免疫调节剂金属肽(immp)和包含其的组合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及人和兽药领域。本发明解决了以下相关问题：缺乏用于在免疫抑制个体、患有免疫问题的个体和受感染的个体中改善免疫应答的试剂；本发明能够在人和动物中减少应激效应和对抗组织纤维化，减少对消炎剂的需求，对急性和慢性肝炎的治疗，对恶性进程和转移及血小板减少的治疗。本发明包括作为新化合物的由金属离子和肽形成的分子复合物，并且该分子复合物作为免疫调节剂金属肽(IMMP)而公知。权利要求还包括用于获得该复合物的方法、该金属肽用于生产治疗或营养试剂的用途以及该试剂在人和动物中的用途。
【专利说明】免疫调节剂金属肽(丨圖P)和包含其的组合物
【技术领域】
[0001]本发明涉及在人和动物中具有免疫调节效应的复合物，具体地涉及能够刺激免疫反应(例如产生T淋巴细胞、辅助性T淋巴细胞(⑶4+)和/或细胞毒性T淋巴细胞(⑶8+))的金属肽复合物，并且该复合物用作治疗数种免疫系统刺激是重要的疾病的活性成分。
[0002]发明背景 [0003]炎症是机体为了维持和恢复稳态对于各种类型的损伤作出的生理反应。可以说炎症是修复的第一步，并且涉及导致流体外渗的血管方面和涉及白细胞迁移至受伤部位的细胞方面。通过来自损伤细胞、血浆或白细胞的化学因子来测量血管和细胞反应，并通过损伤或通过炎性过程本身活化。该过程被所谓的炎症化学介质激活、维持和自限，并被细胞因子和趋化因子调节。这些分子调节促进炎症的因子与那些阻止炎症的因子间的平衡。这导致白细胞介素分为促炎的 IL-la、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-U IL-13、TNF-α 和 INF-Y 以及抗炎的例如IL-10和TGF-β。IL-1和TNF由活化巨噬细胞、活化T细胞及其它细胞所产生。其分泌受到内毒素、免疫复合物、毒素、物理损伤和炎性过程本身的刺激。急性炎症倾向于自动解决，其涉及导致正常血管通透性的恢复、白细胞浸润缺失、组织白细胞的消除和间质液过多的消除的化学介质的中和。
[0004]慢性炎症在数周或数月内可观测到活跃炎症迹象、组织破坏和修复尝试。其特征在于活化巨噬细胞、淋巴细胞和血浆细胞的浸润、主要由炎症细胞引起的组织破坏、通过由连接组织(纤维化)代替损伤组织的修复尝试以及血管发生的存在。慢性炎症最常见的原因是持续性感染、长期暴露于内源性或外源性毒剂和自身免疫。在此状况中，据认为IL-1和TNF-α充当维持该活化过程并保持炎症的作用，以便阻塞中断该过程。
[0005]细胞因子分泌提供免疫系统细胞之间的信号，凭借该信号调节炎性反应。细胞因子是蛋白质性质的分子组并具有低分子量，尤其由细胞例如淋巴细胞、单核细胞/巨噬细胞、肥大细胞、嗜酸细胞分泌。主要有四种类型的细胞因子:干扰素(IFN-α、IFN-β、IFN-Y)、集落刺激因子(G-CSF、M-CSF、GM-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF-α ,TNF-β )和白细胞介素(IL-l、IL-2、IL-4等)。细胞因子可具有自分泌作用(作用于分泌细胞因子相同的细胞)、旁分泌(作用于分泌位置的组织)和内分泌(当由血液运输至起效的远距离细胞时)。显然，细胞因子所起的主要作用是达到旁分泌水平(Eklund CM，2009)。
[0006]在数种疾病中已经检测到在控制细胞因子表达和产生的复杂过程中作为一种牵涉的病理生理学机理的缺陷。具体地，已经确认的促炎细胞因子分泌的调节丧失涉及以下疾病:例如哮喘、牛皮癣、感染性休克、牙周病、风湿性关节炎、炎性肠病、病毒感染后炎症的出现、湿疹、自身免疫性疾病和神经退行性疾病(Desai D，2009)。
[0007]慢性炎症的出现和持续是发病机理和例如风湿性关节炎(RA)和系统性红斑狼疮(SEL)的自身免疫性疾病进展中的一个主要因素。
[0008]免疫应答从其开始至结束受到一般称作细胞因子的一组肽分子的强烈调节。大多数细胞因子具有非常短的半衰期并在非常低浓度下有效，甚至低于10_12m(摩尔峰)，可局部或全身起效，其在免疫应答的扩增和界限中发挥重要作用。因此，它们在大多数病理过程例如炎症、感染、过敏、自身免疫性疾病、癌症等中发挥重要作用。
[0009]免疫应答是本性和/或演变已经形成的机制，以使高级生物体自身抵御任何疾病。抗原和B或T细胞受体间的相互作用引发分子和细胞活动的级联，称为免疫应答，使得这些细胞的活化、增殖和分化，从而导致抗体产生、细胞因子、细胞破坏和侵入剂并最终得以解决和回到正常。当免疫应答失效时疾病出现。该失效可由于反应不足(免疫缺陷)或过度反应，其鲜为人知但出现例如在败血症的情形下，细胞因子的大量产生导致休克和死亡；第三种失效形式为“混淆(confusing)”正常与不正常，导致自损伤或自身免疫。这是免疫应答的调节在多种疾病治疗中发挥重要作用的原因。有时，对患有免疫缺陷、感染或癌症的患者增加免疫应答会是重要的。相反地，对显现特征为普遍和慢性炎性过程的症状(alteration)的患者抑制或减小免疫应答能够是有益的。[0010]在成人中，出现在胸腺中的淋巴细胞或T细胞来自骨髓的幼淋巴细胞。当幼淋巴细胞到达胸腺的化学和物理微环境时，获得淋巴细胞的具体特征。成熟发生在一系列步骤中，包括T细胞受体(TCR)及⑶4和⑶8共受体的获取、这些中任一项的缺失以及朝辅助性细胞(CD4+)或细胞毒性细胞(CD8+)的分化。在此过程中，涉及充当提呈细胞的胸腺树突细胞以及白细胞介素3和7(IL-3和IL-7)。通过胸腺产生淋巴细胞在出生附近的阶段是显著的且在青春期后强烈衰退，但胸腺能够在整个生命中产生它们，即便在老年期。事实上，涉及T淋巴细胞分化或者在青春期后续阶段中的其产生再活化的全部因素是未知的。
[0011]我们可以说一旦炎性过程已经约束和限制损伤，对应于免疫应答移除导致损伤的不正常外因和内因，通过发挥它的主要功能充当对抗外部病原体和不正常细胞生长的屏障，其对应于区分正常的和不正常的，并且消除后者。
[0012]免疫应答通常分为体液性和细胞性，第一种以由血浆细胞产生的免疫球蛋白或抗体的出现为代表，其中在活化后B-淋巴细胞转换。抗体灭活病原体取决于抗体通过凝集、沉淀、补体激活和活化细胞溶解等机制。细胞反应由T淋巴细胞所代表，其分为辅助性和细胞毒性或抑制细胞。辅助性T细胞通过细胞因子和白介素作用，通过活化T和B淋巴细胞、树突细胞、巨噬细胞等调节免疫应答。细胞毒性T淋巴细胞在响应病毒感染和癌症中特别重要，因为它们可破坏受感染的或恶性细胞，诱导凋亡或通过穿孔素分泌溶解它们。
