫应答。“T细胞表位”是指结合MHC分子并当存在于MHC分子中时被T细胞识别的肽或其部分。T细胞表位能够诱导细胞介导的免疫应答，通过异二聚体膜MHC分子的直接或间接呈递进行。简单来说，MHC分子优先结合称为“锚”残基的特定氨基酸残基(K.Falk等，Nature351:290-96 (1991))。这种特征允许鉴定任意已知肽序列内的I型和II型MHC识别表位。在本文中，术语“MHC限制性表位”与T细胞表位是同义的。如本文使用的，术语“I型MHC限制性表位”是指与I型MHC有关的被细胞毒性T淋巴细胞(也称为CD8+细胞或CTL)识别的肽序列。如本文使用的，术语“II型MHC限制性表位”是指被辅助T细胞(也称为⑶4+细胞或HTL)识别的肽。“B细胞表位”是抗原通常是肽的一部分，其能够结合免疫球蛋白的抗原结合位点，因此能够刺激体液应答而无需MHC分子中的呈递。如本文之前解释的，可用于本发明的多肽或编码所述多肽的核酸包括至少一个T细胞表位。但是本发明不排除还包括B细胞表位的多肽的使用。所述免疫原性多肽还可以包括多个T细胞表位以及任选存在的B细胞表位。当肽存在多个表位时，表位可以按照串联或嵌套或重叠构型定位，其中至少一个氨基酸残基被两个或更多个表位共享。本发明多肽优选包括一个或更多个MHC I型结合表位。如技术人员通常已知的，包括单肽表位的抗原只对治疗(小)亚组的患者(其表达能够结合该特定肽的MHC等位基因产物)有效。已经计算出，在人类中，包含受111^41，42，43，424和-87限制的(:11表位的疫苗将覆盖大部分人种情况的大约80%的个体。因此，如果本方法用于治疗人类男性，尤其优选的是所述多肽源包括有效量的一种或更多种不同多肽，其包括I个、更优选2个、最优选3个结合MHC I型的天然ZP表位，所述表位选自HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A24和HLA-B7限制性表位；或其同系物或编码所述一种或更多种多肽或其同系物的一种或更多种核酸序列。根据另一个实施方案，本发明多肽优选包括一个或更多个MHC II型结合表位。人类中最常发现的MHC II型等位基因产物包括HLA-DR1，-DR3, -DR4和-DR7。因此，优选所述多肽源包括有效量的一种或更多种不同多肽，所述一种或更多种不同多肽包括I个、更优选2个和最优选3个结合MHC II型的天然ZP表位，选自HLA-DRl、HLA-DR3、HLA-DR4和HLA-DR7限制性表位；或其同系物或编码所述一种或更多种多肽或其同系物的一种或更多种核酸序列。在另一个实施方案中，所述多肽源包括有效量的一种或更多种多肽、其同系物或编码所述多肽或其同系物的一种或更多种核酸序列，所述一种或更多种多肽包括一个或更多个MHC I型结合表位和一个或更多个MCH II型结合表位，如上文所述。甚至，更优选所述多肽源包括有效量的一种或更多种不同多肽或所述一种或更多种多肽的同系物或编码所述多肽或其同系物的一种或更多种核酸序列，所述一种或更多种不同多肽共同基本上包括全部的天然ZP糖蛋白所含的MHC I型和MHC II型结合表位。在一个实施方案中，所述多肽源包括有效量的一种或更多种不同免疫原性多肽或所述一种或更多种多肽的同系物或编码它们的一种或更多种核酸序列，所述一种或更多种不同多肽共同包括天然ZP糖蛋白所含MHC I型和MHC II型限制性结合表位的至少50%，更优选至少70%，仍然更优选至少80%，仍然更优选至少90%和最优选至少95%。在优选的实施方案中，所述多肽源包括有效量的免疫原性多肽或所述多肽的同系物或编码所述多肽或其同系物的核酸序列，所述多肽包括ZP糖蛋白(优选hZP)完整氨基酸骨架的至少50%，更优选至少70%，仍然更优选至少80%，仍然更优选至少90%和最优选至少 95%。在另一个尤其优选的实施方案中，所述多肽源包括有效量的ZP糖蛋白、优选hZP的多种不同重叠多肽片段、所述多肽的同系物或编码所述多肽或其同系物的一种或更多种核酸序列，所述不同重叠多肽片段长度为18-60个氨 基酸，优选18-45个氨基酸，并且它们共同包括所述ZP糖蛋白完整氨基酸骨架的至少50%，更优选至少70%，仍然更优选至少80%，仍然更优选至少90%和最优选至少95%。通常，在不同的连续16-80个氨基酸多肽片段之间的氨基酸重叠是至少7个氨基酸，优选至少8个，更优选至少9个，和最优选至少10个氨基酸。已经描述了针对最常见的MHC I型和II型等位基因的MHC结合基序。这些基序逐条列举了作为特定I型和II型MHC等位基因的MHC结合锚的氨基酸残基。使用考虑了 MHC结合锚以及肽的氨基酸序列的基于计算机的复杂算法来预测和定量肽/MHC相互作用的结合亲和力。因此，根据输入的透明带(糖)蛋白的已知氨基酸序列，这些算法列出了所有潜在的T细胞表位，每一个都具有其对应的预测结合分数。用于上述目的的公知生物信息学工具包括HLA_BIND, SYFPEITHI, NetMHC和TEPIT0PE2000 [参见参考文献1_6]。或者，熟练技术人员利用标准实验(Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience2004)能够通过实验确定HTL和CTL结合表位。在一些情况下，已经观察到相同的肽可以结合数个MHC I或II等位基因产物。在一个实施方案中，在当前方法中使用这种“混杂的(promiscuous) ”MHC结合肽是尤其优选的。在一个实施方案中，本发明提供了一种在人类男性中诱导针对天然透明带糖蛋白的初次免疫应答的方法，其中所述方法包括给所述人施用多肽源的步骤，所述多肽包括I型MHC-和/或II型MHC-限制性天然透明带T细胞表位或其免疫学活性变体，其中所述多肽源包括有效量的免疫原性多肽或编码所述免疫原性多肽的核酸序列，所述免疫原性多肽选自透明带(糖)蛋白，其同系物，以及所述(糖)蛋白和其同系物的免疫学活性片段。