专利名称：用于治疗和预防肠道细菌感染的方法及组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及胃肠道紊乱的治疗或预防，涉及包含有胃肠道病原体抗原的疫苗，涉及从注射所述疫苗的动物(包括家畜和家禽)的血液、乳汁和禽蛋中获得的免疫物质及其制备方法。具体地，本发明涉及用于治疗和预防胃肠道紊乱的化合物和组合物，例如由诸如肠毒性大肠杆菌(E.coli)的革兰氏阴性菌引起的腹泻，本发明还涉及腹泻的治疗或预防方法。
背景技术：
本发明可以用于治疗和预防由一系列微生物所引起的胃肠道疾病，这些微生物包括大肠杆菌(E. coli)、沙门氏菌(Salmonella)、弯曲状杆菌(Campylobacter)、螺旋杆菌(Helicobacter)、弧菌(霍乱菌，Vibrio)、志贺氏菌(Shigelia)、耶尔森鼠疫杆菌(Yersinia)和气单胞菌(Aeromonas)。然而,为了公开起见,本发明将以其针对人体内肠毒性大肠杆菌(ETEC)的应用为例进行说明。应当理解，本发明的范围并不限于这ー个特定的应用。肠毒性大肠杆菌(ETEC)引起的腹泻会给成人带来极大的不适，并能导致未成年人和老年人的脱水死亡。很大一部分前往墨西哥、非洲和东南亚的旅游者所遭受的腹泻就是由ETEC引起的。对于旅游者腹泻，常用的治疗方法是预防性抗生素治疗，例如用阿莫西林治疗。然而，抗生素耐药性降低了抗生素治疗的效果，便秘或腹泻等副作用是常有的。症状性治疗用于治疗呕吐和腹泻，例如用盐酸洛哌丁胺、硫酸阿托品和盐酸地芬诺酷。然而洛哌丁胺和阿托品的使用不当会导致严重的便秘，而地芬诺酯的使用不当会导致依赖性。这些药剂对于孩子们来说也是不适用的。进ー步的治疗包括使用等渗压饮料的流体替代治疗。然而，流体替代治疗几乎不能减轻病情，并且不会减少临床腹泻。进ー步的症状治疗和流体治疗能够治疗症状，但不能根除病因。乳汁和禽蛋制品在减轻胃肠道紊乱疾病的症状中显示出潜在的治疗和预防作用。Peterson和Campbell在美国专利US 3，376，198中介绍了免疫产乳汁的蹄类动物以生产抗细菌和病毒的抗体或“保护性成分”。Carlendar等在BioDrugs, 2002,16 (6) :433-7中介绍了源于鸡蛋黄的抗体在减少胃肠道开ロ部分(口腔)中巴斯德氏细菌中的应用。Shimamoto 等在 Hepatogastroenterology, 2002,49 (45) :709-714 中介绍了鸡蛋中产生的抗幽门螺旋杆菌的特异性抗体在減少胃病患者体内幽门螺旋杆菌数量中的应用。
Linggood等在美国专利US 4，971，794中介绍了高免疫牛初乳作为抗大肠杆菌的抗体源的用途。母牛用混合菌株的菌毛制品进行疫苗接种。该专利介绍该疫苗必须包含表达Type I菌毛、CFA I菌毛、CFA 2菌毛和K88菌毛的多种大肠杆菌菌株的抗原。K88菌毛与猪的ETEC有夫。Hastings在美国专利US 5,017, 372中介绍了蹄类动物的高免疫初乳作为大肠杆菌抗体源的用途。蹄类动物的疫苗用下述方法制造不同类型的大肠杆菌在一定条件下生长得到CFA I或CFA 2，或者两者同时得到。然后细菌用超声波裂解以释放出这些抗原，并加热不稳定的毒素。Freedman 等在 The Journal of Infection Diseases 1998,177 :662-7 中介绍了高免疫初乳作为抗大肠杆菌的抗体源的用途。疫苗的制备是让细菌菌株在肉汤培养基中生长以优化CFA的表达，然后使用沉降法及随后的排阻色谱法或离子交換色谱法纯化CFA。Teckett 等在 The New England Journal of Medicine,1988,5,12. ppl240_1243中描述了在牛的疫苗中引入多种失活(用甲醛或戊ニ醛处理)的细菌完整细胞悬液。所 述完整细胞悬液包含 O 型血清组06, 08，015，020，025，027，063，078，0114，0115，0128，0148, 0153和0159的大肠杆菌以及热不稳定的肠毒素、霍乱毒素、CFAl和大肠杆菌表面抗原 3。大肠杆菌的 O 型抗原如 06，08，015，020，025，027，063，078，0114，0115，0128，0148，0153和0159是热稳定的抗原，位于细菌的细胞壁上而不是诸如菌毛(纤毛)或鞭毛的突出结构上。这些O型抗原由与通常为大多数革兰氏阴性菌细胞壁材料的核脂多糖复合物相连接的多糖的一部分所组成。由于O型抗原与细胞壁之间的紧密联系，基于O型抗原的疫苗可以由细胞壁或完整的失活细菌制得。脂多糖内毒素是细菌细胞外壁的一个常规部分，它们的毒性区域包埋在细胞壁中(參见Endotoxins in Health and Disease. 1999,第12章和其他章节)。在常规的兽医实践中，使用完整细胞细菌抗原优于使用単一 O型抗原组分这样ー个事实的深层原因在于O型抗原是内毒素一就动物福利和产量而言，在孕期牲畜身上使用高浓度内毒素在实践中被认为是有问题的。现有技术中使用乳制品和蛋制品预防胃肠道紊乱症状存在诸多问题。霍乱毒素(參见Teckett等，1988)很可能由于他们的高毒性而难以注册。此外，热不稳定性毒素，尽管有很高的免疫性也难以获得保护。上述方法生产得到的抗体的保护范围难以令人满意。一个附带的问题是要产生令人满意的预防效果需要大量的免疫浓缩物。当使用完整细胞抗原时，会产生许多不同类型的抗体反应，并且抗体滴定度的化验难以标定。一个关键的问题是特定检测的抗体是否有保护性。完整细菌细胞有许多未必与保护性有关的抗原。另外，包含革兰氏阴性菌的疫苗极有可能产生不利的疫苗反应，从而表现出由于不利的动物伦理报告和治疗物品的不利反应报告所帯来的调节问题。不利的疫苗反应很可能会使牛奶厂的农场主停止參与任何生产牛奶抗体的冒险。这里对于本发明背景的讨论用于解释本发明内容。这不应认为是承认任何相关的物质是公开、公知的，或者是任何国家的普通常识部分。
发明内容
