专利名称：黑猩猩腺病毒疫苗载运体的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组载体领域，更具体地涉及重组复制缺陷性黒猩猩腺病毒载体的产生和用途，来在哺乳动物宿主中引发免疫反应。
背景技术：
腺病毒(Ads)包含在两栖动物、禽类和哺乳动物中发现的、具有无包被的二十面 体衣壳结构的双链DNA病毒的大家族(Straus, Adenovirus infections in humans. InThe Adenoviruses. 451-498，1984 ；Hierholzer et al.，J.Infect. Dis.，158 :804-813,1988 ；Schnurr and Dondero, Intervirology.，36 :79-83,1993 ；Jong et al.，J ClinMicrobiol.，37 :3940-3945 :1999)。与逆转录病毒相比，腺病毒可以转导几个哺乳动物物种的许多细胞类型，包括分裂和非分裂细胞，而不整合到宿主细胞的基因组中。一般而言，腺病毒DNA—般是非常稳定的并保持游离(例如，染色体外)，除非发生了转化或肿瘤发生。此外，在容易进行临床级组合物的制药规模生产的良好定义的生产系统中，腺病毒载体可以繁殖到高产量。这些特征和它们被良好表征的分子遗传学，使得重组腺病毒载体成为用作疫苗载运体(carrier)的好的候选者。一般地，重组腺病毒载体的生产依靠使用能够补足腺病毒基因产物的功能的包装细胞系，所述功能已经被删除或被工程化为无功能的。目前，两种良好表征的人类C亚群腺病毒血清型(即，hAd2和hAd5)被广泛地用作大多数用于基因治疗的腺病毒载体的病毒主干的来源。也已经测试了复制缺陷性人类腺病毒载体作为用于递送各种免疫原的疫苗载体，所述免疫原来源于各种传染原(例如，病毒、寄生虫或细菌性病原体)和肿瘤细胞，包括肿瘤相关抗原(TAA)。在实验动物(例如，啮齿动物、犬和非人灵长类)中进行的研究表明，携带转基因的重组复制缺陷性人类腺病毒载体引发了针对转基因产物的体液和细胞介导的免疫反应，所述转基因编码来源于人类乳头状瘤病毒(HPV-16)的 E6 和 E7 癌蛋白(He, Z et al.，(2001) Virology, 270 :3583-3590)、狂犬病病毒糖蛋白(Xiang, Z. et al (1996) Virolgy, 219 :220-227)、Plasmodium falciparum的环子孢子蛋白 Rodriguez E. et al. (1997) J. Immunol. 158 :1268-1274)以及其他异源抗原的免疫原。一般而言，研究人员已经报道了，通过使用利用预计可引发免疫反应的高剂量重组腺病毒载体的免疫方案；或通过使用采用腺病毒载体的连续施用的免疫方案，所述腺病毒载体来源于不同血清型但携带相同的转基因产物用作強化免疫，在非人类实验系统中成功地使用人类腺病毒载体作为疫苗载运体(Mastrangeli, et al. ,Human Gene Therapy,7 :79-87(1996)。
然而，预计的是，来源于遍在的人类血清型，例如2和5型的疫苗载运体将在人类群体中遇到先存的(pre-existing)体液和细胞免疫。因而，尽管已经在采用啮齿动物、犬和非人灵长类宿主的实验系统中成功地使用复制缺陷性重组人类腺病毒作为疫苗载运体，预计人类的先天和适应性免疫会显著地限制这些血清型作为疫苗载运体的实用性。这种预期是基于这一事实，包括2型和5型的C亚群腺病毒感染在人类群体中是地方性的。結果，作为自然感染的结果，大多数人类在生命的头五年内血清转变。因而，来源于在人类中天然感染并复制的病毒的载体，可能不是用作疫苗载运体的最优候选者。
与使用人类腺病毒衍生载体相关的另ー个问题是，用于繁殖重组病毒的生产方法产生被有复制能力的腺病毒(RCA)污染的载体成品的风险。这是起因于，来自重组载体和存在于 El 补足辅助细胞系，例如人类 293 (Graham，F. L. et al, (1977) J. Gen. Virol. 36 59-72.)细胞中的腺病毒基因的重叠序列之间的同源重组。在为用于临床试验制备的载体成品中RCA的存在构成了安全风险，因为它可能促进复制缺陷性病毒的流动和传播。缺陷病毒的传播可能加重宿主免疫应答，并引起其他有害的免疫病理后果。(Fallux，F. J.，etal. Human Gene Therapy 9 :1909-1917 (1998)。因此，食品和药品管理局(FDA)和其他管理机构已经颁布了指导原则，其建立了对可能存在于用于临床用途的载体制品中的RCA水平的限制。加以RCA限制的意图是确保患者有限地暴露于用于临床试验的组合物中的复制性腺病毒。因而，存在着开发适用于哺乳动物宿主的腺病毒疫苗载运体的持续的需求，其是易于操作、可经受制药规模的生产和长期储存、在人类补足细胞系中能以高水平复制、高度的免疫原性、没有与人类腺病毒的常见血清型交叉反应的中和B细胞表位、符合管理机构颁布的安全RCA标准、并且其符合在适合人类使用的激发/強化(prime/boost)方案中使用。