根据优选的实施方案，所述透明带(糖)蛋白选自2 1，2 2，2 3和2 4，更优选2 2和ZP3，最优选ZP3。根据一个尤其优选的实施方案，所述多肽源包括有效量的免疫原性多肽或编码所述免疫原性多肽的核酸序列，所述免疫原`性多肽选自人透明带(糖)蛋白，其同系物以及这些(糖)蛋白和其同系物的免疫学活性片段。优选所述人透明带(糖)蛋白(hZP(糖)蛋白)选自hZPl，hZP2，hZP3和hZP4。根据甚至更优选的实施方案，所述(糖)蛋白选自hZP2和hZP3，更优选所述(糖)蛋白是hZP3。术语“其免疫学活性片段”在本领域通常被理解为指包括至少一个表位的多肽抗原的片段，这表示所述片段至少包括来自所述多肽抗原序列的4，5，6，7或8个连续氨基酸。根据本发明，所述片段包括至少一个T细胞表位。因此，本发明的“免疫学活性片段”包括来自ZP (糖)蛋白抗原或其同系物或类似物的序列的至少8，9，10，11，12，13，或14个连续氨基酸。仍然更优选所述片段包括CTL和T辅助表位。但是最优选，所述片段是需要被抗原呈递细胞加工的肽，即具有至少约18个氨基酸长度的片段，这18个氨基酸不必须是来自所述多肽抗原的连续序列。如本文使用的术语“其同系物”是指多肽，其通过少数改变不同于天然存在的多肽，但维持天然存在形式的基本多肽和侧链结构。这种改变包括但不限于:一或一些氨基酸侧链的改变；一或一些氨基酸的改变，包括缺失(例如，肽的截短形式)插入和/或取代；一个或一些原子立体化学的改变；添加的N-或C-端氨基酸；和/或次级衍生化，包括但不限于:甲基化，糖基化，磷酸化，乙酰化，豆蘧酰化，异戊烯化，棕榈酸化，酰胺化和/或添加糖基化磷脂酰肌醇。如本文使用的，同系物或类似物与天然存在的多肽相比具有增强的或基本上类似的功能性。同系物在本文中被理解为包括免疫原性多肽，当最佳比对时，如通过利用缺省参数的程序GAP或BESTFIT，所述免疫原性多肽与本发明天然存在的ZP3多肽具有至少70%，优选至少80%，更优选至少90%，仍然更优选至少95%，仍然更优选至少98%和最优选至少99%的氨基酸序列相同性，并且仍然至少能够引发从其获得的免疫应答。通常，使用GAP缺省参数，缺口产生罚分=8，缺口延伸罚分=2。对于蛋白来说，缺省评分矩阵是Blosum62 (Henikoff&Henikoff, 1992, PNAS89, 915-919)。序列比对和百分比序列相同性的分数利用计算机程序确定，如GCG Wisconsin Package, Versionl0.3,获自 Accelrys Inc., 9685ScrantonRoad, San Diego, CA92121-3752，USA。或者，通过检索数据库如FASTA，BLAST等来确定百分比相似性或相同性。根据本发明的实施方案，如本文之前限定的免疫原性多肽是糖基化的。不希望受到理论约束，假设认为这些多肽的糖基化增加其免疫原性。因此，根据优选的实施方案，如本文之前限定的免疫原性多肽是糖基化的，具有范围10_80wt%(基于糖蛋白或糖基化多肽的总重量)的碳水化合物含量。更优选所述碳水化合物含量范围是15_70wt%，仍然更优选20-60wt%o在另一个实施方案中，所述糖基化免疫原性多肽包括类似于相应人透明带糖蛋白(或其片段)的糖基化模式。假设认为这甚至进一步增加所述多肽的免疫原性。因此，在一个实施方案中，优选所述免疫原性多肽包括类似于相应人ZP糖蛋白(片段)的糖基化模式。然而，如技术人员所知，用于产生免疫原性多肽的重组技术可能产生未被糖基化或包含不同糖基化模式的多肽，这例如取决 于宿主细胞的选择，将在下文解释。技术人员将清楚，具有不同于相应hZP(片段)的糖基化模式的重组多肽的使用也完全在本发明的范围内，并且例如为了实用原因，在一些实施方案中可能是优选的。所述免疫方法优选包括施用免疫原性活性多肽片段源，所述多肽片段选自如本文之前限定的透明带蛋白片段和/或其同系物，所述多肽片段包括显性CTL和/或HTL表位，并且所述片段的长度为18-45个氨基酸。如W002/070006所述，观察到具有18-45个氨基酸长度的肽提供优良的免疫原性特性。肽可以有利地是化学合成的，可以任选是(部分)重叠的和/或还可以连接到其他分子，肽或蛋白。如PCT/NL03/00929和Welters等(Vaccine.2004Dec2; 23 (3):305-11)所述，还可以将肽融合形成合成蛋白。还可以有利的向肽的氨基端或羧基端添加化学部分或另外的(修饰的或D-)氨基酸以增加肽的稳定性和/或降低肽的生物可降解性。为了提高免疫原性，可以连接免疫刺激部分，例如通过脂化或糖基化。为了增强肽的溶解度，可以添加带电或极性氨基酸以增强溶解度和增加体内稳定性。为了免疫目的，本发明的上述免疫原性多肽还可以与蛋白融合，所述蛋白如但不限于破伤风毒素/类毒素，白喉毒素/类毒素或其他载体分子。本发明的多肽还可以有利地与热休克蛋白融合，如重组内源(鼠)gp96 (GRP94)作为免疫显性肽的载体，如描述于(参考文献:Rapp UK 和 Kaufmann SH, Int Immunol.2004Apr; 16 (4): 597-605; Zugel U, InfectImmun.2001 Jun; 69 (6):4164-7)或与 Hsp70 的融合蛋白(Triebel 等;W09954464)。本发明所述免疫原性(多)肽的单个氨基酸残基可以通过肽键或肽键模拟物掺入肽。本发明的肽键模拟物包括本领域技术人员公知的肽骨架修饰。这种修饰包括酰胺态氮、α-碳、酰胺羰基的修饰，酰胺键的完全替换，延伸，缺失或骨架交叉连接。一般参见Spatola,Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol.VII (Weinstein ed.，1983)。已知数种肽骨架修饰，这些包括，Ψ [CH2S], Ψ [CH2NH], Ψ [CSNH2], Ψ [NHCO], Ψ [COCH2]和Ψ[(Ε)或(Z) CH=CH]。