发明人惊奇地发现，通过对动物体或人体施以ー种疫苗或抗所述疫苗产生的高免疫物质可以改善对革兰氏阴性菌引起的肠道疾病的治疗或预防。其中所述疫苗的特征在于该疫苗包含有ー种或多种具有O组血清型作用特性或脂多糖相关抗原作用特征的细胞壁抗原，所述抗原中的至少一部分是从细菌细胞壁或细胞壁碎片分离的。因此，本发明一方面提供了一种治疗或预防革兰氏阴性菌引起的肠道疾病的方法，该方法包括向一个个体施以ー种疫苗或者一种抗所述疫苗产生的高免疫物质的步骤，其中所述疫苗包含有ー种或多种具有O组血清型作用特性或脂多糖相关抗原作用特征的细胞壁抗原，所述抗原中的至少一部分是从细菌细胞壁或细胞壁碎片分离的。另ー方面，本发明提供了一种用于治疗或预防革兰氏阴性菌引起的肠道疾病的组合物,该组合物含有通过用ー种疫苗免疫宿主动物而制得的高免疫物质,所述疫苗包含有ー种或多种具有O组血清型作用特性或脂多糖相关抗原作用特征的细胞壁抗原，所述抗原中的至少一部分是从细菌细胞壁或细胞壁碎片分离的。另ー方面，本发明提供了一种用于治疗或预防诸如ETEC的产肠毒素的革兰氏阴性菌引起的胃肠道功能障碍的高免疫物质的制备方法，所述高免疫物质是抗ー种疫苗而产 生的，所述疫苗包含有ー种或多种具有O组血清型作用特性或脂多糖相关抗原作用特征的细胞壁抗原，所述抗原中的至少一部分是从细菌细胞壁或细胞壁碎片分离的。另ー方面，本发明提供了一种细胞壁抗原用于制备治疗或预防诸如大肠杆菌(ETEC)的革兰氏阴性菌引起的胃肠道疾病的高免疫物质的应用，其中所述细胞壁抗原具有O组血清型作用特性或脂多糖相关抗原作用特性，所述抗原中的至少一部分是从细菌细胞壁或细胞壁碎片分离的。另ー方面，本发明提供了一种制备治疗或预防动物胃肠道疾病的免疫球蛋白的方法，包括用一种疫苗免疫宿主动物，所述疫苗包含ー种或多种具有O组血清型作用特性或脂多糖相关抗原作用特征的细胞壁抗原，所述抗原中的至少一部分是从细菌细胞壁或细胞壁碎片分离的，从而诱导宿主动物产生含有所述免疫球蛋白的高免疫物质。根据本发明的方法生产的高免疫物质可以是高免疫初乳或高免疫初乳提取物，或者是高免疫蛋黄或高免疫蛋黄提取物。所述细胞壁抗原中的至少一部分是指从完整细菌细胞壁或者细胞壁碎片中分离得到的，在离心除去完整细胞或者固形细胞碎片后，至少10%的所述抗原能够在上清液中被检测到，该离心步骤应当在下述条件下进行a)所述抗原未形成微团或其他聚集结构，b)没有危及细胞壁的完整性。优选的，至少20%的所述抗原能够在上清液中被检测到，更优选的是至少30%的所述抗原能够被检测到。所述抗原优选的主要从完整细菌细胞壁中分离得到。另ー个用于确定细胞壁抗原是独立的还是从完整细菌细胞壁或细胞壁碎片中分离的方法如下所述1)通过使用剧烈的条件使细胞壁结构降解并释放出O型抗原，对含有O型抗原和革兰氏阴性细菌细胞壁或细胞壁碎片的水溶液进行分析，以确定每毫升中O型抗原的总含量；2)通过培养基培养，革兰氏阴性菌达到特定浓度，使其O型抗原含量与步骤I确定的O型抗原含量相等；3)測量每毫升步骤2的细胞培养液中细胞壁的含量(数量)。所述细胞壁含量自然包含步骤I中测得的O型抗原的水平；4)比较步骤3中细胞壁的含量以及初始溶液中细胞壁的含量。如果相等，则可以推断初始溶液中所有O型抗原都是与细胞壁相结合的。但是，如果初始溶液中细胞壁的含量低于步骤3中细胞壁的含量，则初始溶液中所含的O型抗原的含量大于细胞壁中预期的O型抗原的含量，因此一部分O型抗原是与细胞壁或细胞壁碎片相分离的。如果步骤3中革兰氏阴性细胞壁物质(每毫升)的重量为W，那么每毫升初始溶液中革兰氏阴性细胞壁物质的重量优选的是低于O. 8W，较优选的是低于O. 3W，更优选的是低于O. 1W。水相中脂多糖相关抗原(O型抗原)的量可以用本领域中已知的方法进行測定，这些方法例如加热、蛋白酶K消化以及在苯酹存在下进ー步加热(见实施例11)。Lyngby等描述了其他測定脂多糖相关抗原的方法。一个简单的标定脂多糖相关抗原的方法是与每毫升含有特定量的革兰氏阴性菌或每毫升含有特定量的革兰氏阴性细胞壁物质的细胞培养物相比较。较为有利的是与每毫升含有IO4UO6或108、或者更多微生物的细胞培养物相比较。对于水相中革兰氏阴性细胞壁物质(完整细胞壁或碎片)的量的測定可以使用现有技术中已知的用于特定细胞壁的标准物来分析。例如肽聚糖是与革兰氏阴性菌的细胞壁相关联的，肽聚糖的分析方法Li等已作了描述。
图I显示了由水相制备的LPS分析的银染SDS-PAGE凝胶图谱。SDS-PAGE凝胶显示苯酚预处理前后的样品。处理后凝胶呈现出典型的LPS梯度。作为对照的左边的条带是煮沸后的细菌溶菌液。
具体实施例方式在本发明的下述详细描述中，发明人主要针对从适当的免疫母牛获得的高免疫初乳和高免疫初乳提取物的生产及应用进行描述。但是，本发明的范围不应局限于此，应当理解，本方法同样适用于高免疫鸡蛋黄和高免疫鸡蛋黄提取物的生产。高免疫初乳的制备方法通常包括以ー种疫苗免疫宿主动物，典型的是蹄类动物，所述疫苗含有O组血清型细胞壁抗原，其中至少一部分是从完整细胞壁分离得到。所述疫苗用于在宿主动物体内诱导免疫球蛋白的产生，再从宿主的乳汁中获取免疫球蛋白。高免疫初乳可以用于治疗或预防动物、包括人和非人动物的胃肠道功能紊乱。初乳在人类包括成人和婴幼儿的治疗或预防中尤其有用。初乳还可以用于非人类动物比如小猪的治疗或预防。源自以细胞壁抗原疫苗免疫的宿主动物的高免疫初乳可以直接以乳汁的形式服用，同样的，含有高免疫初乳的乳汁也可以用现有技术已知的方法进行处理，以富集或分离免疫球蛋白。这些产品可以是全脂奶、脱脂奶或乳清蛋白质。高免疫初乳衍的产品可以制成食品添加剤、水溶液、油类制品、乳液、凝胶等等，这些制品可以通过ロ服、局部、直肠、鼻吸、口腔、阴道给药。所述制品的药剂处方可以含有传统的无毒的可接受的载体，并且还可以含有ー种或多种可接受的添加剂，包括可接受的盐、聚合物、溶剤、缓冲剂、赋形剂、膨胀剂、稀释剂、赋形剂、悬浮剂、润滑剤、佐剂、载色剂、释药系统、乳化剤、崩解剂、吸收剂、防腐剤、表面活性剤、色素、香味剂或甜味剂。本发明优选的剂型是加入饮料中的粉剂、丸剤、糖浆、胶囊、片剂、颗粒、滴丸、可咀嚼的药锭或食品添加齐U，使用本领域已知的技术制备。
如果上述组合物以片剂给药，则所述片剂可以由活性成分和ー种或多种任意的附加成分通过压制或者模制制成。压制片剂可以使用合适的机器压制而成，活性成分处于自由流动的形式，例如粉末或颗粒状，可以选择与粘结剂、润滑剂、惰性稀释剂、表面活性剂或分散剂相混合。模制片剂可以采用ー种合适的机器，将粉状活性成分和适当的载体的混合物用惰性液体稀释剂润湿后模制。 O型抗原可以采用有效量的剪切、匀浆、加热或者它们的有效结合从细菌细胞壁中分离。用于分离的优选条件可以通过进行以下试验来确定将完整细胞悬液进行有利于分离的处理后离心，移去完整细胞和固形细胞碎片。收集无细胞的液相产物，根据下列方式上凝胶A)无细胞液体中LPS的分析在前述得到的液体样品中加入等体积的标准苯酚溶液，在65°C水浴中旋转振荡培养15min,姆隔5min旋转振荡一次以使液体中蛋白质变性。在4°C下离心lOmin，回收水相至ー个新的试管中。将I体积的3X的Laemmli缓冲液加入到2倍体积的样品中，在15%的SDS-PAGE凝胶上分离。B) LPS 的银染下述步骤优选的用于LPS的染色(Hitchook和Brown, 1983)(i)在200ml含有25% (v/v)异丙醇的7% (v/v)醋酸溶液中定色过夜；(ii)于150ml蒸懼水中以I. 