[0013]一般而言，在首次发生抗原挑战后的两周，以及由于存在记忆细胞而在后续挑战一周后，抗体达到它们的最大血液水平。此时间为宿主的〃无助(helplessness)"阶段,在这期间感染例如可能蔓延或扩散。
[0014]约20%人群患有任意自身免疫性或慢性炎症疾病，其由不正常免疫应答所介导。自身免疫性疾病的一个重要特征是靶点选择性，细胞、器官或组织的单一类型是自体反应性细胞群的靶点。这是因为只有那些细胞具有激活抗原。其实例包括疾病例如风湿性关节炎、I型糖尿病、系统性红斑狼疮和自身免疫性肝炎，这些疾病全部的特征在于靶器官的慢性炎症、组织破坏和机能障碍。自身免疫可定义为对正常容忍的丧失。它可源自超出抵抗攻击正常的保护系统的遗传学改变或环境应激(Christen U，2004)。
[0015]尽管聚焦于自身免疫性病理学治疗的治疗性免疫调节理念已经在多种动物模型中证实，但用于在人类中治疗自身免疫改变的策略发展仍处在初期。这方面主要障碍包括从不同模型得到的对比结果以及和此类病症进展相关的调节性T细胞和细胞因子的对比功能。[0016]重要的是，牢记免疫系统同时是调节控制的主体和客体，以及通常免疫调节的概念主要用在以消除外部病原体或以保护性免疫力提高的具体参照(reference)中。毫无疑问的是该调节机制只有一个，十分错综复杂，但只有一个，由参与反应的多重控制构成且当出现失衡时发生系统失效，导致慢性感染、肿瘤出现或者过敏性反应或自身免疫。
[0017]在临床中自身免疫病的分类通常是根据对特定抗原具有亲和力的抗体的存在(例如具有抵抗TSH受体的抗体的格雷夫氏病)，或者根据细胞反应的存在，其主要破坏细胞和不同组织，免疫系统的那些，还由于对抗特定抗原的反应，例如桥本氏甲状腺炎或I型糖尿病。然而，在许多疾病中具有两种现象的组合。因此，桥本氏病和I型糖尿病出现自体反应细胞，但还出现自身抗体。另一方面，自身免疫病频繁研究炎性成分，包括粘附分子在内皮上的表达，从而导致缺陷性白细胞黏附(Jimenez SA，2004)。
[0018]对自身免疫根源的慢性炎症的治疗已经聚焦于症状治疗。用于治疗自身免疫性炎症的免疫抑制剂聚焦于免疫系统的细胞反应或者由它们产生的细胞因子。在治疗炎症、风湿性关节炎和狼疮的新提议中，用于诱导缓解(甲硫咪唑在格雷夫氏病中)、毒性(环孢霉素用于I型糖尿病)或简单性镇静(palliative)(皮质类固醇用于结肠炎或系统性红斑狼疮)(Michelsen KS，2004，Pasterkamp G，2004 ；0udeNijhuis MM，2007)只是部分有效，有一些调节免疫应答的提 议(Sitkovsky M.,2007, Zimmerman DH, 2009,.B.White, 2010) ?
[0019]在一些其它事件(event)例如应激、癌症和纤维化中，已检测到免疫系统的调节的确是重要的。
[0020]应激
[0021]现已认识到应激为各种疾病例如心血管疾病、癌症以及源自免疫系统功能障碍的那些疾病的主要“变弱的(debilitating)”或素因性的因素。应激导致各种生理变化，包括免疫应答、激素水平、消化酶的产生和分泌以及消化功能的变化。在应激事件之前，应激激素例如去甲肾上腺素、肾上腺素和皮质醇释放入循环使身体为应急反应(fight-or-flightresponse)作准备。哺乳动物中的应激经常显现为体温增加，归因于血流动力学的变化、心率和血压的增加。在高血压患者中，应激的血流动力学效应能够是特别有害的，因为它们倾向于加重高血压，这是心血管疾病的主要风险因素。
[0022]已经产生了在控制和治疗应激及其后果的有效药物。不幸的是，它们大多数仅对抗症状而非其自身的病理生理学过程。
[0023]癌症
[0024]癌症是转化细胞子代的不受控制生长，通常通过突变蓄积或通过致癌病毒。作为恶性化的结果，由该细胞产生的一种或多种蛋白质将会突变，且当存在于I型组织相容性主复合物(MHC I)中时，其将被识别为非自身的，触发免疫应答并被细胞毒性T淋巴细胞或自然杀伤细胞消除(Vaux D，1993)。因此每天可生成的癌症克隆被免疫系统消除。当免疫系统失效或免疫抑制发生时，恶性细胞能存活、繁殖和侵袭邻近组织。已经证实在体外和体内恶性肿瘤细胞中细胞和体液免疫破坏的效应物机制；事实上，这构成了一些治疗的基础，例如使用抗体对抗肿瘤细胞，但它们具有限制。
[0025]⑶8溶细胞性T淋巴细胞(CTL)负责肿瘤免疫的主要机制。这些淋巴细胞通过识别和破坏那些在其MHC I中显现为蛋白抗原(被识别为非自身)的细胞而执行监视功能。CD4辅助性T细胞(Th)，特别是I型(Thl)的那些细胞还参与抗肿瘤反应，通过细胞因子例如IL-2提供增加CTL的效力的信号。Thl细胞还分泌肿瘤坏死因子(TNF)和、干扰素(IFN-Y)，其导致肿瘤细胞增加MHC I的表达且因此增加被CTL识别及消除的可能性。同样，IFN-Y活化对抗肿瘤细胞的巨噬细胞(Pasqualini D.，1996，J Maher，2004)。
[0026]通过抗体产生的体液免疫应答液参与对抗肿瘤的战争，“标记”肿瘤细胞以便由补体或巨噬细胞就将其破坏。同时，抗体能活化由抗体依赖性细胞介导的细胞溶解(Benjamini E,1996, Janeway C,2001)?
[0027]反过来，肿瘤细胞在存活斗争中发展逃避免疫应答的机制。这些包括减少I类分子表达，它们放弃表达被TCR识别的抗原，并因此它们能活化细胞反应；它们还可使这些分子隐藏在多糖蛋白复合物下，从而该I类复合物不能与溶细胞性T淋巴细胞的T细胞受体和⑶8共受体相互作用，它们还能分泌免疫抑制剂，例如β转化生长因子(TNF-β)或表达Fas配体，并因此诱导表达Fas受体的免疫细胞死亡，它们还可产生一些细胞因子例如IL_2的可溶性受体，从而阻抗⑶4细胞以活化免疫系统的其它细胞(Soddu S，1992;Cefai D，2001 ；Dworacki G,2001G.Pawelec, 2004 ；Ahmadzadeh Μ,2005)。[0028]转移是在远离原发性肿瘤的位点出现继发性瘤。其构成了癌症患者中发病率和死亡率的主要原因。转移是归因于复杂序列的事件，开始于侵入邻近组织、血管内渗并透过淋巴或循环系统运输，外渗附着于第二位点，并在组织或第二器官中生长。尽管在全部肿瘤中转移所需的基本步骤是相似的，但是在一个肿瘤和另一个肿瘤之间，肿瘤发生的分子基础可变化很大。当细胞或一小群细胞迁移时，其比“接合(joined)”于肿瘤的那些细胞更易受到免疫系统的攻击。