上文使用的命名法是根据上文Spatola的建议。在本文中，Ψ表示酰胺键的缺失。取代酰胺基的结构在括号内说明。还可以将氨基酸模拟物掺入多肽。本文使用的“氨基酸模拟物”是除了天然存在的氨基酸以外的部分，其在结构和功能上作为本发明多肽中氨基酸的替代物。这个部分如果不干扰肽引发针对天然ZP T细胞表位的免疫应答的能力，其则作为氨基酸残基的替代物。氨基酸模拟物可以包括非蛋白氨基酸，如β-，Y-, S-氨基酸，β-，Y-, δ--亚氨基酸(如哌啶-4-羧酸)以及L- α -氨基酸的许多衍生物。大量合适的氨基酸模拟物是本领域技术人员已知的，它们包括环己基丙氨酸，3-环己基丙酸，L-金刚烷基丙氨酸，金刚烷乙酸(adamantylacetic acid)等。Morgan 和 Gainor, (1989) Ann.Repts.Med.Chem.24:243-252讨论了适用于本发明肽的肽模拟物。根据优选的实施方案，所述方法包括施用组合物和至少一种赋形剂，所述组合物包括一种或更多种本文之前限定的免疫原性多肽。赋形剂是药学领域公知的，可以例如参见教科书如 Remmington’s pharmaceutical sciences, Mack Publishing, 1995。所述用于免疫的方法还可以包括施用优选共同施用至少一种佐剂。佐剂可包括免疫领域已知的任意佐剂，可以利用教科书如Current Protocols in Immunology, WileyInterscience, 2004 来挑选。佐剂在本文中旨在包括任意物质或化合物，当使用时，其与抗原组合来免疫人或动物，刺激免疫系统，从而引起、增强或促进针对抗原的免疫应答，优选不产生针对佐剂自身的特异性免疫应答。与相同条件但没有佐剂的情况下产生的针对指定抗原的免疫应答相t匕，优选所述佐剂将针对所述抗原的免疫应答增强至少1.5倍，2倍，2.5倍，5倍，10倍或20倍。本领域提供了为确定动物或人群中由佐剂产生的针对指定抗原的免疫应答的统计平均增强(相对于相应对照组)的检验。佐剂优选能够增强针对至少两种不同抗原的免疫应答。本发明的佐剂通常是对人来说外源的化合物，从而排除了对人来说内源的免疫刺激性化合物，如例如白介素，干扰素及 其他激素。大量佐剂是本领域技术人员公知的。合适的佐剂包括例如弗氏不完全佐剂，明矾，磷酸铝，氢氧化铝，N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)，N-乙酰基-正-胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(CGP11637，称为正-MDP)，N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺酰基-L-丙氨酸-2-(1’ -2’ - 二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基-磷酰氧基)_乙胺(CGP19835A，称为MTP-PE)，DDA (2双十八烷基二甲基溴化铵)，polyIC，Poly-A-poly-U, RIBI , GERBU , Pam3 , CarbopoI , Specol , Titermax ，破伤风类毒素，白喉类毒素，脑膜炎球菌外膜蛋白，白喉蛋白CRM197。优选的佐剂包括被抗原呈递细胞上存在的Toll样受体(TLR)识别的配体。TLR识别的各种配体是本领域已知的，包括例如脂肽(参见W004/110486)，脂多糖，肽聚糖，脂磷壁酸，脂阿拉伯甘露聚糖，脂蛋白(来自支原体或螺旋体)，双链RNA (poly 1: C)，未甲基化的DNA，鞭毛蛋白，包含CpG的DNA，和咪唑并喹啉，以及具有化学修饰的这些配体的衍生物。用于免疫的所述方法还可以包括施用优选共施用⑶40结合分子以增强CTL应答，从而增强本发明方法和组合物的治疗功效。CD40结合分子的使用描述于W099/61065，援引加入本文。CD40结合分子优选是抗体或其片段或CD40配体或其变体，可以单独添加或包含在本发明的组合物内。为了治疗应用，给患有前列腺肿瘤以及可能患有其转移的患者或已接受治疗前列腺肿瘤的其他方法(例如本文前述的常规方法之一)的患者施用一定量的所述免疫原性多肽或编码它们的核酸序列或包括这些多肽或编码它们的核酸序列的组合物，所述量足以诱导针对天然ZP糖蛋白和表达ZP糖蛋白的组织细胞的初次自身免疫应答。足以实现该目的的量被称为“治疗或“预防-有效量”。这种有效剂量将取决于多种因素，包括疾病和患者的一般健康状态。因此可以确定给药方案，并由经过训练的医务人员进行调整，以提供最佳治疗或预防功效。在所述方法中，通常以约I μ g/kg患者体重或更多的剂量施用所述一种或更多种免疫原性多肽至少一次。剂量常常大于10 μ g/kg。根据本发明，剂量范围优选是I μ g/kg到 lmg/kg。根据一个优选的实施方案，典型的给药方案包括施用1-1000 μ g/kg,更优选10-500 μ g/kg，仍然更优选10-150 μ g/kg的剂量，每周一次、两次或三次，持续一周、两周、三周、四周或五周的时间。根据优选的实施方案，每周一次施用10-100 μ g/kg,持续一周或两周的时间。所述方法优选包括通过肠胃外或口服途径(优选肠胃外途径)施用所述免疫原性多肽和包括它们的组合物。本发明的另一个实施方案包括离体(ex vivo)给来自患者血液的单个核细胞(尤其是从其分离的DC)施用包括所述免疫原性肽的组合物。可以使用便于收集DC的药剂，如Progenipoietin.TM.(Monsanto , St.Louis, M0.)或 GM-CSF/IL-4。在用妝刺激 DC 并洗漆除去未结合的肽后，将DC重新输注入患者。在该实施方案中，提供包括肽刺激的DC(在它们的表面HLA分子中呈现刺激的肽表位)的组合物。