05g高碘酸和4mI含有25% (v/v)异丙醇的7% (v/V)醋酸溶液(使用前临时配制)氧化5min ；(iii)用200ml的蒸懼水洗漆30min,共洗漆8次；(iv)在组成为 O. IM NaOH(28ml)，浓缩(29. 4% )氨水，20% (w/v)的硝酸银(5ml)以及蒸馏水(115ml)的溶液(使用前临时配制并不断搅拌)中银染IOmin ；(V)用200ml的蒸馏水洗涤lOmin，共洗涤4次；(vi)在250ml显影液(梓檬酸[50mg]、37%的甲醒[O. 5ml]，蒸懼水[カロ至I升])中显影5 IOmin,溶液使用前临时配制并最好在26°C下操作以优化LPS的染色；(vii)浸入终止液(200ml蒸懼水中加入IOml的7% [v/v]醋酸溶液)中Ihr ;(viii)在5%甘油中保存凝胶，并在纤维素膜间干燥。在本发明的一个特别优选的实施例中，O型抗原从细菌细胞壁的分离是通过搅拌液体，例如，通过可以使用匀浆器，特别是安有一个转子和一个定子的匀浆器。优选的，转子外围速率(m/s)与转子-定子间隙(mm)的比值范围为O. 2 20，优选的为O. 4 12，更优选的为O. 8 6，最选的为I 4。可以使用其他匀浆器，只要它们的最大剪切范围内的剪切值与上述转子-定子间隙的剪切值相似。在一个优选的例子中，所述O型抗原从细胞壁的分离是通过在40 80°C的范围内进行加热处理，优选的是在50 70°C的范围内。处理的时间优选的为10 200分钟，更优选的是30 60分钟。优选的，所述疫苗还包含菌毛或类菌毛抗原CFA-UCFA-2或其它CFA，或其它工人的CFA，或者是它们的混合物，所述抗原至少一部分是从完整细菌细胞壁分离的。这些抗原可以与从细胞壁上脱落的菌毛有夫。制备所述分离的抗原或菌毛的方法在现有技术中已有描述，比如Linggood的美国专利US 4，971，794。
优选的，从中分离每个类型的O型抗原的细菌是在単独的细菌培养系统中培养，并且在O型抗原从细菌分离后，所述抗原成分加在一起组成疫苗的成分。优选的，疫苗中血清型O 型抗原选自06, 08，015，025，027，063，078，0114，0115，0128，0148，0153和0159，以及其它与肠毒性大肠杆菌相关的血清型O型抗原。最优选的，疫苗中血清型O型抗原包含078。含有O型抗原的液体可以含有外来的物质。在一个优选的实施例中，所述液体用硫酸铵沉淀外来蛋白质以进ー步纯化，纯化时硫酸铵的浓度从O逐渐增加到20%,并离心除去外来物质。在一个优选的实施例中，所述分离的O型抗原被进ー步浓缩。在一个优选的实施例中，上述液体中加入20 %的硫酸按后，进一步加入硫酸按至终浓度为40 %,并尚心以使O型抗原存在于沉淀中。硫酸铵可以通过重悬和透析除去，例如通过ー种截留尺寸范围为 1500 10000分子量单位(道尔顿)的薄膜。所述透析物质优选的组成为O. I 10mg/ml的蛋白质,更优的是O. 3 3mg/ml的蛋白质，将其加入到疫苗佐剂中，这些佐剂例如Montanide (销售商Seppic,法国巴黎)、氢氧化招(购自Sigma化学公司，St Louis, MO, USA)或QullA(—种由抗原修饰的阜角苷/胆固醇微团组成的ISC0M，在美国专利US 6，383，498中有描述)、或其它现有技术已知的疫苗佐剂。在本发明的一个优选方案中，用于制备疫苗乳剂的佐剂为“Montanide ISA 206”，ー种NRA批准的兽医学的佐剂，由Seppic生产，并由澳大利亚的Tall Bennet供应。Montanide ISA 206是ー种免疫促进复合物，包含有含十八烯酸和无水甘露醇的油性溶液。该产品已被开发用于混合油型疫苗的生产，并且是毒理学控制的，且纯度较高。该佐剂允许制备混合型“油包水包油(w/o/w) ”免疫原/佐剂的乳剂，有效、稳定性好、流动性佳且易于注射。这种类型的配方通过水相中快速起效的抗原产生快速的免疫反应并通过油相中封闭的抗原产生持久的免疫应答。在一个优选的实施例中，I体积获得的透析物质加入到0. 3 3体积的疫苗佐剂中，优选的是0. 7 I. 5体积的疫苗佐剂中。蛋白质分析的许多方法是现有技术已知的，例如 Lowrey 蛋白质分析法(J. Bio. Chem. 1951，193 :265-275)。接种疫苗导致高免疫初乳的产生，优选的是在动物分娩前对动物注射2到8次疫苗，注射量为0.3 15ml。连续两次免疫的时间间隔为I 4周，更好的是2 3周。初乳是从哺乳动物，优选的是从蹄类动物，更优选的是从奶牛获得的。美国专利US 5，780，028提供了初乳的生产和加工，在此引作參考。经处理的高免疫初乳可以制成片剂、胶囊内的粉剂或加入饮料内的添加剤，如美国专利US 5，780, 028中所描述。优选的，含有高免疫初乳的配方还含有ー种食品级的抗菌剂组分，比如柑橘提取物以及碘基防腐剤。在一个优选的实施例中，所述抗菌剂组分是双酚羟基苯化合物家族中的葡萄柚种子提取物，美国佛蒙特州Ripton的Nutribiotics公司有售，商品名为Citricidal0优选的用于ロ服制剂配方高免疫初乳包含有抗多种抗原的抗体。所述优选的高免疫初乳的获得是通过分离所述抗原加入到两批或多批疫苗中，并用单ー批次的疫苗免疫两批或多批家畜，并将从家畜获得的的初乳混合。在一个优选的实施例中,所述疫苗包含大肠杆菌O型抗原,这些抗原选自06,08,09，015，020，025，027，029，030，063，064，078，088，0105，0114，0115，0126，0127，0128，0148，0153，0159。优选的，一个批次的疫苗含有大肠杆菌078抗原和CFA I菌毛抗原，而其他批次的疫苗包含以下抗原06, 08，015，025，027，063，078，0114，0115，0128，0148，0153，0159 血清型O型抗原和CFA2菌毛抗原。在一个优选的实施例中，所述血清型O型抗原选自06，08，078，0128。