[0029]相应地，可阻断转移的治疗可提供用于治疗具有不同起源的癌症的有力工具。因此，这种治疗类型的发展应为针对此问题的关键治疗策略。
[0030]因为治疗癌症的理想方式会是破坏全部肿瘤细胞但不影响正常细胞，实现这点的一种方式将是诱导对抗肿瘤细胞的特异性免疫应答。
[0031]癌症是严重的公共健康问题，在墨西哥是第二死亡原因，而在美国四分之一的死亡归因于癌症。抗癌治疗是外科手术，采用其移除肿瘤和肿瘤细胞；然而在许多情况下由于其解剖学定位、侵入程度或转移的存在，完全移除是不可能的。在此类情况下，频繁使用化疗，对于其使用杀灭肿瘤细胞的药物，然而通常出现对所述药物的耐药性克隆，该克隆存活并重新住入(!^populate)产生远处转移的肿瘤，因此出现肿瘤复发和死亡。在其它情况下使用与化疗具有相似的结果的放疗。
[0032]为实现更好的治疗结果，已经存在多种改进，但仍然需要等待:癌症早期的有效治疗以减少逃脱(escape)量、用于治疗用当前标准疗法难治性肿瘤的替代治疗、用于减少或消除转移的治疗、采用更低毒性的药物和更好的药物释放系统。
[0033]已证实在人类癌症中能够激活免疫应答的抗原的存在，以及当此应答发生时，其可导致肿瘤消退。那些抗原同时激活体液和细胞类型的免疫应答，然而能够假定它们存在可激活不同反应类型中一种的表位(Coulie PG, 1997, Sahin U, 1997, Van den Eynde BJ,1997 ；ffang RF，1999)。基于这些发现，产生可诱导肿瘤消退的免疫疗法已变成目标。虽然已获得了有利的结果，但这些是零星发生的且在量级和频率方面通常较小。这些涉及通过使用细菌或病毒肿瘤抗原、细胞因子的疫苗开发，以及使用抗肿瘤抗体、抗细胞因子或其受体(Grange JM,2008 ；Misaouel P, 2009 ；Trimble CL，2009)。[0034]在产生免疫应答(导致肿瘤消退)的尝试中的问题是在癌症患者中，通常发现免疫应答处于由肿瘤以及患者自身改变的免疫系统诱发的免疫抑制状态中(Yang L，2004，Perez-Diez A, 2007),这已经使得一贯的免疫接种的应用变得为无功效(non functional)和不可能。免疫抑制或耗竭降低了免疫系统应答的能力。该抑制可由药物或病理学诱导(例如AIDS)、由HIV病毒诱导或者由恶性肿瘤诱导，其关闭了免疫系统(Tran H, 2008,Holtan SG,2009)。
[0035]已经开发了各种抗肿瘤的免疫接种。然而，这些策略是复杂的，并且显著不同于用于其它感染性疾病类型例如病毒或细菌性疾病的常规免疫(J Weber，2000)。该免疫策略中的一种涉及由接合血蓝蛋白的唾液酸TN多糖粘蛋白(Sialyl TN polysaccharide mucin)构成的抗原以及用分枝杆菌佐剂和低剂量的环磷酰胺给药(MacLean GD，1996)。采用该疗法，在少数患有乳腺癌和卵巢癌的患者中已经得到了良好的免疫应答。大量应答意味着肿瘤减少超过 50% (Kreitman RJ, 2009, Mathew M, 2009 ；Shumway NM, 2009)。
[0036]还已经尝试进行基因治疗,使用基于腺病毒的构造体(construction)作为用于接种宫颈癌患者的乳头瘤病毒(HPV)的16肽表达的带菌体，且已经在低百分比患者中得到了令人满意的答案(LK Borysiewicz, 1996)。
[0037]还已经尝 试树突细胞疗法。将树突细胞预先暴露至转移性前列腺癌患者的前列腺特异性抗原的肽片段，在低百分比患者中获得了良好的应答(Sanda MG，1999)。
[0038]此外，已经使用自体肿瘤以及低剂量的环磷酰胺和BCG使黑素瘤患者获得免疫。但获得了很少的临床答案(MF Mastrangelo, 1996 ；Berinstein NL，2009)。另一策略在于具有多种佐剂的抗原MAGE的应用。还已经报道了患者中的不良结果。
[0039]过去数年已有若干专利申请，主要目标集中于采用不同方法产生用于癌症的治疗，例如阻断或抑制细胞因子(Jassoy C，2010 ；Miossec P，2010，Nishimoto N，2010)，消除细胞因子可溶性受体，如IL-2(H.Sicard，2010)、在间皮瘤中的IL-6 (Hadashi, Y，2010)，增加了对抗肿瘤的免疫应答(Hadeen Jff, 2009, Vollmer J，2009)，施加白细胞介素例如IL-20用于治疗宫颈癌(Chandrasekher ΥΑ，2010)，以及用于治疗转移。
[0040]目前，采用IL-2治疗在两种类型的癌症(肾癌和黑素瘤)中已经表现出较小的效果(应答率r小于20% )。据认为其在头颈鳞状细胞癌和前列腺癌症中无效(McDermottDF, 2009, Shaker MA, 2009)。
[0041]重要的是，将利用具有复杂结构和高分子量的“经典的(classical) ”抗原在健康患者中的预防与采用肿瘤或肽抗原在免疫抑制患者中治疗(通常失败)进行对比。第一种情形是简单的并由病毒疫苗所代表，证实了它的有效性。后者在30年的失败尝试后已经被认为几乎是不可能的。
[0042]在若干的上述策略中，已尝试了增加或产生对抗肿瘤的免疫应答(不论是体液的、细胞的或两者)。然而，成功是有限的且不一致的。因此开发能够移除患者的免疫抑制、抗肿瘤抗原无效和/或能够击败肿瘤逃脱机制的方法是必要的。
[0043]由毒剂和药物诱导的肝损伤
[0044]据认为由药物诱导的肝损伤可经历两种通用机制，一种是药物所固有的而另一种是特异性的。固有的损伤归因于以可预测方式产生肝细胞损伤的分子的特定性质并且依赖于剂量，该损伤可由药物或其代谢物中的一种来引导。特异性损伤是由药物最频繁产生的损伤类型，且可分为代谢性和免疫性；对药物产生过敏或超敏性。固有性损伤通常以伴随很少炎症的细胞坏死为特征，而对药物的特异性反应通常以炎症的继发性损伤为特征。
[0045]基于国际医学科学组织理事会标准，肝损伤还可被分为肝细胞型、胆汁阻塞型和混合型(PB Watkins, 2006 ；Teschke R，2008)。
[0046]在美国，10%的急性肝炎是由于药物诱导的肝损伤，然而由它们导致的最常见的病理学是胆汁阻塞性肝炎。暴发性肝炎的特征在于在肝炎症状后8周期间内出现肝性脑病。这是在美国最常出现的损伤类型，占它们中的25~50% (1996R.Williams,R.Williams,2003 ；Hanje AJ,2007)?
