专利名称：一种缺损修复材料的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种缺损修复材料，属于生物材料领域。
背景技术：
组织缺损是指由于创伤或疾病所引起的组织细胞坏死，进而导致组织结构连续性丧失或功能障碍的病理表现。组织缺损包括尿道、膀胱、血管、胆道、肠道、肌腱、神经、骨、软骨、肌肉、皮肤或者食管缺损。组织缺损及修复过程中纤维组织形成期和瘢痕形成期会引起身体持久病变，给患者身心带来极大损伤。理想的组织缺损修复是使组织恢复原有的结构和功能，尽管组织缺损的修复与再生目前在基础研究和临床治疗等方面均取得了长足的进展，但是离理想的组织缺损修复仍相差较远。如，食管是长管状的器官，是消化道最狭窄的部分。分为颈、胸、腹(亦即上、中、 下)三段。颈段长约5厘米，是由食管开始端至颈静脉切迹平面的一段，胸段长约15厘米， 上接食管颈段，下至横膈膜肌食管裂孔，腹段仅1 3厘米，上接胸段，下接胃贲门部，与肝左叶后缘相邻，其主要的功能是通过蠕动把食团输送到胃里。食管癌是常见的消化道肿瘤。 目前，手术切除肿瘤是食管癌最重要与首选的治疗方式，对于先天性食管闭锁，返流性食管炎，化学性烧灼伤等造成的食管瘢痕和狭窄，也往往需要手术治疗，手术切除后的食管缺损往往通过食管形成术修复。自Berman等在1952年率先采用特制的聚乙烯管代替食管以修复缺损以来，至今人工食管的研究已经有50多年的历史。国内从1983年开始，先后用各种人工材料进行人工食管的研究。早期主要使用不可降解高分子材料制成的人工食管，但其与受体组织相容性差，受体血管、组织无法长入、人工食管内腔不能完全内皮化，往往会导致严重的并发症，如感染、吻合ロ瘘、吻合ロ狭窄等，并且由于人工食管无法与受体组织完全愈合而得到生物学固定，最终不可避免发生脱落。后来又采用镍钛合金、硅橡胶等，均未达到理想的效果。去細胞基质的天然材料是机体组织经过机械及化学处理而去細胞的生物支架，它具有良好的生物相容性，天然的三维立体多孔结构，可降解吸收等特点，可能是较理想的修复材料。小肠黏膜下层(small intestinal submucosa, SIS)是ー种天然的細胞外基质类生物材料，通常由猪小肠制备。SIS主要含有胶原、氨基多糖、糖蛋白等成分，并且含有多种生长因子，对组织的修复重建及細胞的生长有重要作用，如成纤维细胞生长因子、转化生长因子和血管内皮生长因子等，可通过与細胞表面的多种受体作用后介导细胞信号转导，从而对上皮細胞、血管内皮細胞、软骨細胞、骨細胞等多种细胞具有促进生长、分化的作用，其作为组织工程的支架材料广泛应用于尿道、膀胱、血管、肌腱、神经、骨等多种组织缺损修复的实验研究。然而，研究表明用单纯小肠黏膜下层SIS用于组织缺损修复，存在上皮化不完全，肌肉再生和血管再生不理想等缺陷。寻找简便、安全、有效的组织缺损修复材料已成为治疗组织缺损疾患、提高病人生活质量的关键。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了ー种新的、更加有效的缺损修复材料。本发明提供了ー种缺损修复材料，它包括小肠黏膜下层和铜元素，每Ig小肠黏膜下层中含有0. 005mg 5mg铜元素。优选地，每Ig小肠黏膜下层中含有0. 005mg 1. 460mg 铜元素。优选地，每Ig小肠黏膜下层中含有0.005mg 0.766mg铜元素。进ー步优选地， 每Ig小肠黏膜下层中含有0. 562mg 0. 766mg铜元素。所述缺损修复材料是由如下方法制备(1)取小肠黏膜下层和含有铜离子的溶液，将小肠黏膜下层浸泡在含有铜离子的溶液中8 16h，每Ig小肠黏膜下层浸泡在含有5 μ M 100 μ M铜离子的溶液中；(2)冻干，消毒灭菌。其中，所述步骤(1)中含有铜离子的溶液中铜离子的浓度为25μΜ。本发明还提供了中制备前述缺损修复材料的方法，它包括如下步骤(1)取小肠黏膜下层和含有铜离子的溶液，将小肠黏膜下层浸泡在含有铜离子的溶液中8 16h，每Ig小肠黏膜下层浸泡在含有5 μ M 100 μ M铜离子的溶液中；(2)冻干，消毒灭菌。其中，所述步骤(1)中含有铜离子的溶液中铜离子的浓度为25μΜ。本发明还提供了前述缺损修复材料在制备修复组织缺损的药物中的用途。其中，所述组织缺损为尿道、膀胱、血管、胆道、肠道、肌腱、神经、骨、软骨、肌肉、皮肤或者食管缺损。本发明提供的缺损修复材料药效良好，可加快组织修复的速度，降低组织修复需要的时间，解决了现有修复材料无法与受体组织完全愈合的问题，提高临床病人的存活率， 且制备方法简便，具有广阔的应用前景。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进ー步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