本发明最广阔的前景是应用于治疗和预防多种微生物引起的胃肠道疾病，特别适合于治疗胃肠道毒性大肠杆菌感染，并特别适用于治疗和预防旅游者腹泻。因此，本发明的ー个特别优选的实施例涉及ー种上述的方法或应用，其中革兰氏阴性菌为大肠杆菌。在最优选的实施例中，所述方法用于预防和治疗腹泻。以下结合实施例对本发明进行说明。应当理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。实施例I、单ー菌株大肠杆菌疫苗的生产本实施例描述了本发明的疫苗的制备方法，其中的细胞壁抗原为078，菌毛抗原为CFA I方法。过程如下第O 天步骤A、菌株的复壮将被复壮的菌株是E.coli H10407 (Taurchek等，PNAS USA. 2003,99 :7066-7071)。从培养基冰箱取2个CFA平板(Evens等，InfectImmun. 1977，18 =330-337)，置于生物安全操作柜。将装有E.coli H10407的小瓶从液氮罐中取出，放入生物安全操作柜。打开小瓶，用灭菌的接种环取出少量冻化物，在CFA平板上划线。“复壮平板”于培养箱中在通气条件下37°C培养过夜。第I 天步骤B、“初始悬液”的接种检测每个“复壮平板”是否染菌，如未染菌则继续。操作在生物安全操作柜中进行，用灭菌的接种环从ー个“复壮平板”上取出少量菌落，接种到ー个含有20ml pH 7. 2磷酸缓冲溶液(PBS)的McCartney瓶中。所用的McCartney瓶和PBS均经过高压灭菌。步骤C、“疫苗平板”的接种将50 μ L “初始悬液”接种到每一个复合CFA平板上(配制成微生物营养平板以产生CFA)。CFA平板的配制以I %酸解酪素(BD Difco)和O. 15%酵母提取物(Oxoid)加入含有O. 005 ^MgSO4 (无水)和O. 0005% MnCl2 (四水合物)的2%琼脂中，见Evens等的培养基制备(Evens等，InfectImmun. 1977，18 =330-337)。“疫苗平板”置于37°C培养箱中，通气条件下培养18 24小时。第2 天步骤D、“疫苗平板”上用于测试菌毛产量的血凝实验
进行血凝实验(Evens等，InfectImmun. 1977,18 :330-337)。为批次中将被使用的每ー个菌株测试ー个“疫苗平板”。如为阳性则继续。步骤E、“疫苗平板”的洗涤将“疫苗平板”从培养箱中取出，检测每个平板以防止染菌，弃去染菌的平板。操作在生物安全操作柜中进行，用I. 5 2. Oml灭菌的O. IM磷酸钠缓冲溶液(pH7. 2)洗下“疫苗平板”表面的细菌培养物，加入到灭菌的Schott瓶中。缓冲溶液使用前在冰浴中预冷。将叠氮钠加到“疫苗洗液”中使之终浓度为0.05%。在“疫苗洗液”开始匀浆前在冰浴中保持至少30分钟。步骤F、“疫苗洗液”的计数对“疫苗洗液”进行计数。确保所用物料被充分搅拌以使细菌团块分散，并且所选稀释液与每批制备的洗液中细菌细胞的浓度相适应。 步骤G、純度取样收集足够的物料用于测试每ー个“疫苗洗液”的纯度(即3个HBA平板，3个TSA平板和3个MAC平板)。操作在生物安全操作柜中进行，用每ー个“疫苗洗液”在3个HBA平板，3个TSA平板和3个MAC平板上划线，用于平板筛选单ー菌落。将这些平板置于37°C培养箱在通气条件下培养。第3 天步骤H、“纯度试验平板”的第一次检杳对“纯度试验平板”进行第一次检查。如平板上仅含有E. coli菌落，则继续。步骤I、“疫苗洗液”的匀浆将“疫苗洗液”在匀浆器中，每隔I分钟匀浆一次，共15分钟，毎次间隔的I分钟置于冰浴中冷却。将“匀浆的疫苗洗液”在高速离心机中于12000Xg、4°C下离心20分钟。保留上清液(HVW上清I)，于4°C下储藏I 3天。第4天步骤T、“纯度试验平板”的第二次检杳对“纯化实验平板”进行第二次检查。如平板上仅含有E. coli菌落，则继续。第6天步骤K、LPS组分的分离将HVW上清I在高速离心机中于12000Xg、4°C下离心20分钟。保留上清液(HVW上清2)。在I个小时内往HVW上清2中缓慢加入灭菌的饱和硫酸铵溶液至达到20%的饱和度。加入硫酸铵饱和溶液的过程中，将HVW上清2置于磁力搅拌器上搅拌。加料结束后让物料平衡30分钟。将HVW上清2在高速离心机中于12000Xg、4°C下离心20分钟。保留上清液(HVW上清3)。在I小时内往HVW上清3中慢慢加入灭菌的饱和硫酸铵溶液至达到40 %的饱和度。加入硫酸铵饱和溶液的过程中，将HVW上清3置于磁力搅拌器上搅拌。加料结束后让物料平衡30分钟。
将HVW上清3在高速离心机中于12000Xg、4°C下离心20分钟。保留沉淀(LPS组分)。将LPS组分用冷的O. 05M pH 7. 2的磷酸钠缓冲溶液重悬，悬浮比率是每250个CFA平板IOml缓冲溶液，所述CFA平板用于产生“疫苗洗液”，LPS组分最初就是从“疫苗洗液”获得。步骤L、LPS纟目分的诱析透析LPS组分，用截留量3500丽的透析膜 在4°C下于250 1000倍体积的O. 05MpH7. 2的磷酸钠缓冲溶液中透析24 48小时。透析过程中，每2 8小时更换缓冲溶液。透析结束后，将“LPS透析液”置冰浴保藏直至用于蛋白质含量分析。第7天步骤M、“LPS透析液”的蛋白质含暈分析用Lowry蛋白质分析法测量每一“LPS透析液”中的蛋白质含量。在分析结果的基础上稀释每一“LPS透析液”，直至O. 05M pH 7. 2的磷酸钠缓冲溶液中蛋白质含量为lmg/ml,然后置于灭菌的Schott瓶中保存。步骤N、疫苗的灭活在每一“LPS透析液”中加入甲醛直至甲醛的终浓度为3%。将“福尔马林化的LPS透析液”于4°C下保藏3天。第10 天步骤O、无菌检测部分I通过将O. 5ml“福尔马林化的LPS透析液”接种入3个TSB试管肉汤中，对每个“福尔马林化的LPS透析液”进行基本的无菌检測。“无菌检测试管”置于37°C培养箱中在通气条件下培养。第14 天步骤P、无菌检测部分2检测“无菌检测试管”是否生长缺乏。如纯生长缺乏则继续。(步骤Q)“福尔马林化菌毛/LPS透析液”的保存将“福尔马林化的LPS透析液”置于20°C以下以长时间保存。第14天或以后步骤R、辅佐阶段I将“福尔马林化的LPS透析液”置于水浴中至30°C。同时将等体积的佐剂(Montanide ISA 206)置于水浴中至 30°C。将佐剂倒入经高压蒸汽灭菌的大烧杯中(S13)。用有3个叶片桨的Ika混合器以200rpm的速率搅拌佐剂。在2分钟内逐渐加入“福尔马林化的LPS透析液”。将转速提高至2000rpm维持10分钟。于40°C保存24小时。第15天或以后步骤S、辅佐阶段2在上述步骤L后的第一天，将“阶段I辅佐的疫苗”置于水浴中至30°C。将加热后的物料倒入经高压蒸汽灭菌的大烧杯中(S13)。用有3个叶片桨的Ika混合器以200rpm的速率搅拌物料2分钟。将转速提高至2000rpm维持10分钟。在4°C下保存24小吋。