[0047]慢性肝炎表示超过6个月的持续性生化改变，尽管在一些研究中认为3个月的时间为肝细胞性损伤而6个月为胆汁阻塞型或混合型。药物诱导肝炎5~10%的病例发展为慢性肝炎。该比例在产生胆汁阻塞型或混合型肝损伤的药物中较高(Be’nichouC.，1990, Batts KP, 1995)。
[0048]许多药物可 数据例如皮疹、关节痛和嗜酸粒细胞增多。
[0049]存在很少对治疗肝炎有效的药物。对于那些病毒病因学的，具体地，丙型肝炎，使用peg-干扰素和病毒唑，最近已出现了一种新型干扰素，“concensus”，在耐peg-1FN的病例中是有用的(Hsu HH.，2008)。
[0050]血小板
[0051]血小板涉及止血和伤口修复。血小板生成在骨髓上进行；其依赖于由细胞、胞外基质和可溶性生长因子组成的该器官的微环境。各种生长因子涉及血小板的生成和成熟；它们包括IL-3、粒细胞和巨噬细胞集落刺激因子、IL-6、IL-11、白血病抑制因子和促血小板生成素，后两者是不可或缺的。肝脏是产生最大量的血小板生成素的器官，其似乎为组成性的(constitutively)。在患有肝病的患者中经常观察到血小板减少。在炎症情况下，IL-6诱导增加产生血小板生成素(Kaushansky K.，2009)。
[0052]通常，负调控机制起效，因此当存在高数量的血小板时，观察到低水平的血小板生成素，反之亦然。然而，并非永远是这样的，例如在血小板过度破坏的情况下，可能发现正常水平的血小板生成素，在内皮炎症的情况下不存在血小板水平和血小板生成素的关联(K.Kaushansky, 2005)。
[0053]在肝炎患者中通常观察到血小板减少，通常作为晚期疾病的症状。这已经归因于血小板受脾脏隔离的增加、血小板生成素或其它由肝脏产生的生长因子的产量改变(Afdhal N, 2008，P Witters, 2008 ；Tillmann HL, 2010)。
[0054]对血小板减少的治疗取决于其病因学，但通常包括脾切除术、皮质类固醇、达那唑(danazol)和近期的伊屈泼帕(eltrombopag)(—种模拟血小板生成素效应的分子)(HLTillmann, 2010)。
[0055]如上所述，免疫应答的调节在许多疾病治疗中发挥重要作用。有时在感染或癌症患者中增强免疫应答将是重要的。相反，在出现特征为炎性过程的紊乱的患者中抑制或减少免疫应答可能是有益的。
[0056]生物反应调节物(例如抗体、免疫治疗剂和拟肽(mimetic peptide))是调节活体的防御机制或生物反应，例如存活、生长或细胞分化以指导它们具有抗瘤活性的试剂。[0057]佐剂是当给药至个体或体外测试时，在给药抗原的客体中增加对抗原的免疫应答，或者增加某些细胞的活性或免疫系统细胞的某些活性的化合物。已制备并测试了大量呈现该活性的化合物。然而，大多数具有毒性效应、非特异性，不稳定的或其效果非常小。
[0058]治疗自身免疫改变的努力已涉及使用以下物质攻击免疫系统细胞或其产物:抗原、T细胞肽、单克隆抗体(mAb)、充当细胞受体的配体的重组蛋白、TNF-α型分子、或IgE (所有这些为被动试剂)，其主要问题是它们必须终生给药至患者，而且，单克隆抗体或可溶性受体应被“人源化”以预防由其带来的排斥或不利事件。治疗从免疫系统中消除对抗病原体的正常免疫应答所必需的T淋巴细胞或其它细胞的全部种群是不方便的。治疗应只作用于主要分子或“不正常”细胞。
[0059]还有自身免疫性疾病治疗中的活性剂，它们的目标是为了诱导机体产生分子以反击或中和该试剂。活性剂的实例是通过产生抗体或细胞毒性T淋巴细胞诱导长期适应性反应的疫苗。
[0060]考虑到大量疾病涉及促炎性细胞因子水平的调节丧失，用于治疗涉及促炎性细胞因子增加的病理学的新分子和/或方法是有需要的。
[0061]为治疗自身免疫性疾病，要求更高特异性、更低剂量以及更低活性物质给药频率的策略是必需的。治疗用剂应具有以各种方式应用的选项，而且，其分子在3000~5000Da以下是便利的， 以使它们能通过血脑屏障。
[0062]该治疗用剂应诱导生理学上体内平衡的免疫应答，从而活化在必需位点所需的细胞。例如，增加辅助性T淋巴细胞亚群、Treg和/或一些细胞因子例如IL-2的产生，和相反地，减少具有促炎功能的其它细胞因子例如IL-1的产生。
[0063]希望治疗用剂的产生在数量与质量上是高度重现性的、不是非常复杂的或昂贵的，并希望在其贮存期间是稳定的和易于使用。
[0064]已通过使用各种免疫调节剂试图解决本文提出的问题，这里仅提及一些选项:产生共刺激分子拮抗剂，例如B7(Zou W，2008);阻断⑶-40与其配体的相互作用的抗体和试剂，由此它们调节表达其、修饰其增殖的细胞的存活(Luqman M, 2008);佐剂例如RC-529( —种烷胺氨基葡糖苷)和QS-21 (皂苷)，与已被用于在哺乳动物中增加免疫应答的抗原(疫苗)联合给药，在对抗癌症、病毒、细菌或原生动物抗原和对抗涉及自身免疫性疾病的自身抗原的疫苗中，一些化学试剂已被用作三唑嘧啶三环衍生物(Isoda S，1989)、抗原肽(Smith III GJ，2009)、使用苯基甲硫咪唑或甲硫咪唑衍生物用于治疗伴随Toll样受体3和4(TLR3和TLR4)过表达的疾病；IkB激酶(IKK)抑制剂(Ginn JD, 2007);为神经鞘氨醇-1-磷酸(esfingosine-1-phosphate, SlP)受体调节剂的烧胺羧基环衍生物(Bhattacharya SK, 2009);对抗一些 B 细胞受体的拮抗剂抗体(Novobrant-Seva T,2006)。在纤维化的情况下，使用赖氨酰氧化酶(LOX)抑制剂和/或其类似分子。
[0065]胸腺免疫调节
[0066]胸腺是淋巴系统器官，负责T淋巴细胞的成熟和内分泌(因为它分泌一些激素)。胸腺在新生期和儿童期期间具有最大活性。在成年期，它部分萎缩，被脂肪组织所替代，但其始终保留残留活性。
[0067]胸腺对于淋巴系统的发育和成熟以及我们机体的防御性免疫应答发挥着显著影响。胸腺是骨髓产生的未分化淋巴细胞(Τ淋巴母细胞)发生分化的主要淋巴器官，它们进入胸腺并集落在其不同区域，同时成熟和分化。第一集落区域(the first colonizedarea)是表皮质。从这里它们传送至深皮质并最后到达胸腺髓质。整个过程，T淋巴母细胞获得特异性抗原受体(T细胞受体、CD3、CD4和CD8共受体等)并它们学习不去攻击个体自身的抗原(自身抗原)，从而变为成熟的T淋巴细胞。
[0068]胸腺还可被认为是内分泌系统器官且因此是内分泌腺，因为它分泌激素及其它可溶性因子，其除了控制胸腺中T淋巴细胞的产生和成熟，还调节外周组织中T细胞的活性和相互作用。由这种具有激素特性的器官所分泌的多肽是已知的，这些为胸腺肽或血清胸腺因子(STF)、胸腺体液因子(THF)和促胸腺生成素或胸腺素。由这些蛋白以及称为因子的胸腺提取物(不确定的组分)，以不同程度治疗免疫缺陷的性质已有记载。
[0069]THF是自1975年记载(Kook等人，1975)的免疫活性可溶性成分，THF-y2 具有以下序列:Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu(LEDGPKFL)是 THF 的有效成分。专利ΕΡ0204328Β1 (Trainin N, 1986)明确涉及提取自胸腺的具有序列Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu 的 THF 肽，且被命名为 THF Y 2。THF- Y 2 参与 T 细胞的分化和参与它们在免疫系统以下三个区室(compartment)内的增殖:骨髓、胸腺和外周淋巴系统，这些功能中的一些仅在体外观测到而其它的也是在体内显现，因此其生理学作用是不清楚的(Granoth, R.等人，1997)。
[0070]血清胸腺因子，其制剂及其性质已被若干作者所描述JF Bach等人的Nature (1977)以及在专利中(DF Veber, 1978 ；Bach JF, 1979)，后者描述了使用它们作为自身免疫性疾病药 物的可能性，由于其免疫调节性质，它改善选择性刺激T细胞的活性的细胞和体液的免疫应答(Haddad，J.2009)。