使用离体肽刺激DC诱导免疫应答的方法是技术人员公知的。本发明的另一个方面涉及包括本文之前所述的多肽源作为活性成分的药物制剂。更具体地，药物制剂包括一种或更多种上述选自ZP蛋白的免疫原性多肽、其同系物和所述ZP蛋白及其同系物的片段作为活性成分，或可选的上文限定的基因治疗载体。根据第一个实施方案，提供包括一种或更多种本发明免疫原性多肽的药物制剂。药物组合物中所述多肽的浓度可以广泛变化，即，从按重量计小于约0.1%，通常按重量计至少约1%，到按重量计20%或更高。除了所述活性成分外，组合物优选至少包括药学上可接受的载体。药学载体可以是任意相容的、无毒物质，适于将免疫原性多肽或基因治疗载体输送给患者。对于多肽来说，可以使用无菌水，醇，脂肪，蜡，和惰性固体作为载体。还可以将药学上可接受的佐剂，缓冲剂，分散剂等掺入所述药物组合物。根据尤其优选的实施方案，所述药物组合物包括佐剂，如本文之前更详细限定的。用于掺入所述组合物的佐剂优选选自被抗原呈递细胞上Toll样受体(TLR)识别的配体，包括脂肽(参见例如W004/110486)，脂多糖，肽聚糖，脂磷壁酸，脂阿拉伯甘露聚糖，脂蛋白(来自支原体或螺旋体)，双链RNA (poly 1:C),未甲基化的DNA，鞭毛蛋白，包含CpG的DNA，和咪唑并喹啉，以及具有化学修饰的这些配体的衍生物。本领域技术人员能够确定掺入所述药物制剂的这些佐剂中任一个的精确量，以便它们具有足够的免疫原性。根据另一个优选的实施方案，所述药物制剂包括一种或更多种其他成分(如本文之前解释的，用于增强CTL免疫)。根据尤其优选的实施方案，所述药物制剂包括CD40结合分子。产生包括多肽的药物组合物的方法描述于美国专利号5，789，543和6，207，718。优选的形式取决于预期的施用方式和治疗应用。对于基因治疗，可将载体掺入药物组合物，所述载体例如质粒，噬菌粒，噬菌体，粘粒，病毒，逆转录病毒，附加体或转座因子，包括编码本文之前所述免疫原性多肽的核酸序列。可以通过例如静脉注射，局部施用(参见美国专利号5，328，470)或立体定向注射(参见例如Chen等，PNAS91:3054-3057, 1994)将基因治疗载体递送给对象。基因治疗载体的药物组合物可以包括在可接受稀释剂中的基因治疗载体，或可以包括缓释基质(其中包埋有基因输送载体)。或者，当从重组细胞整体产生完整的基因输送载体(例如逆转录病毒载体)时，药物制剂可以包括产生所述基因输送系统的一种或更多种细胞。所述免疫原性多肽优选肠胃外施用。用于肠胃外施用的制剂的多肽必须是无菌的。在冻干和重建之前或之后，通过无菌滤膜过滤可以方便实现灭菌。用于施用多肽的胃肠外途径根据已知的方法进行，例如通过静脉内，腹膜内，肌内，动脉内，皮下或病灶内途径注射或输注。通过输注或推注连续施用所述多肽。用于静脉内输注的典型组合物可被制备为包含10到50ml无菌0.9%NaCl或5%葡萄糖，任选添加20%白蛋白溶液和10 μ g到50mg(优选50 μ g到IOmg)的所述多肽。用于肌肉注射的典型药物组合物将制备为包含例如1-1Oml无菌缓冲水和10 μ g到50mg(优选50 μ g到IOmg)的本发明多肽。用于制备肠胃外施用的组合物的方法是本领域公知的，更详细的描述于多种来源，包括例如Remington’sPharmaceutical Science (15th ed., Mack Publishing, Easton, PA, 1980)(为了全部目的其全文援引加入)。对于口服施用，可以固体剂型(如胶囊，片剂，和粉末)，或液体剂型(如酏剂，糖浆，和悬液)施用活性成分。活性成分可以与无活性成分和粉末载体(如葡萄糖，乳糖，蔗糖，甘露醇，淀粉，纤维素或纤维素衍生物，硬脂酸镁，硬脂酸，糖精钠，滑石，碳酸镁等)一起包裹在明胶胶囊中。可 以添加以提供所需颜色，味道，稳定性，缓冲能力，分散或其他已知所需特征的额外无活性成分的实例是红色氧化铁，硅胶，十二烷基硫酸钠，二氧化钛，可食用的白色墨水等。类似的稀释剂可用于制备压制片剂。片剂和胶囊可以制备为缓释产品，以在数小时期间内提供药物的连续释放。压制片剂可以是糖包衣或薄膜包衣的，以掩盖任何不好的味道并保护片剂免受环境影响，或肠包衣用于胃肠道的选择性分解。用于口服施用的液体剂型可以包含着色剂和香料以增加患者接受度。可以利用重组技术制备用于本发明的免疫原性多肽，其中在合适的宿主细胞中表达编码感兴趣多肽的核苷酸序列，如描述于Ausubel等，"Current Protocols inMolecular Biology",Greene Publishing and ffiley-1nterscience, New York(1987)和 Sambrook 和 Russell(2001)"Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rdedition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NewYork;这两篇文献都在此全文援引加入。还可参见Kunkel (1985) Proc.Natl.Acad.Sc1.82:488 (描述位点定向诱变)和 Roberts 等(1987) Nature328:731-734 或 Wells, J.A，等(1985) Gene34:315(描述盒诱变)。使用杆状病毒制备重组人ZPA和ZPB的实例可参见Martinez等的上述刊物[(1996)Journal of Reproduction and Fertility Supplement50:35-41]。