步骤T、检测乳化液的质暈在步骤M后的第一天，用巴斯德吸管吸取一小份“阶段2辅佐的疫苗”。用大约200ml的水装入250ml的烧杯中。将一滴“阶段2辅佐的疫苗”滴在水面上。如果液滴部分自稀释，在水面上呈现牛奶状表面，则它是水包油包水的，是可接受的。在4°C下保存24小时。 第16天或以后步骤U、装里在生物安全操作柜中，用经高压蒸汽灭菌的漏斗和量筒量取适当体积的疫苗。对于250ml的枕头包，其体积为253 255ml。将该物料倒入经Y -射线灭菌的枕头包中，然后用经高压蒸汽灭菌的橡皮塞和金属盖封闭枕头包的上ロ。重复该过程直至每批枕头包达到合适的数量。步骤V、保留取样取ー个保留样品。步骤W、用于无菌测试和游离的福尔马林水平测试的QC取样用装填结束后剩余的物料,取20ml样品装入经蒸汽灭菌的McCartney瓶中。使用装填剰余物料的同样的漏斗和量筒。该样品来进行无菌测试和游离福尔马林水平测试。步骤X、贴标签将甸批样品贴上标签。于冰箱中保存。步骤Y、第一次无菌检测装填结束后第四天，如无菌检测所述对“无菌检测试管”和“无菌检测平板”进行第一次检测。步骤Z、第二次无菌检测装填结束后第七天，如无菌检测所述对“无菌检测试管”和“无菌检测平板”进行第二次检测。步骤AA、第三次无菌检测装填结束后第十一天，如无菌检测所述对“无菌检测试管”和“无菌检测平板”进行第三次检测。步骤AB、第四次无菌检测装填结束后第十四天，如无菌检测所述对“无菌检测试管”和“无菌检测平板”进行第四次检测。步骤AC、产品应用如果满足下述规格，所述批次是可以应用的 物理形态塑料枕头包中呈奶油状的液体，贴有包含名称为“ Anadis E.coliVaccine”的经核准的标签。 纯度第一和第二次纯度检测中，每ー菌株的所有纯度试验平板上均呈现E. coli的纯生长现象。 无菌性在无菌性检测和初始正式的无菌检测时，平板上或试管中均没有任何生长的迹象，或者在描述的无菌检测的再次检测过程中也没有任何生长的迹象。
效カ:得到的产品中每毫升含有大于或等于I. Oml蛋白质。 游离的福尔马林水平QC样品中该水平不超过O. 002% w/v ο 乳化质量一滴乳化的疫苗滴于水面上，部分自稀释，在水中呈现奶油状。实施例2、高免疫初乳的制备实施例制得的疫苗按以下方法用于制备高免疫初乳让注册兽医用乳化的含有佐剂的疫苗以2ml的注射量 通过脖子侧面的肌肉注射免疫母牛。妊娠期为6 8. 5个月的母牛每隔2周注射一次，共注射5次，于分娩前I个月停止。取挑选的免疫母牛的血液进行检测，并分析以确定特定抗体的水平。分析结果用于确定是否达到了令人满意的滴定度。为了限制自主接种的可能性，免疫只让注册兽医实施，并让有经验的牲畜饲养人员协助。免疫期间，应对母牛进行适当限制，比如避免赛跑、拥挤、处于旋转的挤奶场，以保持脖子肌肉的清洁。注射部位在免疫前进行修剪并消毒，随后的注射在同一牲畜的交替部位上进行。收集首次挤奶得到的新鮮高免疫初乳后的制备方法如下所述。实施例3、疫苗的制备本实施例描述的疫苗的制备根据现有技术的典型过程进行。牛疫苗和抗E. coli H10407、菌毛抗原以及毒素的初乳抗体按照下述方法制备初乳抗体的制备。从用肠毒性E. coli菌株H10407、一种挑选的菌毛抗原和热不稳定的肠毒素(LT)免疫的母奶牛的初乳中分离抗体。母牛处于兽医的监管下，并圈养在试验用的奶牛场。參见J. Husu等(1993)。疫苗制备。用于生产疫苗的细菌抗原由肠毒性E.coli菌株H10407 (078 :H11 CFA/I+ ST+ LT+)制得。三个抗原由该菌株纯化而得(i)福尔马林灭活的完整细胞悬液(IO9个细菌/ml)(ii)热不稳定的肠毒素(2mg/ml)(iii) CFA/I (2mg/ml)疫苗的制备是将等体积的每种抗原与等体积的Freund不完全佐剂进行乳化而得。除了上述抗原外，还用到一种市售的含有从E. coli K88ac、K99和987P的菌毛抗原提纯的油性佐剂疫苗(E. coli Vaccine ；Commonwealth Serum Laboratories Ltd)。初乳的加工和乳清免疫球蛋白的分离。收集哺乳期第一周的免疫母牛的初乳。乳液收集到単独的容器中，冰冻保存直至加工。简而言之，离心除去牛奶脂肪，脱脂牛奶用巴氏德法在56°C消毒30分钟，然后通过凝乳而凝結。除去含有酪蛋白的凝乳，将乳清离心，弃取细小的沉淀。在持续搅拌下将等体积的饱和硫酸铵溶液慢慢加入到乳清中。离心后，收集得到的沉淀，弃去含有乳糖和盐的上清液。沉淀物溶于相当于原溶液体积的30%的0. 32M NaCl中。该溶液进ー步在具有螺旋式透析膜SIY 30筒的Amicon设备中用5体积的盐液透析。抗体溶液浓缩至固体含量为10%，快速冷冻，并冻干。最后，冻干的抗体粉末用 射线(25KGrays)灭菌。參见 Hilpert (1984) ,Antibodies-A Laboratory Manual (1988)
和 Cravioto 等(1982)。
实施例4、从细胞壁分离的O型抗原的测定本实施例提供了一种产生106CfU/ml革兰氏阴性菌、从这些细菌提取O型抗原以及检测从这些细菌的细胞壁分离的O型抗原的量的方法。本实施例的方法能够计算出“LPS-细菌当量”ー这是含有给定量的LPS的细菌的数量值。以下实施例中，3mg/ml的LPS等同于106cfu/ml的革兰氏阴性菌ETEC。试剂磷酸缓冲液盐(PBS)按下表制备的SDS-PAGE裂解缓冲液(20ml)
最终
2 M Tris-HCL pH 6.8 10.0 ml(IM)
dH202.4 ml
10% SDS4.0 ml(2%)
甘油2.0 ml(10%)
0.05% 溴酚蓝0.8 ml(0.002%)*在使用前每960 μ L缓冲液中加入40 μ L 2_巯基こ醇(4% )步骤I、细菌菌株在营养琼脂平板(NA)上于37°C下培养过夜。2、第二天收集细菌加入到PBS,并达到O. 5McFariane当量(I X 108cfu/ml)。3、细菌悬液用PBS稀释100倍至I X 106cfu/ml。4、稀释液等分成Iml的式样量至灭菌的Eppendorf试管中，于13000rpm离心3分钟形成菌团。5、离心后弃去上清，菌团在50μ L SDS-PAGE裂解液中重悬。6、然后将样品煮沸10分钟，迅速用冰冷却，并在离心机中脉冲以收集浓缩液。7、将2. 5μ L蛋白酶K(20mg/ml)加入到每个试管中，于60°C水浴中保温I小时。8、保温结束后，向每个试管中加入等体积的苯酚，旋转振荡，然后进ー步在65°C的水浴中保温15分钟，每5分钟旋转振荡一次。9、样品于4°C下离心10分钟，取水相加入到新的试管中用于LPS的定量分析。LPS的定量分析色原内毒素检测(LAL)是ー种革兰氏阴性菌的内毒素定量测试方法。将样品与试剂盒中提供的LAL混合并于37°C保温10分钟。然后将底物溶液与LAL样品混合并进一歩于37°C保温6分钟。然后加10%的SDS終止反应。如果样品中有内毒素，将检测到吸光度为405nm的黄色。利用内毒素标准曲线测算样品中内毒素的量。I、苯酚抽提的LPS样品用LAL试剂水稀释到1ml，另外的稀释液用于LAL分析(1/10，1/50，1/250，1/1250)。2、用LAL试剂水制备两份连续稀释液，制备的内毒素标准稀释液用于制作标准曲线(3 O. 02 μ g/ml)。
3、96 孔板法
样品空白