发明内容
本发明涉及来源于黑猩猩腺病毒的重组复制缺陷性腺病毒载体和用于在人类El表达细胞系中产生黑猩猩腺病毒载体的方法。本发明还提供了产生适用于人类的临床级载体成品的方法，和使用所公开的载体作为疫苗载运体来引发保护性和/或治疗性免疫反应的方法。本发明进一歩提供了使用本发明的重组腺病毒来制备疫苗组合物的方法，所述疫苗组合物被设计以递送编码免疫原的转基因和指导编码免疫原的转基因的表达。在ー个实施方式中，本发明考虑使用所公开载体作为疫苗载运体用于疫苗的施用，所述疫苗包含编码来源于传染原的免疫原的转基因。在第二种实施方式中，本发明考虑使用所公开的载体来制备和施用癌症疫苗。在特定的实施方式中，本发明考虑制备和施用包含编码TAA的转基因的癌症疫苗。在ー个方面，本发明公开了五种黑猩猩腺病毒(ChAds)的完整基因组序列，在此称为 ChAd3 (SEQ ID NO :1)(附图 5A-5K)、ChAd6 (SEQ ID NO 2)(附图 6A-6K)、CV32 (SEQID NO 3)(附图 7A-7K)、CV33 (SEQ ID NO 4)(附图 8A-8K)和 CV23 (SEQ ID NO 5)(附图9A-9J)。ChAd3和ChAd6是根据在此公开的方法分离的新的腺病毒。ChAd3和ChAd6的基因组长度分别是37741和36648个碱基对。ChAd3六邻体基因(SEQ ID NO 41)包含SEQ IDNO :1的核苷酸(nt) 19086-21965(不包括終止密码子)，ChAd3纤维基因(SEQ ID NO 42)包含SEQ ID NO 1的nt 32805-34487 (不包括終止密码子)。ChAd6六邻体(hexon)基因包含SEQ ID N0:2的nt 18266-21124 (SEQ ID NO :43)(不包括終止密码子)，它的纤维基因(SEQ ID NO 44)包含SEQ ID NO 2的nt 32218-33552 (不包括終止密码子)。根据从全长六邻体肽的多重序列比对得出的序列同源性，ChAd3被分类入人类C亚群，ChAd6被分类入人类E亚群。CV32、CV33和CV23腺病毒的基因组的长度分别是36，606、36，535和32，020个碱基对。CV32 (Pan 6) (ATCC N. VR-592)、CV33 (Pan7) (ATCC N. VR-593)和 CV23 (Pan5) (Esoterix Inc.，)全都被确定为与人类 Ad4 (hAd4) (E 亚群)相关(ffigand, R etal. Intervirologyl989,30 :1_9)。然而，根据六邻体序列比对，随后将CV32表征为与类似于hAd4相比更接近地类似于人类D亚群成员。
在第二个方面，本发明提供了根据在此公开的方法分离的21种其他黒猩猩腺病毒(ChAd20、ChAd4、ChAd5、ChAd7、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd8、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63 和 ChAd82)的纤维基因和TK邻体基因的核昔酸序列。ChAd20、ChAd4、ChAd5、ChAd7、ChAd9、ChAdlO、ChAdll、ChAdl6、ChAdl7、ChAd19 的纤维基因核苷酸序列分别在附
图10-19中列出，在此称为SEQ ID NO :6-15: (SEQ ID NO:6，ChAd20) ； (SEQ ID NO -J, ChAd4) ； (SEQ ID NO 8, ChAd5) ； (SEQ ID NO 9, ChAd7) ； (SEQID NO 10, ChAd9) ； (SEQ ID NO 11, ChAdlO) ； (SEQ ID NO: 12，ChAdll) ； (SEQ ID NO: 13，ChAd16) (SEQ ID NO 14, ChAd17)和(SEQ ID NO 15, ChAd19)ChAd8、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63和ChAd82的纤维基因核苷酸序列在此称为(SEQ ID NO :58，ChAd8)、(SEQ ID NO 60,ChAd22)、(SEQ ID NO 62, ChAd24)、(SEQ ID NO 64, ChAd26)、(SEQ ID NO 66, ChAd30)、(SEQ ID NO :68，ChAd31)、(SEQ ID NO :70，ChAd37)、(SEQ ID NO :72，ChAd38)、(SEQ BD NO:74，ChAd44)、(SEQ ID NO :76, ChAd63)和(SEQ ID NO 78, ChAd82)，并在序列表中列出。