图ISIS的光镜和扫描电镜检测結果。其中，A 未冻干的SIS呈半透明状膜； B 冻干后的SIS成白色纸状；C 处理后SIS表面未见细胞残留(ΗΕΧ200) ；D 处理后的 SIS(SEMX200)，光镜以及扫描电镜下观察到的处理后的SIS未见细胞残留。图2 CuSO4溶液浓度与复合材料中Cu元素含量关系图。图3不同浓度的铜对血管内皮细胞增殖情况的影响。图4 5μΜ CuSO4作用下血管内皮細胞的生长曲线。图5使用5 μ M的CuSO4对HUVEC处理48小时后，MTT法检测5 μ M的CuSO4处理 48小时后对HUVEC増殖情况的影响，数值以平均值士标准差表示(*，表示与Control组有显著性差异P < 0. 05)，以不添加CuSO4的Control组作为100%，増殖活性百分比处理。图6使用5 μ M的CuSO4对HUVEC处理48小时后，3H-TdR渗入法检测5 μ M的CuSO4处理48小时后对HUVEC増殖情况的影响，数值以平均值士标准差表示(*，表示与Control 组有显著性差异P < 0. 05)，以不添加CuSO4的Control组作为100%，増殖活性百分比处理。图7使用5 μ M的CuSO4对HUVEC处理48小时后，细胞计数法检测5 μ M的CuSO4 处理48小时后对HUVEC増殖情况的影响，数值以平均值士标准差表示(*，表示与Control 组有显著性差异P < 0. 05)，以不添加CuSO4的Control组作为100%，増殖活性百分比处理。图8流式細胞术检测5 μ M的CuSO4处理48小时后对HUVEC細胞周期的影响。数值以平均值士标准差表示(*，表示与其对应相同周期的Control组百分比有显著性差异P < 0. 05)图 9SIS, SIS+5Cu(5 μ M 的 CuSO4)和 SIS+25Cu(25 μ M 的 CuSO4)组动物体重。(* 表示与SIS组相比，P < 0. 01, #表示与SIS+5CU相比，P < 0. 05)图10术后8周三组钡餐检测结果。A为SIS组，B为SIS+5Cu组，C为SIS+25Cu， 右箭头ヰ示食管缺损修复处。 图11术后8周三组大体标本观察结果。A为SIS组，B为SIS+5Cu组，C为SIS+25Cu。图12术后8周SIS组标本组织学结果Al SIS组Masson，s trichrome染色示部分上皮化(下箭头丨)(X40)A2 SIS组HE染色示部分上皮化(下箭头丨)(X40)A3 SIS组HE染色示部分上皮化(下箭头丨)及大量炎細胞(上箭头丨)(X200)。图13术后8周SIS+5CU组标本组织学结果Bl SIS+5Cu组Masson，s trichrome染色示完全上皮化(下箭头丨)(X40)B2 SIS+5CU组HE染色示完全上皮化(下箭头丨)(X40)B3 SIS+5CU组HE染色示完全上皮化(下箭头丨)，上皮层数达8_10层(X 200)。图14术后8周SIS+25CU组标本组织学结果Cl SIS+25Cu 组 Masson，s trichrome 染色示完全上皮化(下箭头丨)(X40)C2 SIS+25CU组HE染色示完全上皮化(下箭头丨)(X40)C3 SIS+25CU组HE染色示完全上皮化(下箭头丨)(X2OO)。图15术后8周三组标本炎细胞计数(#P < 0. 01，*P < 0. 05)。图16术后8周SIS组标本组织学结果El SIS组HE染色可见血管形成(下箭头丨)(X200)E2 SIS组Masson，s trichrome染色，可见有波浪状胶原形成(上箭头个) (X200)。图17术后8周SIS+5CU组标本组织学结果Fl SIS+5CU组HE染色示肌岛形成(三角形箭头▲ ) (X200)F2 SIS+5CU组Masson，s trichrome染色示肌岛形成(三角形箭头▲)，肌岛被胶原包裹(右箭头ヰ)(X2OO)。图18术后8周SIS+25CU组标本组织学结果Gl SIS+25CU组HE染色示肌岛形成(三角形箭头▲ ) (X2OO)G2 SIS+25CU组Masson，s trichrome染色示肌岛形成(三角形箭头▲)，肌岛被胶原包裹(右箭头ヰ)(X2OO)。图19三組免疫组织化学染色检测结果Al SIS组α -SMA染色血管平滑肌阳性(下箭头I )Bl SIS+5CU组α -SMA染色血管平滑肌阳性(下箭头I )Cl SIS+25CU组α -SMA染色血管平滑肌阳性(下箭头I )图20三組免疫组织化学染色检测结果Α2 SIS组⑶31染色血管内皮阳性(下箭头I )Β2 SIS+5CU组CD31染色血管内皮阳性(下箭头I )C2 SIS+25CU组CD31染色血管内皮阳性(下箭头丨)。图21三组免疫组织化学染色血管计数(#Ρ < 0. 01，*Ρ < 0. 05)。