[0071]特别地，THF已经显示出具有各种生物学活性，例如增加T细胞对分裂素的增殖反应、淋巴细胞混合物的反应和由伴刀豆球蛋白A诱导的IL-2。后者在100~300ng/ml (1.09 ~3.2x1 O^7M)的浓度下，在脐带血中，THF (300 ~600ng/mL) (3.2 ~6.4x1 O^7M)还增加由 PHA 诱导的 IL-2 产生(Bursteinl988 ；Burstein, 1999)。每周给药两次 4ng/kg 的 THF可恢复新生期切除胸腺的小鼠的免疫应答。其给药恢复了受巨细胞病毒(机会病毒)感染小鼠的免疫应答。以0.4~50 μ g/剂量的量给药该因子，延长了遭受浆细胞瘤并接受5-氟尿喃唳化疗的小鼠载体(mice bearer)的存活。同样地，其还改善具有一些肿瘤类型例如浆细胞瘤并接受化疗或放疗的小鼠中的免疫应答。此外，其能够改善由于老化的免疫应答减少。在骨髓中，THF增加了粒细胞和巨噬细胞的产生，除外红细胞系(ZT Handzel 1990 ；Ophir R, 1991 ；Barak Y, 1992 ；Burstein, 1998)。在对出现淋巴增殖紊乱、成神经细胞瘤和横纹肌肉瘤的患者的试点临床研究中，THF被用于以4ng/kg/日的剂量每日注射持续三周，作为化疗和维持治疗的佐剂。监视感染、发烧、一般状况和不同血液参数症状的出现，观测到没有感染或发烧但具有良好的一般状况，还观测到CD4/CD8比例(relation)和NK细胞的增加。同样地，在包括患有免疫系统缺陷以及严重疱疹病毒感染的患者的另一试点临床研究中，采用上述方案，观察到病毒感染的消退以及T细胞种群的增加(Handzel ZT, 1990 ；Burstein, 1999)。
[0072]在粒细胞和巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的存在下，而不是单独培养时，在THF的存在下对正常骨髓细胞一小时的预培养增加骨髓集落数目2至5倍。用于该目的的、所报道的最佳浓度范围为25~100ng/mL(27xl0_9~IOxl(T9M) (M Pecht, 1993 ；Burstein, 1999)。
[0073]已尝试通过作出某些修饰来改善THF免疫调节特性的效力。例如，在美国专利5968898 (Burstein和Trainin N等人，1999)中描述了具有相同序列的THF- Y 2类似物，但其还描述了连接其它分子的氨基酸的删除替代成环，通过这些方式实现了脾细胞中由伴刀豆球蛋白A诱导的IL-2产生增加30%，以及增加小鼠骨髓中粒细胞和巨噬细胞集落祖细胞的生成(Barak et all992 和 Petch et all993)。Granoth 等人报道了由 tufsin(巨卩遼细胞刺激肽)和THF形成的嵌合体(tuftsin-THF Y 2嵌合体和THF y 2-tufsina)的活性，在体内存在抗原KLH的情况下分别增加40%和80%的淋巴细胞反应。
[0074]鉴于以上，得到能有效治疗以上状况的动物免疫系统的免疫调节剂和免疫刺激组合物是必要的。
【专利附图】
【附图说明】
[0075]图1显示了 LEDGPKFL肽在D2O中的IH RMN光谱(700MHz)。上部分示出了110区的放大部分，指出了肽中的9个预期的质子。
[0076]图2显示了 LEDGPKFL肽在D2O中的13C RMN光谱(176MHz)。上部分示出了 C a区的放大部分，指 出了肽中的8个预期的碳。下部分示出了关联光谱13C-lH(gHSQC)。图2示出了肽的位置I(Ll)的亮氨酸和位置8(L8)的亮氨酸。
[0077]图3显示了 LEDGPKFL肽在D2O中的RMN IH光谱(700MHz)。上部分显示了 H α区的放大部分，指出了肽中的8个预期氨基酸的分配。图3示出了肽的位置I(Ll)的亮氨酸和位置8(L8)的亮氨酸。
[0078]图 4 显示了 LEDGPKFL 肽在 D2O 中的 RMN IH 光谱(700MHz)。LEDGPKFL 15mM(上图)肽以及LEDGPKFL15mM和ZnCl215mM(下图)肽。图4示出了Ha区的放大部分，指出了在存在摩尔当量ZnCl2的情况下经历化学位移的氨基酸的分配。
[0079]发明详述
[0080]本发明代表提供可调节免疫应答和炎症的试剂的技术突破，该试剂有助于在人和动物中改善免疫应答，并同时覆盖伴随其使用的需求，对于动物机体(包括人体)无副反应或不良反应。
[0081]本发明涉及免疫调节剂金属肽和含有该免疫调节剂金属肽的组合物，其中所述IMMP为形成于二价离子和式I的肽间的复合物，该二价离子优选自Zn2+、Cu2+、Mg2+或其混合物
[0082]Xn-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu-XmI
[0083]其中:Xn和Xm为彼此独立的任意氨基酸，
[0084]η 值为 O ~4,
[0085]m值为O~2，且
[0086]其中所述肽和二价离子彼此间通过非共价连接相连，肽的代表例如为LEDGPKFL (SEQ.1D.1)序列，其类似物及变体，包括SEQ.1D.2至SEQ.1D.10以及所述序列的任意变体，其中氨基和末端羧基已被封端以认为是原始肽的变体。在本文上下文中，该术语还包括肽的类似物、衍生物、共轭物、代谢物和前体。
[0087]本发明的另一个实施方式涉及在适当给药的剂量、剂量学、途径和方式中IMMP的用途及拟肽。
[0088]除了复合物，以下具体描述的和对应于活性类似物(analog actives)的金属肽，落入本发明的实施方式内:编码它们的核苷酸序列，包含所述核苷酸序列的载体或质粒，用于获得该锌-肽复合物的方法，复合物用于包括营养制剂的药物制备的用途并用于采用其治疗其中需要在人和通常在动物中诱导产生T淋巴细胞，(CD4+)和/或细胞毒性T淋巴细胞(CD8+)的病症，在继发性免疫抑制患者中改善免疫应答；在人和动物中修饰免疫应答并加速产生对抗抗原或疫苗的抗体；预防性作用以保护有风险患者，毒抗感染疾病及其影响，消除、对抗或减小急性感染，慢性感染和复发性感染的影响；消除、对抗或减小自身免疫性疾病或过敏症的影响；消除、对抗或减小应激效应；预防、消除、对抗或减小纤维化效应；消除、对抗或减小癌症效应；预防、消除、对抗或减小转移效应；预防、消除、对抗或减小急性或慢性炎症的影响；预防、消除、对抗或减小急性或慢性肝炎、感染、毒性或自身免疫的影响；预防、消除、对抗或减小肝硬化的影响；预防、消除、对抗或减小风湿性关节炎的影响；预防、消除、对抗或减小由肝脏问题或其它类型引起的血小板减少疾病。
[0089]在本发明范围内关于本发明的IMMP用途，据认为含有本发明免疫调节剂(IMMP)作为活性成分的药物可施用的个体可以处于健康状况下，在此情况下该试剂的作用是为了预防疾病，或者可患有例如前面段落中提及的任意那些中的任一种或另一种的任何疾病或失衡。[0090]本发明的实施方式还有包含本发明IMMP复合物作为活性剂或治疗用剂的任意药物剂型(pharmaceutical form),例如,可注射的药物剂型、片剂、胶囊、口服溶液或混悬液(suspension)、局部或全身施用溶液、待溶粉末、营养制剂组合物或方便的且与本发明IMMP复合物相容的那些药物剂型。它们可为单剂量或多剂量形式，在每种情况下在用于不同动物物种中的适当离散物理单元中。各单元按需含有特定及足够量的活性和/或稀释成分，以及载体。
[0091]本申请中不加区别地使用的术语“复合物”、“金属肽复合物”和“IMMP”指的是由二价离子和式I肽形成的复合物、其类似物和/或衍生物，以及通过本发明方法获得的物质。
[0092]伴随IMMP复合物使用的预防或治疗方法也是本发明的实施方式，每一个针对需要IMMP生物学活性的人或动物的不同状况。
[0093]在本发明研究期间，现有技术中研究了 LEDGPKFL(THF)肽的活性，其中发现在体外研究中它们的生物效应不是恒定的，以及在体内研究中报道其使用效力是不确定的，因为从体内和体外实验结果间的矛盾来看，其它研究者认同THF的生理作用缺乏特异性。
[0094]如以下实施例所示的，LEDGPKFL(THF)肽对于大鼠胸腺细胞的增殖和分化(主效应归因于此因素)在两个数量级中具有小很多的影响以及较高的浓度。基于我们的结果(表1、2、3、5、6、10、11、12和13)，我们注意到若分别采用脂多糖(LPS)、伴刀豆球蛋白A或植物凝集素A共刺激这些细胞，LEDGPKFL肽仅对于单核细胞、胸腺细胞和人淋巴细胞或来自动物来源的那些细胞发挥效应，因此，我们推断IMMP作用于“活化”胸腺细胞和T细胞，而不是作用于那些“休眠期”或“非活化”细胞，这点特别重要。