ChAd20、ChAd4、ChAd5、ChAd7、ChAd9、ChAdlO、ChAdll、ChAdl6、ChAdl7、ChAd19 的六邻体基因核苷酸序列分别在附图21-30中列出，在此称为SEQ ID NO 16-25 (SEQ ID NO:16，ChAd20) ； (SEQ ID NO 17, ChAd4) ； (SEQ ID NO 18, ChAd5) ； (SEQ ID NO 19, ChAd7)；(SEQ ID NO 20,ChAd9) ； (SEQ ID NO 21,ChAdlO) ； (SEQ ID NO 22,ChAdll) ； (SEQ ID NO:23，ChAd16) ； (SEQ ID NO 24, ChAd17)和(SEQ ID NO 25, ChAd19)。ChAd8、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63和ChAd82的六邻体基因核苷酸序列在此称为(SEQ ID NO :97，ChAd8)、(SEQ ID NO 99,ChAd22)、(SEQ ID NO :101，ChAd24)、(SEQ ID NO :103，ChAd26)、(SEQ ID NO :105,ChAd30)、(SEQ ID NO :107，ChAd31)、(SEQ ID NO : 109，ChAd37)、(SEQ ID NO : 111，ChAd38)、(SEQ IDNO 113, ChAd44)、(SEQ ID NO 115, ChAd63)和(SEQ ID NO 117, ChAd82)，并在序列表中列出。在第三个方面，本发明提供了根据在此公开的方法分离的21种其他黒猩猩腺病毒(ChAd20、ChAd4、ChAd5、ChAd7、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd8、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63 和 ChAd82)的纤维蛋白和六邻体蛋白的氨基酸序列。在此公开和要求权利的纤维蛋白称为(SEQ ID NO :83，ChAd3)、(SEQ ID NO :84，ChAd6)、(SEQ ID NO 48, ChAd20)、(SEQ ID NO 49, ChAd4)、(SEQ ID NO 50, ChAd5)、(SEQID NO 51, ChAd7)、(SEQ ID NO 52, ChAd9)、(SEQ ID NO 53, ChAdlO)、(SEQ ID NO 54,ChAdll)、(SEQ ID NO 55, ChAd16), (SEQ ID NO 56, ChAd17), (SEQ ID NO 57, ChAd19),(SEQ ID NO 59,ChAd8)、(SEQ ID NO 61,ChAd22)、(SEQ ID NO 63,ChAd24)、(SEQ ID NO 65，ChAd26)、(SEQ ID NO :67,ChAd30)、(SEQ ID NO 69,ChAd31)、(SEQID NO 71,ChAd37)、(SEQ ID NO 73, ChAd38)、(SEQ ID NO :75，ChAd44)、(SEQ ID NO :77，ChAd63)和(SEQ IDNO 79, ChAd82)。附图20A-20G提供了比较在此公开和要求权利的纤维蛋白的氨基酸序列与以下纤维蛋白的氨基酸序列的比对Cl (SEQ ID NO :85)、CV68(SEQ ID NO :86)、Pan5 (作为选择称为 CV23) (SEQ ID NO :80)、Pan6 (作为选择称为 CV32) (SEQ ID NO :81)和 Pan7(作为选择称为 CV33) (SEQ ID NO :82)。