测试样品或内毒素标准50 μ -
LAL试剂水-50 μ
LAL50 μ 50 μ
混合并在37°C下保温10分钟
显色底物100 μ 100 μ混合并在37°C下再保温6分钟
终止缓冲液(10% SDC)50 μ 50 μ 在ELISA平板阅读器上读取OD 405nm的数值4、绘制得到OD测量值的标准曲线(0D对内毒素浓度)。5、通过读取标准曲线的OD计算未知样品的内毒素浓度，然后计算所含内毒素的量。实施例5、高免疫初乳提取物用于人的治疗通过ロ服用源于经细菌抗原和毒素免疫的牛的牛初乳提取物制备的药片防止由肠毒性大肠杆菌(ETEC H10407)引起的腹泻。药片由Anadis有限公司用经多种细菌抗原和毒素免疫的奶牛的初乳制备得到。两项双盲试验包括总共90个健康志愿者，通过服用对抗剂量为1-2 X IO9E. coli 078的药片(和安慰剂)来测试保护效果。有30个參与人员的第一次研究评估含有400mg用碳酸氢钠缓冲液提取的初乳提取物的药片的效果。该治疗组的保护效果为93.4%，相比之下，安慰剂治疗组的保护效果仅为26. 7%。第二次研究试验，含有400mg用缓冲液提取的初乳提取物的药片的保护效果为85. 7%，非缓冲液提取的初乳提取物的药片的保护效果为80% ;含有200mg非缓冲饮料提取的初乳提取物的药片的保护效果为64. 3% ;相比之下，安慰剂治疗组的保护效果仅为14. 3%。在防止志愿者对抗致病剂量的肠毒性大肠杆菌引起的腹泻临床症状时，有活性的药片组方的治疗效果明显(P <0.001)好于安慰剂。研究表明，含有对抗多种肠毒性细菌和毒素的抗体的牛初乳提取物的药片组方具有潜在的防止与这些细菌有关的临床性腹泻的作用。缓冲液提取物和非缓冲液提取物的差别不是很大。实施例6、高免疫初乳提取物用于人的治疗本实施例描述的对人的保护试验使用的初乳药片通过实施例3描述的疫苗诱导的高免疫初乳制备得到。招募了 22个健康成年志愿者并予以登记以进行双盲试验。其中一半服用以碳酸氢钠溶液提取的大肠杆菌特异性牛免疫球蛋白药片，另一半服用以碳酸氢钠溶液提取的脱脂乳安慰剂。志愿者进行分派治疗，每天服用3次，共7天。第七天一种挑战性的IXlO9E. coli菌株H10407(ETEC 078)作为饮料发放给所有參与者。然后观察參与者的ETEC诱导的胃肠道疾病症状。
各组中腹泻的发病率为产品组4/11，安慰剂组7/11 (P = 0.2)。与安慰剂组相比，(高免疫初乳药片的)治疗提供了 44%的抗ETEC H10407引起的腹泻的预防功效。实施例7、抗体滴定度检测方法本实施例描述了完整E.coli细胞涂覆于微量滴定平板上的Elisa分析方法。该分析方法是ー种抗体滴定度的分析方法，显色反应是由羊抗牛IgG-过氧化物酶共轭物催化的。含有O. 5微克的加热致死的E. coli细胞的100 μ L碳酸钠-碳酸氢钠涂覆缓冲溶液分配于96孔Maxisorp免疫平板(Nunc, Roskilde,Denmark)的姆个孔中，4°C过夜。孔板以含有 137mM NaCl，I. 5mM KH2PO4,0. 8mM Na2HPO4,pH 7. 4 的 PBS-0. 05% Tween 缓冲液洗涤6次。将100 μ I每种测试血清或初乳用含有12mg/ml酪素的PBS-Tween稀释，加入每个孔中并于37°C下保温2h。孔板用PBS-Tween缓冲溶液洗涤6次，此后100 μ I羊抗牛IgG-过氧化物酶共辄物(Southern Biotacnology Associates, Inc. , Birmingham, AL, USA)用PBS-Tween-酪素按I : 4000的比例稀释，加入到每个孔中。孔板于37°C保温lh，并洗涤6 次。将 100 μ I 过氧化物酶底物(Kirkgaard and Perry Lab, Inc. , Gaithersburg,MD, USA)加入姆个孔中并置室温直至显色。加入2M硫酸终止反应,孔板在Diagnostics PasteurLP400孔板读取器(Sanofi,Mames-la-Coquette,France)于450mm读取。结果通过对至少两个独立样品的重复孔的平均剰余O.D.值(减去空白样读数后)的分析来表示。实施例8、选择性的免疫方案使用实施例I的方法制备的抗原生产血清抗体。母牛的免疫方法如实施例2所述，只是三次注射的中间间隔为2周。最后一次注射两周后，取血样进行抗体滴定度检測。实施例9、使用完整细胞抗原生产血清抗体为了比较分离的细胞壁抗原和完整细胞抗原的免疫反应的目的，使用下述方法生产抗完整细胞抗原的血清抗体。完整细胞抗原按下述方法制备将E. coli H10407接种在IOOml Luria肉汤培养基中，在振荡下37°C保温过夜。得到的培养物通过离心得到细菌小球，再悬浮于IOOml灭菌的PBS缓冲液中，并于100°C加热2. 5小吋。蛋白质浓度的測量用Bio-Rad蛋白质分析法，并调节至lmg/ml。使用佐剂如实施例I所描述。母牛用实施例7的方法进行免疫，血样的收取如实施例7所描述。实施例10、完整细胞抗原与分离的细胞壁抗原的比较按照实施例7的方法取自A组(18头母牛)的血清按照实施例7所描述的方法进行Elisa分析。按照实施例9的方法取自B组(14头母牛)的血清按照实施例6所描述的方法进行Elisa分析。结果为
A组B组
EIA单位(平均)86096
EIA 单位(范围)300-160030-300用本发明的疫苗(A组)产生的抗体的滴定度明显高于用完整细胞疫苗(B组)产生的抗体的滴定度。该结果令人惊奇，因为该滴定度是用完整细胞固定在Elisa平板上而检测得到的。实施例11、动物安全性通过对根据实施例2的方案免疫的1200头奶牛的ー项调查显示，没有明显的福利问题或者副反应或者产量的減少。实施例12下述分析基于母牛初乳中抗体的应用来进行定居因子(colonisation factor)的免疫印迹分析。根据本发明的方法制得的抗体，附带将CFA(菌毛)合并入疫苗。籲缓冲液和试剂
IOXTris/甘氨酸/SDS电泳缓冲液Tris 15g甘氨酸 72gSDS5g用dH20制成I升，以1/10稀释以制备“工作溶液”。转移缓冲溶液(IOOml)
Tris0.56 g
甘氨酸0.30 g
dHiO80 ml
甲醇20 ml
10% SDS360 μ 按上述顺序混合各试剂并冷藏直至使用。3 X Laemmli 缓冲液(8ml)
dH200.8 ml
0.5 M Tris-HCl pH 6.83.0 ml
甘油2.4 ml
SDS0.48 g
2-β_巯基乙醇*1.2 ml