[0095]胸腺是机体中锌含量最高的器官，称作胸腺肽的胸腺激素(以结合锌的形式)对于T细胞成熟是重要的。金属蛋白酶也需要锌，事实上这些酶相比于胸腺肽具有更高的锌亲和力，从而在锌缺乏情况下，胸腺功效降低，对此的原因，准确来说可能是可用于胸腺肽的低数量的锌，发现该缺乏伴随年龄出现(Mocchegiani, E.1998)。胸腺肽序列及其对锌亲和力的描述，7.5的pH下的表观亲和常数Kdof5±2.10_7M，其中该结合是pH依赖性的，在
6.0以下的pH下不发生胸腺肽结合，且7.5的pH下，Ga3+、Al3+2+、Cu2+可与此结合竞争Zn2+。表示所述结合的活性也被Gastinel, LN等人(1984)报导。
[0096]在本发明研究期间，研究了锌离子对于存在LEDGPKFL肽的THP-1细胞(人单核细胞)细胞增殖的刺激活性的作用；测试显示(表1)单独的肽在10_8M(9.18ng/mL)的浓度下刺激细胞增殖，所述浓度接近文献中报道的该肽对于其它细胞的浓度(23ng/mL)(2.5x10_8M)。但当LEDGPKFL肽加入锌离子时，观测到相同的活性但完全在观测参数之外并以意料之外的方式在更低的浓度下活性超过200倍(0.0983ng/mL ο 1.0xI(TkiM)。即，锌离子的存在增加了肽效力超过200倍。采用人淋巴细胞(表2)、新生大鼠胸腺细胞(表3)以及单片细胞(表4)重复前面测试，其中在存在肽和锌离子的情况下再次观测到更高的效应。如同上述测试中，锌和肽混合物的效力比单独肽的效力高超过200倍。另一方面，观测到锌本身较差地诱导细胞增殖，从而所观测的效力增加不是源于锌离子本身的活性。
[0097]用于形成本发明金属肽复合物的锌可来自能给出锌的任意分子，通常为氯化物或硫酸盐。
[0098]为确认锌是否为该肽活性的必要成分或其是否是锌对于肽活性的协同效应，在存在二乙烯三胺五乙酸(DTPA)(—种从胞外基质捕获锌的试剂)的情况下进行一些测试，其中，实验发现该肽丧失所有生物活性(参见表4、5、6和7)，即，其未刺激THP-1细胞、Jurkat或人体淋巴细胞的增殖。[0099]为确定肽是否与锌离子形成了分子复合物，进行核磁共振(NMR)研究以便观察在锌离子存在下肽的空间构型是否发生了修改。当进行质子和碳的NMR时，有效地观测到在锌存在下肽的空间构型发生了修改。特别地，当存在锌离子时，具有羧酸的氨基酸存在化学位移。谷氨酸(D)向低场变化(Δ δ+0.027ppm)、天冬氨酸(E)和具有L末端羧酸的亮氨酸则经历了向高场的位移(分别为Δ δ -0.016和-0.051ppm)。这些位移表明LEDGPKFL肽只是特征为分子复合物锌-肽、能够充当免疫系统的活化细胞和炎症中介物的生物活性(前体)分子前态(molecular prior state)。
[0100]为研究通过进行本发明复合物，肽的另一理化性质是否也发生修改，实施反相高分辨色谱，其中极性分子首先被洗脱，随后是那些较小极性的分子。我们观测到肽和锌-肽复合物的保留时间相差230毫秒，其表明离子中和了存在于离子中的一些电荷(参见表9)。
[0101]为研究单独的肽是否可与锌离子形成分子复合物，或者能与其它离子形成分子复合物，在相同条件下用Mg2+、Cu2+、YMn2+进行测试，其中观测到前两种离子能够增加肽的效力，但是锰离子不行。然而，与Mg2+、Cu2+离子形成的复合物的效力低10倍(表8)。通过使用反相技术在高分辨色谱柱中进行保留时间研究，观测到加入Mg2+、Cu2+也可减少保留时间，但时间小于Zn2+。因此，我们推断肽能够与锌、镁和铜离子形成金属肽复合物。
[0102]本发明涉及式I金属肽复合物，例如结合锌或其它二价阳离子的THF复合物，称为IMMP，该复合物具有前面未描述的免疫调节和抗炎活性，可局部及系统调节细胞因子水平，因此，调节细胞和体液的免疫应答的不同方面是有用的。根据前面的内容，本发明复合物能够改变不同疾病类型的进程，例如感染、自身免疫、急性和慢性炎症和癌症，除了增加对于疫苗或免疫接种的反应外，改善体液和细胞反应，包括活化T淋巴细胞水平和产生充足的免疫记忆，因此，其在人和动物的医疗应用中具有巨大潜力。Barbour等人在1998年报道了用于在鸡中免疫增强疫苗效力的锌效用，通过仅包含锌盐的胸腺刺激素(thymichastimuline)和促胸腺生成素(包括称为胸腺五肽的肽促胸腺生成素活性肽)激素，发现了免疫增强模式和水平的差异。
[0103]本发明的IMMP是免疫调节剂金属肽复合物，能够用于治疗人或动物客体以修饰其免疫应答、修饰炎症，以预防性、治疗性或缓和性地治疗(threat)感染疾病、物理或心理应激、癌症、转移、自身免疫性疾病、纤维化、血小板减少，或者可发挥积极效果的任意其它疾病。
[0104]IMMP是金属肽分子复合物(其中该肽具有由式I所示的氨基酸序列)、其肽类似物或修饰衍生物，而金属离子可选自包含以下二价离子的组:锌、镁、铜或其组合，且具有免疫应答和炎症的修饰效应，能够促进接受IMMP的客体的健康和生长。
[0105]当由例如具有SEQ.1D.1的肽和锌金属离子(2+)形成复合物时，分子复合物IMMP的分子量为983.4g/mol，然而，根据用于形成本发明复合物的肽和金属离子，所述分子量可不同。
[0106]参与本发明金属肽复合物并以式I表示的肽能够通过以下不同的方法得到:当该肽为SEQ.1D.N0.1时分离自动物组织和器官，或者化学合成(通过任意已知或将知的技术、通过DNA重组技术 或生物技术和甚至以内生性方式刺激其产生)。对于肽的体外和/或体内用途，涉及IMMP金属肽复合物的肽、其类似物或衍生物能够被化学修饰以预防被蛋白酶降解并增加其在有机体中的寿命，例如通过酰胺化或乙酰化端基的化学保护等。
[0107]因此，本发明复合物是这样的产品:改善免疫应答和炎症，并有助于得到增强其效应的更好疫苗；改善正常、免疫抑制或具有过敏性或自身免疫紊乱的客体中的免疫应答；在患有急性、慢性或复发性感染的患者中刺激免疫应答；减少物理和心理应激的影响；对抗组织纤维化，例如在肝硬化发展期间，需要或不需要留族抗炎药，其当用于对抗急性和慢性炎症是也是安全的；对于有效并安全用于急性和慢性肝炎、感染、毒性或自身免疫的新疗法的需求；增加对抗恶性肿瘤过程和转移的免疫应答，全部这些是在人和动物中。
[0108]在一个优选实施方式中，IMMP复合物中的式I肽可具有以下序列:
[0109]Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu(SEQ.1D.N0.1),
[0110]Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu(SEQ.1D.N0.2),
[0111]Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu(SEQ.1D.N0.3),
[0112]X-Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu (SEQ.1D.N0.4),
[0113]X-X-Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu (SEQ.1D.N0.5),
[0114]Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu-X (SEQ.1D.N0.6),
[0115]Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu-X-X (SEQ.1D.N0.7),
[0116]X-Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu-X (SEQ.1D.N0.8)。
[0117]在本发明另一实施方式中，本发明的分子复合物包括金属肽复合物，其中该肽是式I的肽的前体或衍生物，以及通过删除I个或2个连续或非连续的氨基酸，或通过在N-端残基和/或C端添加I至3个氨基酸而从中获得的类似物。
[0118]在本发明另一实施方式中，本发明分子复合物结合2至4分子的式I的肽(包括其修饰序列)，以及所述式I的肽的结合通过肽或非肽连接。[0119]还包含在本发明范围内的是包含Zn离子的IMMP复合物和式I的肽的应用，优选具有SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.8的肽，所述肽的N-末端和/或C-末端已被封端。