在此公开和要求权利的六邻体蛋白称为(SEQ ID NO :122，ChAd3)、(SEQ ID NO 123，ChAd6)、(SEQ ID NO 87, ChAd20)、(SEQ ID NO 88, ChAd4)、(SEQ ID NO 89, ChAd5)、(SEQ ID NO 90, ChAd7)、(SEQ ID NO :91，ChAd9)、(SEQ ID NO :92, ChAdlO)、(SEQ ID NO 93，ChAdll)、(SEQ ID NO :94，ChAd16)、(SEQ ID NO :95,ChAdl7)、(SEQ ID NO :96,ChAdl9)、(SEQ ID NO 98, ChAd8)、(SEQ ID NO 100, ChAd22)、(SEQ ID NO 102, ChAd24)、(SEQ IDNO :104,ChAd26)、(SEQ ID NO : 106，ChAd30)、(SEQ ID NO : 108，ChAd31)、(SEQ ID NO :110，ChAd37)、(SEQ ID NO :112，ChAd38)、(SEQ ID NO :114，ChAd44)、(SEQ ID NO 116,ChAd63)和(SEQ ID勵118，0^(182)。附图3认-311提供了在此公开和要求权利的六邻体蛋白的氨基酸序列与以下六邻体蛋白的氨基酸序列的比较Cl (SEQ ID NO :124)、CV68 (SEQ ID NO:125)、Pan5(做为选择称为 CV23) (SEQ ID NO :119)、Pan6 (做为选择称为 CV32) (SEQ ID NO 120)和Pan7 (做为选择称为CV33) (SEQ ID NO :121)。六邻体蛋白的多重序列比对容许技术人员进行与人类腺病毒血清型的建议分类一致的系统发生分析(Rux，J. J. ,et al (2003)J. Virol. 77 :9553-9566)。在可选择的方面，本发明进一歩提供了 21种其他的黒猩猩腺病毒分离物。将包含 ChAd20、ChAd4、ChAd5、ChAd7、ChAd9、ChAdlO、ChAdll、ChAdl6、ChAdl7、ChAdl9、ChAd8、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63 和 ChAd82 的样品根据布达佩斯条约保藏在欧洲动物细胞保藏中心(ECACC, Porton Down, Salisbury,Wiltshire, SP4 0JG,英国)。其保藏日、分类命名和保藏号如下表所示
保藏日期保藏编号分类命名
2003 年 12 月 12 日 03121201 CHIMPANZEE ADENOVIRUS TYPE 4_
2003 年 12 月 12 日 03121202 CHIMPANZEE ADENOVIRUS TYPE 5_
2003 年 12 月 12 日 03121203 CHIMPANZEE ADENOVIRUS TYPE 7_
2003 年 12 月 12 日 03121204 CHIMPANZEE ADENOVIRUS TYPE 9_
权利要求
1.复制缺陷性腺病毒载体，其包含腺病毒基因组，所述基因组包含编码SEQID NO 77或116或SEQ ID NO :57或96所示的肽的核苷酸序列，和与调节序列可操作连接的编码至少ー个免疫原的转基因，所述调节序列指导所述转基因在哺乳动物细胞中的表达，其中所述载体是修饰的，所述修饰是至少一个选自E1、E2和E4的基因被功能性删除。
2.权利要求I的复制缺陷性载体，其中所述腺病毒基因组包含SEQID NO :115或SEQID NO 25所示的核苷酸序列。
3.权利要求I或2的复制缺陷性腺病毒载体，其中所述腺病毒基因组包含SEQID NO:76或SEQ ID NO : 15所示的核苷酸序列。
4.权利要求1-3的任一项的复制缺陷性腺病毒载体,其特征在于El核苷酸序列中的功能性删除。
5.宿主细胞,包含根据权利要求1-3的任一项的复制缺陷性腺病毒载体，其中所述宿主细胞表达选自 Ela、Elb、E2a、E2b、E4 orfs l、2、3、4、5、6、6/7、pIX、IVa2、区域 L1、L2、 L3、L4、L5的ー种或多种腺病毒区域。
6.分离的重组腺病毒基因组，其包含 a)包含SEQID NO :115或SEQ ID NO :25所示的核苷酸序列的六邻体基因序列；和 b)包含SEQID N0:76或SEQ ID NO : 15所示的核苷酸序列的纤维基因序列。
7.权利要求1-4的任一项的复制缺陷性腺病毒载体，其用于在哺乳动物中強化抗原特异性免疫反应的方法，该方法包括向所述哺乳动物施用足够量的所述载体，其中施用所述腺病毒载体引发强化的反应。
8.权利要求7的复制缺陷性腺病毒载体，其中所述载体包含其El基因的完全删除，并且进一歩地，其中所述载体任选包含其E3基因的删除。