使用细菌(大肠杆菌(E.coli)),酵母细胞(巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)),昆虫细胞(苜猜银纹夜蛾(Autographa californica)核多角体病毒)和中国仓鼠卵巢细胞(CHO)作为表达系统制备重组人ZPA和ZPB的实例公开于Harris等[(1999)Protein Expression and Purificationl6:298-307],其援引加入。因此本发明的一个方面涉及包括核酸分子的载体，所述核酸分子编码本文之前限定的所述免疫原性多肽。优选所述载体是复制型载体，包括复制起点(或自动复制序列)，确保载体在对载体合适的宿主中增殖。或者，所述载体能够整合入宿主细胞基因组，例如通过同源重组或其他方法。尤其优选的载体是表达载体，其中编码上述多肽的核苷酸序列与启动子(能够在载体的宿主细胞中指导表达编码序列)可操作的连接。如本文使用的，术语“启动子”是指核酸片段，其功能是控制一种或更多种基因的转录，位于相对基因转录起始位点的转录方向的上游，可以通过DNA依赖性RNA聚合酶结合位点、转录起始位点和任意其他DNA序列(包括但不限于转录因子结合位点，阻抑物和激活物蛋白结合位点，和本领域技术人员已知能够直接或间接调节启动子的转录量的任意其他核苷酸序列)的存在从结构上鉴定。“组成型”启动子是在大部分生理和发育条件下都具有活性的启动子。“诱导型”启动子是根据生理或发育条件进行调节的启动子。“组织特异性”启动子只在特定类型的分化细胞/组织中有活性。表达载体允许利用重组技术制备上述免疫原性多肽，其中编码感兴趣多肽的核苷酸序列在合适细胞中表达，例如培养的细胞或多细胞生物体的细胞，如描述于Ausubel 等，"Current Protocols in Molecular Biology",Greene Publishing andffiley-1nterscience, New York(1987)和 Sambrook 和 Russell (2001，上文)；这两篇文献均全文援引加入。还可参见Kunkel (1985)Proc.Natl.Acad.Sc1.82:488 (描述位点定向诱变)和 Roberts 等(1987) Nature328:731-734 或 Wells, J.A.，等(1985) Gene34:315 (描述盒诱变)。通常，编码 所需多肽的核酸用于表达载体。短语“表达载体”通常是指核苷酸序列，其能够在相容这种序列的宿主中实现基因的表达。这些表达载体通常包括至少合适的启动子序列和任选存在的转录终止信号。如本文所述，还可以使用实现表达必需的或有益的其他因子。将编码多肽的DNA整合入DNA构建体，所述DNA构建体能够导入体外细胞培养物并在其中表达。具体来说，DNA构建体适于在原核宿主中复制，如细菌，例如大肠杆菌，或可以导入培养的哺乳动物，植物，昆虫，例如Sf9，酵母，真菌或其他真核细胞系。制备用于导入特定宿主的DNA构建体通常包括被宿主识别的复制系统，编码所需多肽的预期DNA片段，以及与多肽编码片段可操作连接的转录和翻译启始和终止调节序列。当一 DNA片段被置于与另一 DNA片段功能性关联时，该DNA片段是“可操作连接的”。例如，如果其刺激序列转录，则启动子或增强子是与编码序列可操作的连接。如果信号序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其是可操作的连接到编码多肽的DNA。通常，可操作连接的DNA序列是连续的，就信号序列来说,是连续的并处于可读相(reading phase)。但是，增强子无需与编码序列(增强子控制其转录)是连续的。通过在方便的限制性位点或在插入其的衔接头(adapters)或接头(linkers)处连接实现连接。合适启动子序列的选择通常取决于挑选用于表达DNA片段的宿主细胞。合适启动子序列的实例包括本领域公知的原核和真核启动子(参见例如Sambrook和Russell, 2001,上文)。转录调节序列通常包括宿主识别的异源增强子或启动子。合适启动子的选择取决于宿主，但启动子如trp，Iac和噬菌体启动子，tRNA启动子和糖解酶启动子是已知和可用的(参见例如Sambrook和Russell, 2001,上文)。表达载体包括复制系统,可以使用转录和翻译调节序列以及用于多肽编码片段的插入位点。细胞系和表达载体的可使用组合的实例描述于 Sambrook 和 Russell (2001，上文)和 Metzger 等(1988)Nature334:31-36。例如，合适的表达载体可以在以下中表达:酵母，例如酿酒酵母(S.cerevisiae),例如，昆虫细胞，例如Sf9细胞，哺乳动物细胞，例如CHO细胞和细菌细胞，例如大肠杆菌。因为原核生物不具有糖基化必需的细胞器，原核生物产生的多肽不具有碳水化合物侧链。真核生物具有糖基化机制，但酵母细胞将产生不同于哺乳动物细胞的糖基化模式。因此优选使用产生最“自然”糖基化模式的表达系统。为此，哺乳动物细胞是最优选的。具有类似于人的糖基化机制的细胞系是特别有用的，因为假设认为具有类似于相应人透明带糖多肽的糖基化模式的本发明抗原具有 增强的免疫原性。合适的细胞系包括CHO细胞，参见例如美国专利号5，272，070，尤其是人卵巢或滤泡细胞系，参见W099/42581。体外诱变和突变蛋白的表达通常描述于Ausubel等(1987,上文)以及Sambrook和Russell (2001,上文)。还可参见Kunkel (1985,上文；描述位点定向诱变)和Roberts等(1987，上文；描述盒诱变)。另一种制备所述免疫原性多肽的方法是使用体外转录/翻译系统。将编码多肽的DNA克隆入上文描述的表达载体。然后在体外转录和翻译表达载体。翻译产物可以直接使用或首先纯化。尽管由于微粒体的固有存在，可以发生一些翻译后修饰，但是体外翻译产生的多肽通常不包含体内合成多肽上存在的翻译后修饰。通过体外翻译合成多肽的方法描述于例如Berger&Kimmel, Methods in Enzymology, Volumel52, Guide to Molecular CloningTechniques, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1987 (其全文援引加入)。