[0120]类似物的一项应用是比较针对蛋白质降解的稳定性。
[0121]还包括在本发明范围内的是用于从式I的肽、优选从具有SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.8的肽得到本发明复合物的方法，因为通过在生物载体中表达并加入二价离子例如锌，本发明复合物将得以整合。
[0122]本发明复合物的理化性质和生物活性不同于各单独的成分；游离或包含于中性分子中或可转移一对电子的离子化合物中的任意非金属原子或离子可充当供体。受体，即接受并分享该对电子的成分，通常为金属离子。相应地，可以以1:0.1至1:10，000的锌:式I的肽p/p比例范围(摩尔比)形成本发明复合物。
[0123]本发明IMMP复合物的核磁共振研究结果显示当它们与锌相互作用时，谷氨酸(D)的羧基向低场变化( Λ δ +0.027ppm)，而天冬氨酸(E)和L末端羧基则经历了向高场的位移(分别为Λ δ-0.016和-0.051ppm)，这暗示该离子与这些基团的相互作用。
[0124]在本发明的一项实施方式中，包括用于获得本发明IMMP复合物的方法，其特征在于包括以下步骤:
[0125]a)混合pH为7~7.5的缓冲溶液与式I的肽:
[0126]Xn-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu-XmI
[0127]其中Xn和Xm为彼此独立的任意氨基酸，η值为O~4且m值为O~2,
[0128]b)向a)中所得的混合物中加入含有二价离子的溶液，该二价离子选自包含以下离子的组:Zn2+、Cu2+、Mg2+或其混合物，以及
[0129]c)在4°C下，暗处静置b)中所得的混合物足够的时间直至IMMP复合物形成。
[0130]在这个意义上，本发明的IMMP复合物能够通过以下方法得到:例如，取Immol式I的肽加入ImL的pH为7.4的磷酸盐缓冲液(IOOmM)中；随后，往该混合物中逐滴加入二价离子溶液(例如加入二价Zn离子，0.0001~IM的ZnCl2溶液)，从而促使保持pH为7.2。一旦得到所述混合物，将其在4°C下暗处静置14~16小时，随后在-20°C下冷冻至少24小时，如果需要，所得到的最终混合物是冻干的。
[0131]本发明用于人类和动物的药物领域，并且具体涉及在二价阳离子(Zn、Mg和Cu)与式I的肽之间形成的作为新化合物的复合物、获得该复合物的方法、在人和动物中作为药物、营养剂、健康促进剂的用途和用于制造药物或营养剂的用途。
[0132]IMMP复合物的用途为改变免疫应答，减少炎症，和以预防性、治疗性或缓解性方式治疗感染、物理或心理应激、癌症、转移、自身免疫性疾病、纤维化、血小板减少。还包括本发明IMMP复合物用于制造在动物或人中也治疗上述病症的治疗剂(药物)或营养制剂的用途。
[0133]为了本发明的目的在本发明上下文中使用以下术语:
[0134]如本文使用的术语“拟肽(anlog P印tide) ”是指序列中拥有至少50%的氨基酸以相似顺序出现在另一种肽的肽，其可具有相同尺寸，或长或短。
[0135]术语“营养剂(nutraceutical) ”包括能够被认为是能对动物和人类健康提供医疗益处的食物或部分食物的物质、化学品、植物素(phytochemical)和生物化合物。当在混合物中，活性成分的任一种是式I所述的应用于人或动物的金属肽分子复合物时，该营养制剂包含在本发明的范围内。
[0136]如本文使用的术语“继发性免疫抑制”是指归因于某一原因例如感染或化疗等而导致免疫应答低效的病理状态。
[0137]如本文使用的术语“给药(administration) ”或其变形(例如给药(administrating)、给药(administering)等)是指使用本发明的方法和/或材料,提供动物以治疗用制剂或营养制剂并实现使其到达起效的有机体位点的任何用途。因此，它包括:(i)任何给药方式，通用(口服或肠内、肠胃外(静脉内、肌内、皮下或皮下)、透皮、吸入、直肠)或局部(鼻、皮肤等)，或者(ii)间接进入生物载体，该生物载体已经转染了具有编码为式I的肽或一些它的变体的碱基序列的质粒以产生重组产物，以及诱导内源性生成式I的肽的任意方式。
[0138]如本文使用的术语“治疗有效量”是指引发所需生物学响应的必需量。用于动物的IMMP治疗有效量可以在2~2000ng/kg体重，或者等摩尔量的类似物或衍生物，以两次或更多次剂量，彼此间3~10天的间隔给药，这取决于年龄、健康或甚至性别；在动物的情况下，这可能因物种 而不同。因此，所用剂量可根据动物的物种、年龄、健康或甚至性别而不同。
[0139]本发明的药物制剂是指与二价离子络合的任意上述式I的肽的任意化学和物理形式，或者是指所述复合物彼此间的可能混合物，其含有药学上可接受的非活性剂并以一定比例或程度保持式I的肽的活性，向其中加入药物载体(vehicle)，还赋予制剂的贮存稳定性。药物载体的实例包括与有机或无机酸的盐例如醋酸盐、酒石酸盐、三氟醋酸盐、乳酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、柠檬酸盐、甲酸盐、磺酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐或氯化物。为提供所需治疗用的本发明的IMMP的适当剂量，本文所考虑的药物制剂或营养制剂组合物通常会含有0.00001~99.999重量％的本发明的包括载体或稀释剂的金属肽分子复合物。
[0140]总而言之，本发明上下文中的术语“治疗”是指药理学处理人或动物客体以在客体发展(develop)疾病后实现减轻、退化、预防健康疾病(health disease)或紊乱的进展或进程，因此其包括(i)预防或减轻转化指数的影响，(ii)减轻与影响转化指数的生物学状况相干的症状(例如，减轻球虫感染或流行性感冒的影响)，(iii)预防、延缓或减轻与感兴趣的生物学状况相关的并发症、病症或疾病相关的症状的出现(例如:预防、延缓或减轻肠胃疾病或腹泻、球虫病或流行性感冒的出现)。
[0141]如本文使用的术语“共同给药”是指连同另一试剂来给药IMMP，该试剂例如疫苗、抗原、抗生素、抗病毒药、抗寄生虫药、抗球虫药等，通常在等同药物制剂或营养制剂中形成农场预防性或治疗性处理方案的一部分。可连同IMMP给药的治疗药物包括但不限于抗炎药、抗生素、抗菌剂、抗球虫药、维生素、蛋白质、抗体、氨基酸、脂质、益生菌或益生元等。可替代地，上述药物与IMMP可作为单独化合物同时给药，例如，连续、同时或不同时间给药单独的药物组合物。若治疗药物包括肽酶或蛋白酶，则应在不同时间和不同给药位点给药以使IMMP和该治疗药物之间不能具有药理学相互作用并彼此对抗。
[0142]如本文使用的术语“癌症”或其任意变体(恶性瘤、恶性肿瘤)是指特征为出现肿瘤或恶性细胞蓄积(称为致癌的或生癌的)的一组疾病，其通常遭受遗传信息的改变或转换，伴随其它们丧失了响应生长自我平衡控制、增殖和/或凋亡的能力。因此，出现生长和分裂超出正常范围、入侵周围组织并有时产生距离肿瘤(distant tumor)或转移,且威胁生命O
[0143]术语“免疫过敏性”或其任意变体(例如，过敏性、自身免疫、过敏症)是指存在对抗特定分子、细胞和器官的免疫应答，其可在该问题方面的专家认可的以下四项具体表现中任一项中出现:1型的过敏症或过敏性的、II型的对细胞抗原抗体依赖性的抗体、In型的循环免疫复合物或IV型的细胞依赖性或延迟的，或其组合。
[0144]在这个意义上，Rager-Zisman等人(Rager-Zisman, B., 1993)描述了 THF 增强抗病毒免疫应答的能力。然而，Rager-Zisman所示的数据表明使用了相比于本发明所给出的剂量更高的THF剂量，归因于这些化合物效力的本质区别。
[0145]根据表1、2、3、4、5、6、8和9,我们的结果证实本发明IMMP复合物不同于现有技术已存在的那些复合物，例如THF天然分子。
[0146]应当理解本申请中下述实施例仅为示例性目的，并且本领域技术人员在其上下文中可被暗示或进行若干修饰或改变，且这些应该包含在本申请精神和宗旨内。
[0147]实施例1.锌效应和除DTPA外的其它离子对本发明IMMP效应
[0148]在文献中，对于LEDGPKFL肽有效剂量的报道存在广泛差异，且因为之前发现锌离子在胸腺中富集，而且还已报道了存在至少一种结合锌的胸腺肽，因此我们决定采用不同浓度的肽、锌和肽+1 μ M浓度的锌刺激THP-1细胞，因为锌的血浆浓度范围介于7.6至22 μ M0所获结果示于表1中。