0.05% (w/v)溴酿蓝0.6 mlt*使用时加入。将I体积的Laemmli缓冲液与2体积的样品混合。籲粗制定居因子的制备将肠毒性大肠杆菌(ETEC)菌株接种在一式两份的CFA培养平板上，于37°C培养过夜(CF生产)，然后置室温下(CF生产抑制)。刮取一半平板的细胞加入Iml的PBS中，上下吸取以重悬。简单旋振。
将细胞悬液置于60 °C水浴中保温30min以释放定居因子。离心(14，000rpm/20min)得到细胞小球，回收上清液移至干净的试管中。制备的粗制品中应当含有定居因子和LPS,这是所用菌株表达的。· SDS-PAGE将15% SDS-聚丙烯酰胺凝胶和4%积层凝胶按下表灌胶
权利要求
1.抗ー种疫苗所产生的高免疫物质在制备治疗或预防革兰氏阴性菌引起的肠道疾病的ロ服药物制剂中的应用，其特征在于，所述疫苗含有一种或多种细胞壁抗原，该抗原具有O组血清型作用特性或脂多糖相关抗原作用特征，所述抗原的至少一部分是从细菌细胞壁或细胞壁碎片分离的。
2.如权利要求I所述的应用，其特征在于，所述疫苗包含ー个水相，且所述抗原为ー种脂多糖相关抗原，每毫升所述疫苗的所述水相中脂多糖相关抗原的量大于每毫升104/ml的革兰氏阴性菌培养液中脂多糖相关抗原的量。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，每毫升所述疫苗的所述水相中脂多糖相关抗原的量大于每毫升io6/mi的革兰氏阴性菌培养液中脂多糖相关抗原的量。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，每毫升所述疫苗的所述水相中脂多糖相关抗原的量大于每毫升108/ml的革兰氏阴性菌的培养液中脂多糖相关抗原的量。
5.如权利要求I所述的应用，其特征在于，所述脂多糖相关抗原中的至少20%是从细菌细胞壁或细胞壁碎片分离的。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述脂多糖相关抗原中的至少40%是从细菌细胞壁或细胞壁碎片分离的。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述脂多糖相关抗原中的至少60%是从细菌细胞壁或细胞壁碎片分离的。
8.如权利要求I所述的应用，其特征在于，所述疫苗包含ー个水相，每毫升该水相中所含脂多糖相关抗原的重量与每毫升细胞壁物质重量为W的革兰氏阴性菌培养液中发现的脂多糖相关抗原的重量相等，而每毫升该水相中革兰氏阴性菌细胞壁或细胞壁碎片的重量小于O. 8ffo
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述疫苗包含ー个水相，每毫升该水相中所含脂多糖相关抗原的重量与每毫升细胞壁物质重量为W的革兰氏阴性菌培养液中发现的脂多糖相关抗原的重量相等，而每毫升该水相中革兰氏阴性菌细胞壁或细胞壁碎片的重量小于O. 3ffo
10.如权利要求9所述的应用，其特征在干，所述疫苗包含ー个水相，每毫升该水相中所含脂多糖相关抗原的重量与每毫升细胞壁物质重量为W的革兰氏阴性菌培养液中发现的脂多糖相关抗原的重量相等，而每毫升该水相中革兰氏阴性菌细胞壁或者细胞壁碎片的重量小于O. 1W。
11.如权利要求I所述的应用，其特征在于，所述疫苗进ー步含有菌毛或类菌毛抗原CFA-I或CFA-2、或者其它定居因子或公认的定居因子、或者是它们的组合，所述抗原中至少一部分是从细菌细胞壁或细胞壁碎片分离的。
12.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述疫苗包含ー个水相，每毫升所述水相中CFA的量大于每毫升在促进CFA生成的培养条件下生长的IO4革兰氏阴性菌的培养液中CFA抗原的量。
13.如权利要求12所述的应用，其特征在干，每毫升所述水相中CFA的量大于每毫升在促进CFA生成的培养条件下生长的IO6革兰氏阴性菌的培养液中CFA抗原的量。
14.如权利要求13所述的应用，其特征在干，每毫升所述水相中CFA的数量大于每毫升在促进CFA生成的培养条件下生长的IO8革兰氏阴性菌的培养液中CFA抗原的量。
15.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述CFA抗原中的至少20%是从细菌细胞壁或细胞壁碎片分离的。
16.如权利要求15所述的应用，其特征在于，所述CFA抗原中的至少40%是从细菌细胞壁或细胞壁碎片分离的。
17.如权利要求16所述的应用，其特征在于，所述CFA抗原中的至少60%是从细菌细胞壁或细胞壁碎片分离的。
18.如权利要求I所述的应用，其特征在于，所述脂多糖相关抗原从细菌细胞壁的分离是通过匀浆或者加热的方式、或者是它们的有效组合。
19.如权利要求18所述的应用，其特征在于，所述匀浆是在转子-定子装置中进行的，其中转子的外围速率(m/s)与转子-定子间隙(mm)的比值在O. 2 20的范围内。
20.如权利要求19所述的应用，其特征在于，所述转子的外围速率(m/s)与转子-定子间隙(mm)的比值在O. 4 12的范围内。
21.如权利要求20所述的应用，其特征在于，所述转子的外围速率(m/s)与转子-定子间隙(mm)的比值在O. 8 6的范围内。
22.如权利要求18所述的应用，其特征在于，匀浆器中高剪切区域的剪切速率与权利要求19的转子-定子装置所产生的剪切速率相当。
23.如权利要求18所述的应用，其特征在于，所述脂多糖相关抗原从细胞壁的分离是通过在40 80°C的范围内持续加热处理10 200分钟。
24.如权利要求23所述的应用，其特征在于，所述脂多糖相关抗原从细胞壁的分离是通过在50 70°C的范围内加热处理。
25.如权利要求23或24所述的应用，其特征在于，所述脂多糖相关抗原从细胞壁的分离是通过持续加热处理30 60分钟。
26.如权利要求I 25中任ー项所述的应用，其特征在于，所述革兰氏阴性菌选自螺旋菌属、弧菌属、肠杆菌属。
27.如权利要求26所述的应用，其特征在于，所述革兰氏阴性菌为大肠杆菌。
28.如权利要求27所述的应用，其特征在于，所述大肠杆菌为ETEC、EHEC或EPEC。
29.如权利要求28所述的应用，其特征在于，所述革兰氏阴性菌是ETEC，且所述脂多糖相关抗原选自以下 O 型抗原组06, 08，015，020，025，027，063，078，0114，0115，0128，.0148，0153，0159和其它与肠毒性大肠杆菌相关的血清型O型抗原。
30.如权利要求29所述的应用，其特征在于，所述脂多糖相关抗原包含078。
31.如权利要求29所述的应用，其特征在于，所述分离的O型抗原通过硫酸铵沉淀法纯化。
32.如权利要求31所述的应用，其特征在于，初始的沉淀作用用于去除外来蛋白质，而最后的沉淀作用用于从沉淀物获取O型抗原。