因此本发明的另一方面涉及包含上述载体的宿主。宿主细胞可以是如上所述的原核或真核宿主细胞。宿主细胞可以是适于在液体或固体培养基中培养的宿主细胞。或者，宿主细胞是作为多细胞生物体(如转基因植物或动物，优选非人动物)的一部分的细胞。本发明的另一个方面涉及产生如上所述的免疫原性多肽的方法。该方法包括在有助于多肽表达的条件下培养上述宿主细胞的步骤。任选地，该方法可以包括回收所述多肽。可以例如通过标准蛋白纯化技术(包括本领域已知的各种层析方法)从培养基回收所述多肽。本发明的另一个方面涉及在其体细胞和生殖细胞中包括上述载体的转基因动物。转基因动物优选是非人动物。用于产生转基因动物的方法例如描述于W001/57079及其引用的参考文献中。这种转基因动物可用于产生上述多肽的方法，所述方法包括从包括载体的转基因动物或其雌性后代回收体液的步骤，其中所述体液包含多肽，并且任选地，从所述体液回收多肽。这种方法还描述于W001/57079及其引用的参考文献中。包含多肽的体液优选是血液，或更优选是乳汁。本发明的另一个方面涉及在其细胞中包括上述载体的转基因植物。用于产生转基因植物的方法例如描述于U.S.6，359，196及其引用的参考文献中。这种转基因植物可用于产生上述多肽的方法，所述方法包括回收转基因植物(在其细胞中包括载体)的一部分或这种转基因植物后代的一部分的步骤，其中所述植物部分包含多肽，并且任选地，从所述植物部分回收多肽。这种方法还描述于U.S.6，359，196及其引用的参考文献中。在下列实施例中进一步描述了本发明，但其不是旨在以任意方式限制本发明的范围。
实施例实验1:ZP3在人前列腺癌样品中的表达使用免疫组化法确定人前列腺肿瘤组织中ZP3的表达。从荷兰的病理学会获得来自不同患者的前列腺肿瘤组织样品。针对ZP3 (IHC&IF)，alpha-甲基-CoA-消旋酶AMACR(前列腺癌IHC标记，全部前列腺癌的85%对它们染色)和细胞角蛋白5/6 (针对基底细胞)，将总共16个人前列腺癌样品和来自其他不同来源的6个其他前列腺肿瘤样品进行染色。利用人ZP3抗体，针对人重组ZP3的兔多克隆抗体和山羊多克隆抗体实现免疫组化测定。使用正常前列腺组织样品作为对照。将未成熟的卵母细胞(从用于IVF的卵巢刺激后的窦滤泡采集)染色作为阳性对照。此外，使用正常肝和正常睾丸组织的样品作为阴性对照。下列IHC方案用于所有样本。第I 天1.将载玻片在57° C温育30分钟。2.去石蜡化和水合:`a) 二甲苯-2X5 分钟，b)纯 EtOH - 2x5 分钟，c) 96%Et0H - 2x5 分钟，d) 70%Et0H - 2x5 分钟，e) 50%Et0H - 2x5 分钟，f)dH20 - 1x5 分钟，g)PBS_lx5 分钟。3.抗原修复:a) IOmM柠檬酸钠缓冲液(pH6.0)在微波炉中15分钟，b)冷却 15-20 分钟，c)PBS_3x5 分钟。4.内源过氧化物酶淬灭(室温黑暗中，于甲醇中的3%H202 -对于石蜡切片推荐10分钟)。5.PBS-3x5 分钟。6.封闭-于TPBS中的NGS15% - 90分钟(室温黑暗/湿润小室中)。7.一抗1:250与于TPBS中的5%NGS -过夜/冷藏室/湿润小室)。对于阳性对照(WT卵巢)，使用1:600稀释的一抗。对于肿瘤切片，抗体被进一步浓缩一 1:250。第2天
8.PBS-3x5 分钟。9.二抗-山羊抗兔(1: 1000)与于TPBS中的5%NGS - 90分钟(室温/湿润小室)。10.PBS - 3x5 分钟。11.与在PBS中1:50稀释的ABC-Reagent温育(60分钟/室温于黑暗/湿润小室中)。12.PBS - 3x5 分钟。13.DBA14.Aqua - 2x5 分钟。15.苏木精-60 秒。16.Aqua - 2x5 分钟。17.脱水:a) 50%Et0H - 2x5 分钟b) 70%Et0H - 2x5 分钟
c) 96%E t0H - 2x5 分钟d)纯 EtOH - 2x5 分钟e) 二甲苯-2x5分钟(超澄清)18.用 DPX 封固。每次在盖玻片(其通常用于IHC)上种植细胞(50.000)。在24小时或更短时间后(取决于细胞系)，用PBS清洗细胞，并用4%PFA固定(15分钟)。然后用PBS再次洗涤细胞(3x5分钟)。洗涤后用IOOmM NH4Cl封闭自身荧光(3分钟室温)。下一步，将15%NGS与于PBS中的5%BSA和0.l%Triton X-100组合(90分钟/室温/湿润小室)。一抗用于T-PBS中的5%NGS以1:200(可以更高)稀释(过夜/冷藏室/湿润小室)。与一抗温育后，洗涤细胞(3x5分钟，T-PBS)，并与1:100稀释的二抗4161& 1110技94(山羊抗兔)温育(90分钟/室温/湿润小室)。最后洗涤细胞(3x5分钟；PBS)并复染(DAP1-Ultra Cruz)。溶液和试剂 二甲苯(或 Histoclear).乙醇.蒸馏水.苏木精.IOX PBS (磷酸缓冲盐水):.0.58M 磷酸氢二钠(Na2HPO4)，0.17M 磷酸二氢钠(NaH2PO4)，0.68M NaCl。为制备I 升 IOX PBS:将 82.33gNa2HP04*4H20, 23.45g NaH2P04*H20 和 40g NaCl 混合。调节 pH 到7.4。.IOmM柠檬酸钠缓冲液:为制备I升，将2.94g柠檬酸钠添加到I升dH20。调节pH到6.0.1%过氧化氢(氧化)缓冲液:50ml: 15 μ I Triton-X, IOml 甲醇，40mll%H202 (终浓度) 封闭溶液:
10%FBS 和 10%BSA，于 PBS 中.ABC 试剂(Vectastain ABC 试剂盒，Vector laboratories, Inc., Burlingame, CA):在使用前30分钟根据制造商说明书制备.DAB 试剂:按照制造商说明书使用。在阳性对照中，抗体检测到环绕人卵母细胞的ZP中的蛋白(结果未显示)。ZP3蛋白还存在于卵母细胞细胞质中。当去除一抗时，在前列腺肿瘤组织样品的切片中没有检测到阳性染色(结果未显示)。利用每种ZP抗体，在肝组织(结果未显示)，正常前列腺或正常人睾丸(分别是图3C和3D)中没有观察到阳性染色。在前列腺肿瘤样品中，通过对ZP3染色阳性的组织区域确认了 ZP3的存在，在不同患者中获得的样品间强度不同(图3A和3B)。总体来说，ZP3阳性染色与前列腺癌的前列腺癌标记alpha-甲基-CoA-消旋酶(AMACR)严格相关。对ZP3表达染色阳性的这些肿瘤可以通过利用本发明的ZP3抗原的免疫来治疗。实施例2:人前列腺癌细胞系(PC-)中ZP3的表达使用标准RT-PR和Western印迹电泳技术在mRNA (A)和蛋白水平⑶证实了人前列腺癌细胞系(PC-)和前列腺癌中透明带3蛋白(ZP3)的表达。如预期，观察到RT-PR产物(183bp)和western印迹电泳(55kDa)的单一条带(图4A和B)。来自正常人卵巢(hOV)和睾丸(hTE)的总mRNA和蛋白分别被用作阳性和阴性对照。利用山羊抗兔IgG-AlexaFlour594(红色)，通过免疫荧光显色证实了 PC-3细胞中ZP3的细胞质定位(图5A)。通过RT-PCR筛选对来自记分为Gleason6_9的前列腺癌样品(n=10)的总mRNA确认了相当于ZP3片段的DNA产物(183bp)的存在(图6)。此外，检查了前列腺样品中雄激素受体(AR)和促黄体激素释放激素受体(LHR)表达(它们在前列腺癌的生长(AR)和进展(AR和LHR)中仍是重要的)的存在(Heinlein和Chang7 ；Pinski等8)。附图描述

图1:人前列腺腺癌(A，B)，正常前列腺(C)和正常人睾丸⑶的组织学(HE)。用箭头标记癌症腺体。图2:人前列腺腺癌(A，B)，正常前列腺(C)和正常人睾丸⑶中双α -甲基丙烯辅酶A消旋酶(AMACR(红色))和细胞角蛋白5/6(CK5/6(褐色))免疫组化染色。进行双免疫染色以作为组织学的补充标记，来正确鉴定前列腺样本(Trpkov等9)。前列腺的分泌性癌上皮细胞显示对AMACR的强环绕细胞质细颗粒红色染色(A，B，箭头)并对CK5/6阴性(对正常前列腺的基底上皮细胞阳性)。在正常前列腺上皮(对AMACR(L)阴性)中观察到基底细胞的典型CK5/6暗褐色染色。用作双免疫染色阴性对照的人睾丸切片对AMACR和CK5/6均显示阴性⑶。图3:人前列腺腺癌(A，B)，正常前列腺(C)和正常人睾丸(D)的单ZP3免疫组化染色(褐色)。在前列腺癌的癌症腺体/组织(对A MACR染色阳性，对CK5/6 (A, B)染色阴性)中观察到ZP3的阳性和特异性细胞质染色。类似于AMACR但不同于CK5/6 (C)，正常人前列腺对ZP3不染色。人睾丸切片对ZP3是阴性的(D)。图4:人前列腺癌细胞系(PC-)和前列腺癌中在mRNA (A)和蛋白水平⑶的透明带3蛋白(ZP3)的表达。图5:PC-3细胞中ZP3细胞质定位的免疫荧光显色。图6:通过RT-PCR检测来自评分为Gleason6-9的前列腺癌样品(n=10)的总mRNA以确定存在ZP3，雄激素受体(AR)和促黄体激素释放激素受体(LHR)。参考文献1.Parker, K.C.，M.A.Bednarekj and J.E.Coligan.1994.Scheme for rankingpotential HLA_A2binding peptides based on independent binding of individualpeptide side-chains.J.1mmunol.152:163.HLA—BIND(http://bimas.cit.nih.gov/molbio/hla—bind/)2.Rammenseej Friedej Stevanovicj MHC ligands and peptide motifs: 1st Iisting，Immunogenetics41, 178-228，1995;SYFPEITHI (http://www.syfpeith1.de/)and RammenseejBachmannjStevanovic:MHC ligands and peptide motifs.LandesBiosciencel997 (International distributor-except North America:Springer VerlagGmbH&C0.KGjTiergartenstr.17，D-6912IHeidelberg3.Buus Sj Lauemol Ier SLj Worning P，Kesmir C，Frimurer T，CorbetS，Fomsgaard A，Hilden Jj Holm A，Brunak S.Sensitive quantitative predictionsof peptide-MHC binding by a’Query by Committee’artificial neural networkapproach, in Tissue Antigens.，62:378-84，2003;NetMHC (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)4.Nielsen M，Lundegaard Cj Worning P，Lauemoller SL，Lamberth K，BuusS，Brunak S，Lund 0., Reliable prediction of T—cell epitopes using neural networkswith novel sequence representations.Protein Sc1., 12:1007-17,2003.