具体实施例方式实施例1本发明缺损修复材料的制备1、制备方法(一 )、小肠黏膜下层SIS的制备(I)SIS 的制备清洗整理取屠宰后半个小时的新鮮猪小肠，用水冲去小肠内容物，翻转小肠，加入盐揉搓后用水反复冲洗3次，用手木刀剖开小肠，然后剪成15厘米长的肠段。分离出SIS 用压舌板刮除肌层，浆膜层，置于生理盐水中4°C保存过夜。脱脂用去离子水漂洗干净后用纱布滤干水。浸入三氯甲烷甲醛1 1中，置于通风橱里4个小吋，平均2小时换一次液，并且每半个小时搅拌一次，每次滤干之前的液体再浸入到新的脱脂液中。脱細胞将脱脂后的SIS用去离子水漂洗20次，反复清洗，漂至无味。然后放入浓度为0. 25%的胰酶液里，4°C脱細胞处理过夜。用去离子水漂洗10次后用0. 5%的SDS处理至少4个小吋，清洗后冻干。(2) SIS的检测染色、扫描电镜通过HE染色和扫描电镜观察有无残留的細胞，如图1所示，说明制备好的SIS已基本去除細胞，且对其超微结构和胶原纤维的热稳定性未造成损害。( ニ)、本发明缺损修复材料的制备取步骤(一)制备的SIS或者市售的SIS，按每克SIS重量浸泡在1升5 μ Μ、25 μ M、 50 μ Μ、75 μ Μ、100 μ M的CuSO4溶液中l ir，真空冻干机冻干，裁剪成所需大小，包装，环氧乙烷消毒、灭菌。2、检测采用原子吸收光谱法测定复合材料上Cu的含量各样品消解罐在使用前用10%硝酸浸泡M小吋，去离子水冲洗干净，充分润洗干净后烘干，将烘干的各胶条放入各个消解罐中，各加入6mlHN03(优级纯)组装上各罐放入微波消解仪中。消解条件6^00W，1900C,15atm, 5min消解结束后，待温度降到50摄氏度以下，压カ降到O.fetm以下后，取出消解罐，在通风橱中拧开罐侧边螺丝放气，片刻后再拧松顶丝，取出内罐。将罐中的HNO3消解液倒入 25ml容量瓶中，用少量去离子水冲洗内罐、漏斗并入容量瓶中。用去离子水定容即可。
AAS測定方法及仪器条件
表1. AAS测铜仪器条件选择
权利要求
1.ー种缺损修复材料，其特征在于它包括小肠黏膜下层和铜元素，每Ig小肠黏膜下层中含有0. 005mg 5mg铜元素。
2.根据权利要求1所述的材料，其特征在于每Ig小肠黏膜下层中含有0.005mg 1. 460mg铜元素。
3.根据权利要求2所述的材料，其特征在于每Ig小肠黏膜下层中含有0.005mg 0. 766mg铜元素。
4.根据权利要求3所述的材料，其特征在于每Ig小肠黏膜下层中含有0.562mg 0. 766mg铜元素。
5.根据权利要求1所述的材料，其特征在于它是由如下方法制备(1)取小肠黏膜下层和含有铜离子的溶液，将小肠黏膜下层浸泡在含有铜离子的溶液中8 16h，每Ig小肠黏膜下层浸泡在含有5 μ M 100 μ M铜离子的溶液中；(2)冻干，消毒灭菌。
6.根据权利要求5所述的材料，其特征在干步骤(1)所述含有铜离子的溶液中铜离子的浓度为25 μ Μ。
7.ー种制备权利要求1 6任意ー项所述的缺损修复材料的方法，其特征在于它包括如下步骤(1)取小肠黏膜下层和含有铜离子的溶液，将小肠黏膜下层浸泡在含有铜离子的溶液中8 16h，每Ig小肠黏膜下层浸泡在含有5 μ M 100 μ M铜离子的溶液中；(2)冻干，消毒灭菌。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在干步骤(1)所述含有铜离子的溶液中铜离子的浓度为25 μ Μ。
9.权利要求1 6任意ー项所述的缺损修复材料在制备修复组织缺损的药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于所述组织缺损为尿道、膀胱、血管、胆道、 肠道、肌腱、神经、骨、软骨、肌肉、皮肤或者食管缺损。
全文摘要
本发明提供了一种缺损修复材料，它包括小肠黏膜下层和铜元素，每1g小肠黏膜下层中含有0.005mg～5mg铜元素。还提供了该缺损修复材料的制备方法以及该缺损修复材料在制备修复组织缺损的药物中的用途。本发明提供的缺损修复材料解决了现有修复材料无法与受体组织完全愈合的问题，具有较好的应用前景。
文档编号A61L27/04GK102526804SQ201210056999
公开日2012年7月4日 申请日期2012年3月6日 优先权日2012年3月6日
发明者康裕建, 罗静聪, 解慧琪 申请人:四川大学华西医院