9.权利要求7的复制缺陷性腺病毒载体，其中所述免疫反应是特异于TAA的強化的免疫反应。
10.权利要求7或权利要求9的复制缺陷性腺病毒载体，其中所述强化的免疫反应包括产生抗原特异性⑶8+T细胞。
11.权利要求1-4的任一项的复制缺陷性腺病毒载体，其用于在幼稚哺乳动物中引发免疫反应的方法，该方法包括向所述哺乳动物施用足够量的所述至少含有其El基因的功能性删除的腺病毒载体，其中施用所述腺病毒载体引发初级免疫反应。
12.权利要求7或权利要求11的复制缺陷性腺病毒载体，其中所述强化的免疫反应或初级免疫反应分别特异于来源于传染原的抗原，所述传染原例如，但不限于HIV、HBV、HCV,HPV、HSVI、HSV2、SARS CoV、Leishmania major、恶性疟原虫、埃博拉病毒、西尼罗河病毒、登革热病毒、流感A、流感B、RSV, CMV、结核分枝杆菌。
13.权利要求7的复制缺陷性腺病毒载体，其中所述免疫反应是特异于TAA的初级免疫反应，所述哺乳动物针对所述TAA是耐受性的。
14.权利要求1-4的任一项的复制缺陷性腺病毒载体，其用于诱导针对来源于传染原的抗原的免疫反应的方法，该方法包括步骤 (a)通过施用第一疫苗组合物激发宿主以响应传染原-抗原，所述第一疫苗组合物包含编码传染原-抗原的核苷酸序列，针对所述传染原-抗原的抗原特异性免疫反应是期望的；和(b)通过施用第二疫苗组合物強化步骤(a)的免疫反应，所述第二疫苗组合物包含至少含有其El基因的功能性删除的权利要求4的腺病毒载体，和在所述El基因删除的位点中，包含ー种序列，所述序列包含能指导DNA的表达的启动子，所述DNA编码与激发步骤中递送的传染原-抗原相同的传染原-抗原； 其中所述强化组合物的施用引发具有赋予保护性免疫的效果的免疫反应。
15.权利要求14的载体，其中所述抗原来源于选自下组的传染原HIV、HBV、HCV、HPV、HSVl、HSV2、SARS Cov、Leishmania major、恶性疟原虫、埃博拉病毒、西尼罗河病毒、登革热病毒、流感A、流感B、RSV, CMV和结核分枝杆菌。
16.权利要求14的复制缺陷性腺病毒载体，其中所述免疫反应包括产生抗原特异性⑶8+T细胞。
17.权利要求1-4的任一项的复制缺陷性腺病毒载体,其用于破坏宿主对自体抗原的耐受性的方法，该方法包括(a)通过施用第一疫苗组合物激发宿主以响应自体抗原，所述 第一疫苗组合物包含编码自体抗原的核苷酸序列，针对所述自体抗原的抗原特异性免疫反应是期望的，从而引发激发的反应；和(b)通过施用第二疫苗组合物強化步骤(a)的激发的免疫反应，所述第二疫苗组合物包含至少含有其El基因的功能性删除的重组腺病毒载体，和在所述El基因删除的位点中，包含ー种序列，所述序列包含能指导DNA的表达的启动子，所述DNA编码与激发步骤中递送的自体抗原相同的自体抗原，其中所述强化组合物的施用引发具有破坏宿主对所述自体抗原的耐受性的效果的免疫反应。
18.权利要求17的复制缺陷性腺病毒载体，其中所述第二疫苗组合物包含腺病毒载体，所述腺病毒载体包含编码自体抗原的DNA，所述自体抗原选自HER2NEU、CEA、HEPCAM、PSA、PSMA、端粒酶、GP100、MELAN-A/MART-l、MUC-U NY-ES0-1、存活蛋白、溶基质蛋白酶 3、酪氨酸酶、MAGE3、CML68、CML66、OY-TES-1、SSX-2、SART-1、SART-2、SART-3、NY-C0-58、NY-BR-62、HKLP2、5T4 和 VEGFR2。
19.权利要求17的复制缺陷性腺病毒载体，其中所述免疫反应包括产生抗原特异性⑶8+T细胞。
20.权利要求18或19的复制缺陷性腺病毒载体，其中所述第一和第二疫苗组合物疫苗组合物都是以不同的血清型为特征的腺病毒载体。
全文摘要
本发明涉及黑猩猩腺病毒疫苗载运体。本发明提供来源于黑猩猩腺病毒的重组复制缺陷性腺病毒载体和用于在人类E1表达细胞系中产生重组腺病毒的方法。本发明还提供了适用于递送和表达编码免疫原的转基因的组合物和方法，针对所述免疫原的强化的免疫反应是期望的。本发明进一步提供了产生适合在人类中使用的临床级载体成品的方法。在特定的实施方式中，本发明考虑在疫苗和药物组合物中使用包含编码肿瘤相关抗原的转基因的载体用于癌症的预防和治疗。
文档编号A61K39/00GK102719478SQ20121005679
公开日2012年10月10日 申请日期2005年1月18日 优先权日2004年1月23日
发明者A·奇里洛, A·尼科西亚, A·梅奥拉, B·B·埃尔科勒, E·斯波雷诺, S·科洛卡 申请人:P.安杰莱蒂分子生物学研究所