33.如权利要求29所述的应用，其特征在于，所述疫苗包含至少两种O型抗原，単一的O型抗原是在单独的细菌培养基中生长并分离的，在単一的O型抗原从细胞壁分离后，所述抗原被一起加入疫苗中。
34.如权利要求33所述的应用，其特征在于，所述疫苗还包含CFA-I和/或CFA-2。
35.如权利要求34所述的应用，其特征在于，所述至少两种O型抗原包括大肠杆菌078抗原和CFA I菌毛抗原，所述至少两种O型抗原选自以下组06，08，015，025，027，063，078，0114，0115，0128，0148，0153，0159 血清型 O 型抗原和 CFA 2 菌毛抗原。
36.如权利要求35所述的应用，其特征在于，所述疫苗包括ー种佐剂，该佐剂选自Montanide、QullA、氢氧化铝中的ー种或多种。
37.如权利要求I 36中任ー项所述的应用，其特征在于，所述高免疫物质的制备是通过用所述疫苗免疫宿主动物以弓I发对所述疫苗的免疫反应，然后从所述免疫动物收集高免疫物质。
38.如权利要求37所述的应用，其特征在于，所述高免疫物质包括高免疫初乳或高免疫蛋黄。
39.如权利要求38所述的应用，其特征在于，所述高免疫初乳的制备是通过将所述抗原分成两批或多批单ー的疫苗，井分别以单ー批次的疫苗免疫两批或多批牲畜，接着将来自牲畜的初乳混合。
40.如权利要求39所述的应用，其特征在于，所述高免疫物质至少通过过滤、巴氏德消毒和/或除去异相的方法被部分纯化。
41.如权利要求40所述的应用，其特征在于，所述高免疫物质还包含ー种食品级的抗菌剂组分。
42.如权利要求41所述的应用，其特征在于，所述食品级的抗菌剂组分选自由乳铁传递蛋白、柑橘提取物或碘基防腐剂中的ー种或多种。
43.一种用于治疗和预防革兰氏阴性菌引起的肠道疾病的组合物，其特征在于，该组合物含有具有O组血清型作用特性或脂多糖相关抗原作用特性的高免疫物质，该高免疫物质是通过用ー种含有一种或多种细胞壁抗原的疫苗免疫宿主动物而制得，所述抗原中的至少一部分是从细菌细胞壁或细胞壁碎片分离的。
44.如权利要求43所述的组合物，其特征在于，所述疫苗包含ー个水相，每毫升该水相中所含脂多糖相关抗原的重量与每毫升细胞壁物质重量为W的革兰氏阴性菌培养液中发现的脂多糖相关抗原的重量相等，而每毫升该水相中革兰氏阴性菌细胞壁或细胞壁碎片的重量小于O. 8W。
45.如权利要求44所述的组合物，其特征在于，所述疫苗包含ー个水相，每毫升该水相中所含脂多糖相关抗原的重量与每毫升细胞壁物质重量为W的革兰氏阴性菌培养液中发现的脂多糖相关抗原的重量相等，而每毫升该水相中革兰氏阴性菌细胞壁或细胞壁碎片的重量小于O. 3W。
46.如权利要求45所述的组合物，其特征在于，所述疫苗包含ー个水相，每毫升该水相中所含脂多糖相关抗原的重量与每毫升细胞壁物质的重量为W的革兰氏阴性菌培养液中发现的脂多糖相关抗原的重量相等，而每毫升该水相中革兰氏阴性菌细胞壁或细胞壁碎片的重量小于O. 1W。
47.如权利要求46所述的组合物，其特征在干，所述高免疫物质是高免疫初乳或高免疫初乳提取物，或者是高免疫蛋黄或高免疫蛋黄提取物。
48.如权利要求47所述的组合物，其特征在于，所述革兰氏阴性菌选自螺旋菌属、弧菌属、肠杆菌属。
49.如权利要求46所述的组合物，其特征在于，所述革兰氏阴性菌为大肠杆菌。
50.如权利要求49所述的组合物，其特征在于，所述大肠杆菌为ETEC、EHEC或EPEC。
51.如权利要求50所述的组合物，其特征在于，所述革兰氏阴性菌为ETEC，并且脂多糖相关抗原选自以下 O 型抗原组06, 08，015，025，027，063，078，0114，0115，0128，0148，0153，0159以及其它与肠毒性大肠杆菌相关的血清型O型抗原。
52.如权利要求51所述的组合物，其特征在于，所述脂多糖相关抗原包含078。
53.如权利要求51所述的组合物，其特征在于，所述疫苗包含至少两种O型抗原，単一的O型抗原是在单独的细菌培养基中生长并分离的，在単一的O型抗原从细胞壁分离后，所述抗原一起被加入疫苗中。
54.如权利要求53所述的组合物，其特征在于，所述疫苗还包含CFA-I和/或CFA-2。
55.如权利要求54所述的组合物，其特征在干，所述至少两种O型抗原包括大肠杆菌078抗原和CFA I菌毛抗原，所述至少两个O型抗原的其它抗原选自06，08，015，025，027，063，078，0114，0115，0128，0148，0153，0159 血清型 O 型抗原和 CFA2 菌毛抗原。
56.如权利要求55所述的组合物，其特征在于，该化合物含有经过处理以富集或分离抗体的高免疫初乳。
57.如权利要求56所述的组合物，其特征在于，所述经处理的高免疫初乳配制成ロ服剂型配方。
58.如权利要求57所述的组合物，其特征在于，所述经处理的高免疫初乳配制成药片或者包裹于胶囊中的粉剂。
59.如权利要求58所述的组合物，其特征在于，还包含ー种食品级的抗菌剂组分。
60.如权利要求59所述的组合物，其特征在干，所述食品级的抗菌剂组分选自乳铁传递蛋白、柑橘提取物或碘基防腐剂中的ー种或多种。
61.如权利要求60所述的组合物，其特征在于，用于旅游者腹泻的治疗或预防。
62.如权利要求43 61中任一项所述组合物在治疗或预防革兰氏阴性菌引起的肠道疾病中的应用。
63.细胞壁抗原在制备用于治疗或预防革兰氏阴性菌引起的肠道疾病的高免疫物质中的应用，其特征在干，所述细胞壁抗原具有O组血清型作用特性或脂多糖相关抗原作用特征，所述抗原中的至少一部分是从细菌细胞壁或细胞壁碎片分离的。
64.如权利要求63所述的应用，其特征在于，所述革兰氏阴性菌是肠毒性大肠杆菌。
65.ー种免疫球蛋白的制备方法，该免疫球蛋白用于治疗或预防动物体内革兰氏阴性菌引起的肠道疾病的，其特征在于，该方法包括用一种疫苗免疫宿主动物，该疫苗含有ー种或多种具有O组血清型作用特征或脂多糖相关抗原作用特性的细胞壁抗原，所述抗原中的至少一部分是从细菌细胞壁或细胞壁碎片分离的，由此诱导宿主动物产生含有所述免疫球蛋白的高免疫物质。
全文摘要
本发明公开了一种治疗和预防革兰氏阴性菌引起的肠道疾病的方法。该方法包括向一个个体施以一种疫苗或者一种抗所述疫苗产生的高免疫物质的步骤，所用疫苗包含有一种或多种具有O组血清型作用特性或脂多糖相关抗原作用特征的细胞壁抗原，所述抗原中至少一部分是从细菌细胞壁或细胞壁碎片分离的。本发明还公开了含有高免疫物质的组合物，以及所述组合物和疫苗的用途。
文档编号A61K35/74GK102698258SQ20121005540
公开日2012年10月3日 申请日期2004年3月4日 优先权日2003年3月4日
发明者戈特弗里德·利希蒂, 格兰特·托马斯·罗林, 罗伊·迈克尔·罗宾斯-布朗 申请人:阿纳迪斯有限公司