5.1mproved prediction of MHC class I and class II epitopes using anovel Gibbs sampling approach, Nielsen Mj Lundegaard Cj Worning Pj Hvid CS，LamberthKj Buus Sj Brunak S，Lund 0.，Bioinformatics, 20 (9): 1388-97，2004.
6.Sturnioloj T.等，Nature Biotechnology 17，555-562，1999，Generat ion of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases using DNA chipsand virtual HLA class II matrices;ΤΕΡΙΤ0ΡΕ(http://www.vaccinome.com/pages/597444/).
7.Heinlein CA，Chang C.Androgen receptor in prostate cancer.EndocrRev.2004，25(2):276-308.
8.Pinski J，Xiong Sj Wang Qj Stanczyk Fj Hawes D，Liu SV.Effect ofluteinizing hormone on the steroidogenic pathway in prostate cancer.Prostate.2011，71 (8):892-8.
9.Trpkov Kj Bartczak-McKay Jj Yilmaz A.Usefulness of cytokeratin5/6andAMACR applied as double sequential immunostains for diagnostic assessment ofproblematic prostate specimens.Am J Clin Pathol.2009;132 (2):211-20.
权利要求
1.包括I型MHC-和/或II型MHC-限制性天然透明带T细胞表位或其免疫学活性变体的多肽源在制备用于人的前列腺癌和/或其转移的治疗性和/或预防性治疗方法的药物中的用途。
2.权利要求1的用途，其中所述治疗方法是治疗性治疗方法。
3.权利要求1的用途，其中所述治疗方法是预防前列腺癌转移和/或复发的方法。
4.权利要求3的用途，其中所述方法与外科手术、冷冻手术、放射治疗、包括近距放射疗法和体外放射、高强度聚焦超声(HIFU)、激素疗法或化疗、或其组合联合。
5.前述权利要求中任一项的用途，其中所述多肽源包括有效量的选自透明带蛋白、其同系物以及所述蛋白和其同系物的免疫学活性片段的免疫原性多肽；或编码所述免疫原性多肽的核酸序列。
6.前述权利要求中任一项的用途，其中所述多肽源包括有效量的选自hZPl、hZP2、hZP3、hZP4、其同系物以及所述蛋白和其同系物的免疫学活性片段的免疫原性多肽；或编码所述免疫原性多肽的核酸序列。
7.权利要求6的用途，其中所述免疫原性多肽选自hZP3，其同系物，以及所述蛋白和其同系物的免疫学活性片段。
8.权利要求7的用途，其中hZP3包括序列SEQID N0.3的多肽骨架或其等位基因变体，优选得自单核苷酸多态性的等位基因变体。
9.权利要求1-8中任一项的用途，其中所述多肽源包括有效量的免疫原性多肽片段或编码所述多肽片段的核酸序列，所述多肽片段选自透明带蛋白片段，优选hZP片段，和/或其同系物，所述片段长18-45个氨基酸。
10.权利要求1-8中任一项的用途，其中所述多肽源包括有效量的一种或更多种不同的免疫原性多肽、所述一种或更多种免疫原性多肽的同系物、或编码所述多肽或其同系物的一种或更多种核酸序列，所述一种或更多种免疫原性多肽总共包括至少50%，更优选至少70%的天然ZP糖蛋白所含的MHC I型和MHC II型限制性结合表位。
11.权利要求1-8中任一项的用途，其中所述多肽源包括有效量的免疫原性多肽、所述免疫原性多肽的同系物、或编码所述多肽或其同系物的核酸序列，所述免疫原性多肽包括ZP糖蛋白优选hZP的完整氨基酸骨架的至少50%，更优选至少70%。
12.权利要求1-8中任一项的用途，其中所述多肽源包括有效量的ZP糖蛋白优选hZP的多种不同重叠多肽片段、所述多肽片段的同系物、或编码所述多肽片段或其同系物的一种或更多种核酸序列，所述不同重叠多肽片段的长度为18-60个氨基酸，其总共包括所述ZP糖蛋白的完整氨基酸骨架的至少50%，更优选至少70%。
13.前述权利要求中任一项的用途，其中所述多肽是糖基化的。
14.前述权利要求中任一项的用途，其中所述多肽包括类似于相应天然ZP糖蛋白或其片段的糖基化模式。
15.前述权利要求中任一项的用途，其中所述方法包括施用、优选共同施用至少一种佐剂。
16.包括权利要求1-13中任一项中限定的多肽源的药物组合物，用于人前列腺癌和/或其转移的治疗性和/或预防性治疗的方法中。
17.权利要求16的药物组合物，其中所述治疗方法是预防前列腺癌转移和/或复发的方法。
18.权利要求17的药物组合物，其中所述方法与外科手术，冷冻手术，放射治疗，包括近距放射疗法和体外放射，高强度聚焦超声(HIFU)，激素疗法或化疗、或其组合联合。
19.权利要求16-18中任一项的药物组合物，包括佐剂。
20.权利要求16-19中任一项的药物组合物，其中所述免疫原性多肽是hZP3，其同系物或所述蛋白或其同系物的免疫 学活性片段。
全文摘要
本发明涉及前列腺癌及其转移的治疗。更具体地，本发明涉及包括前列腺肿瘤细胞相关蛋白的至少一部分或其免疫学活性变体的免疫原性多肽和编码这种多肽的核酸及其在治疗前列腺癌免疫疗法中的应用。所述免疫原性多肽由透明带(ZP)(糖)蛋白提供。可以诱导CD8+和/或CD4+T细胞应答的ZP(糖)蛋白及其片段以及编码它们的核酸序列可以适用于现有免疫治疗策略。
文档编号A61K38/17GK103179977SQ201180051778
公开日2013年6月26日 申请日期2011年8月29日 优先权日2010年8月27日
发明者H·J·T·科尔林格本宁克 申请人:潘塔希生物科学股份有限公司