[0149]表1.不同LEDGPKFL肽浓度、锌和肽+锌(I μ M)和LPS (0.5 μ g/mL)共刺激对THP-1细胞增殖的比较结果
【权利要求】
1.一种免疫调节剂金属肽，其特征在于包含: a)下式妝:Xn-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu-Xm(I)， 其中:Xn和Xm为彼此独立的任意氨基酸， η值为O~4， m值为O~2，和 b)二价离子，选自包含以下离子的组:Zn2+、Cu2+、Mg2+或其混合物，其中所述肽和所述二价离子通过非共价键彼此连接。
2.根据权利要求1的免疫调节剂金属肽，其特征在于所述二价离子是Zn2+。
3.根据权利要求1的免疫调节剂金属肽，其特征在于所述肽选自包含以下的组:Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu (SEQ.1D.N0.1)、Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu (SEQ.1D.N0.2)、Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu (SEQ.1D.N0.3)、X-Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu (SEQ.1D.N0.4)、X-X-Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu (SEQ.1D.N0.5)、Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu-X (SEQ.1D.N0.6)、Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu-X-X (SEQ.1D.N0.7)y X-Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu-X(SEQ.1D.N0.8)。
4.根据权利要求3的免疫调节剂金 属肽，其特征在于所述二价离子是Zn2+。
5.根据权利要求4的免疫调节剂金属肽，其特征在于所述肽具有下式=Leu-Glu-Asp-GIy-Pro-Lys-Phe-Leu(SEQ.1D.N0.1)。
6.根据权利要求1至5任一项的免疫调节剂金属肽，其特征在于锌离子、镁离子或铜离子:式I的肽的p/p比例为1:0.1~1:10,000。
7.具有免疫调节效应的药物组合物，其特征在于包含根据权利要求1至6的免疫调节剂金属肽，以及药学上可接受的载体。
8.根据权利要求7的药物组合物，其特征在于所述免疫调节剂金属肽的p/p浓度为0.00001%~99.999%。
9.具有免疫调节效应的营养制剂组合物，其特征在于包含根据权利要求1至6的免疫调节剂金属肽，以及营养学上可接受的载体。
10.根据权利要求9的营养制剂组合物，其特征在于所述免疫调节剂金属肽的p/p浓度为 0.00001% ~99.999% O
11.根据权利要求1至6的免疫调节剂金属肽，以治疗和剂量学有效量在人和动物中用作消炎剂或用作免疫调节剂或免疫刺激。
12.根据权利要求1至6的免疫调节剂金属肽，以治疗和剂量学有效量在人和动物中用于增加血液中辅助性T淋巴细胞(⑶4+)和调节性T淋巴细胞(⑶4+⑶25+)的数量。
13.根据权利要求1至6的免疫调节剂金属肽，以治疗和剂量学有效量在人和动物中用于治疗急性、慢性或复发性感染性疾病，治疗慢性炎症的继发性纤维化，治疗肝炎、肝硬化、癌症和转移、血小板减少或血小板减少症，以及用于治疗自身免疫病或免疫过敏。
14.根据权利要求1至6的免疫调节剂金属肽，以治疗和剂量学有效量在人和动物机体中用于治疗表示任意免疫抑制程度的任意应激状态。
15.根据权利要求1至6的免疫调节剂金属肽，用于改善有机体，人或动物，对疫苗的应答。
16.权利要求1至6的免疫调节剂金属肽用于制备抗炎药物的用途。
17.权利要求1至6的免疫调节剂金属肽用于制备免疫调节剂或免疫刺激药物的用途。
18.权利要求1至6的免疫调节剂金属肽用于制备药物或营养制剂的用途，所述药物或营养制剂用于在人和动物中增加血液中辅助性T淋巴细胞(CD4+)和调节性T淋巴细胞(CD4+CD25+)的数量。
19.权利要求1至6的免疫调节剂金属肽用于制备药物或营养制剂的用途，所述药物或营养制剂用于治疗急性、慢性或复发性感染性疾病，治疗慢性炎症继发性纤维化，治疗肝炎、肝硬化、癌症和转移、血小板减少或血小板减少症，以及用于治疗自身免疫病或免疫过敏。
20.权利要求1至6的免疫调节剂金属肽用于制备药物或营养制剂的用途，所述药物或营养制剂用于治疗表示任意免疫抑制程度的任意应激状态。
21.权利要求1至6的免疫调节剂金属肽用于制备药物或营养制剂的用途，所述药物或营养制剂用于改善机体对疫苗或感 染的应答。
22.权利要求1至6的免疫调节剂金属肽的用途，其中所述免疫调节剂金属肽以约2~2000ng/Kg体重的剂量给药，分为两次或多次摄入，彼此间的给药间隔为I~10日，取决于动物物种、年龄、健康状况或类型。
23.药物或营养制剂，其特征在于含有作为药品或活性成分的根据权利要求1至6的免疫调节剂金属肽。
24.获得免疫调节剂金属肽的方法，其特征在于包括以下步骤: a)混合pH为7~7.5的缓冲溶液与下式的肽:Xn-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu_Xm， 其中:Xn和Xm为彼此独立的任意氨基酸， η值为O~4， m值为O~2， b)向a)中所得到的混合物中加入含有二价离子的溶液，所述二价离子选自包含以下的组:Zn2+、Cu2+、Mg2+或其混合物，以及 c)在4°C下黑暗静置b)中所得到的混合物足够的时间直至金属肽的形成。
25.根据权利要求24的方法，其特征在于所述二价离子是Zn2+。
26.根据权利要求24的方法，其特征在于所述肽选自包含以下的组:Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu(SEQ.1D.N0.1)、Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu(SEQ.1D.N0.2)、Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu (SEQ.1D.N0.3)、X-Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu (SEQ.1D.N0.4)、X-X-Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu(SEQ.1D.N0.5)、Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu-X (SEQ.1D.N0.6)、Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu-X-X (SEQ.1D.N0.7)yX-Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu-X(SEQ.1D.N0.8)。
27.根据权利要求26的方法，其特征在于所述二价离子是Zn2+。
28.根据权利要求27的方法,其特征在于所述肽具有下式:Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu (SEQ.1D.N0.1)。
29.根据权利要求24至28任一项的方法，其特征在于锌:式I的肽的p/p比例为1:0.1 ~1:10,000。
【文档编号】A61K38/08GK103974968SQ201180075048
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2011年10月4日 优先权日:2011年9月28日
【发明者】J.A.雷耶斯埃斯帕扎, M.D.L.罗德里格兹弗拉格索, A.L.巴迪洛吉梅内兹, L.J.托里斯阿圭拉, L.U.马丁内兹奥苏纳, A.A.马丁内兹德洛斯里奥斯科西诺, C.A.阿乔娜卡努尔, H.莫拉尔斯罗杰斯 申请人:莫雷洛斯州自治大学