专利名称：灵芝多糖f31的制备方法及其降血糖功能的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种具有降血糖作用的灵芝多糖F31及其制备方法和用途。
背景技术：
糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢紊乱综合症，全世界糖尿病患者以每年6%的速度增加。预计在2010年至2030年间，发展中国家的成年人总患病者会增加69%，发达国家会增加20%。糖尿病分为I型和2型糖尿病，其中2型糖尿病占整个总数的90%以上。目前的医学尚不能攻克糖尿病，糖尿病的治疗主要以长期服用药物控制和缓解病情，然而目前临床使用药物多为化学药物或生化药物，毒副作用的长期积累对人体的影响很大。这一严峻形势促使对糖尿病药物的新药开发重点转向从自然界中寻找天然、安全、疗效确切的新型活性成分。作为我国民间传统中药的灵芝(Ganoderma Iucidum),其多糖成分在抗病毒、抗肿瘤、免疫力提高、降血压、降血糖等方面都表现出显著的作用。国内外学者均报道过灵芝多糖在动物模型上表现出良好的降血糖作用，例如日本的Hiroshi Hikino从灵芝(GanodermaIucidum)子实体热水提取物中得到三种降血糖活性的灵芝多糖A、B、C。在对71名糖尿病患者的临床试验中，灵芝糖蛋白Ganopoly也表现出良好并且安全的降血糖作用。可见,灵芝在糖尿病的治疗方面有着很好的前景。现代药理学研究结果表明，血糖的降低可以通过升高胰岛素的含量，也可通过调节与糖代谢相关酶的活性，而促进葡萄糖的氧化利用，还可通过改善胰岛素抵抗或抑制葡萄糖吸收等而实现。张玲芝发现灌服灵芝子实体多糖对四氧嘧啶诱导的糖尿病大鼠的胰岛细胞具有一定的修复作用而使内源性胰岛素分泌增加，降低血糖。罗少洪在研究灵芝多糖调节血糖作用时发现，在灌胃剂量达100mg/kg以上时，可明显降低链尿菌素高血糖小鼠血糖水平，无剂量效应关系；在200mg/kg剂量时，可降低正常小鼠的血糖，有明显的刺激胰岛素分泌的作用，并可明显增强高血糖小鼠对葡萄糖的耐受力。陈伟强等也报道对STZ引起的糖尿病小鼠进行灌胃灵芝多糖，能使糖尿病大鼠血糖水平显著下降(P < 0.05)，血清胰岛素水平显著升高(P<0. 05)。灵芝子实体多糖B能增加正常小鼠和四氧嘧啶诱导糖尿病小鼠的血浆胰岛素水平，并能增强肝葡萄糖激酶、磷酸果糖激酶和葡萄糖-6磷酸脱氢酶的活性，降低肝6-磷酸葡萄糖和糖原合成酶的活性，但不影响己糖激酶和糖原磷酸化酶的活性；其机制是能升高血浆胰岛素的浓度，加速葡萄糖代谢，提高周围组织对糖的利用，并通过强化参与肝脏糖代谢的各种关键酶的活性来提高肝脏对葡萄糖的利用。Seto发现灵芝水提物能够通过抑制肝脏磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PEPCK的表达降低2型糖尿病小鼠的血糖。虽然目前已经发现灵芝及其活性成分具有显著的降血糖作用，但由于其化学结构复杂，绝大多数降血糖活性物质的成分、结构及其作用机理未能明确，直接阻碍了它们被开发成治疗糖尿病新药的进程。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有降血糖作用的新的灵芝多糖F31及其制备方法。本发明的灵芝多糖F31是通过以下方法制备的，该方法包括以下步骤(a)取灵芝(Ganoderma lucidum karst)子实体,粉碎用热水抽提,然后再过滤,在滤液中加入乙醇沉淀，分离沉淀；(b)沉淀上 DEAE Sepharose Fast Flow 色谱柱,先用 Tris-HCl (IOmM, pH = 8. 0)平衡，接着用含0. IM NaCl的Tris-HCL(10mM，pH = 8. 0)洗脱，最后用含0. 5M NaCl的Tris-HCKlOmM, pH = 8. 0)洗脱，分别得到馏分Fl、F2和F3 ;馏分F3上分子筛SephacrylS300，用H2O平衡，接着用H2O洗脱，收集有效峰，减压浓缩，透析，干燥得灵芝多糖F31。所述的步骤(a)的沉淀优选先用热水溶解，再用0.45 直径的微孔滤膜过滤，滤液装入3000D孔径的透析袋透析，得粗多糖溶液，再调整粗多糖溶液中灵芝粗多糖的浓度，将此粗多糖溶液作为样品进行步骤(b)的上样层析分离。该灵芝多糖F31分子量为I. 90X IO4D,多糖含量为94. 8%，蛋白含量为4.2%，多糖主要由葡萄糖、甘露糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖组成，氨基酸组分主要是脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、天冬氨酸(Asp)、赖氨酸(Lys)、丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)、苏氨酸(Thr)、甘氨酸(Gly)、精氨酸(Arg)、亮氨酸(Leu)和缬氨酸(Val)，为P -吡喃糖环杂多糖，并且含有糖醛酸。根据上述参数，与现有技术中的灵芝多糖进行比较，没有发现相类似的，因此本发明的灵芝多糖F31是一个新的灵芝多糖。取灵芝多糖F31进行体内降血糖试验，结果表明灵芝多糖F31连续腹腔注射7天，可以显著降低糖尿病小鼠的空腹血糖CnP < 0. 05)，其降血糖机理主要是通过减少肝脏葡萄糖的输出，从而降低血糖。因此本发明的第二个目的是提供灵芝多糖F31在制备治疗糖尿病药物中的应用，尤其是在制备治疗2型糖尿病药物中的应用。本发明的第三个目的是提供一种治疗糖尿病的药物，其特征在于，该药物以灵芝多糖F31作为活性成分。所述的糖尿病为2型糖尿病。本发明从灵芝子实体中分离出一种新的灵芝多糖F31，该灵芝多糖F31具有降血糖活性，可以用于制备治疗糖尿病的药物，尤其是治疗2型糖尿病的药物，为开发治疗糖尿病的新药打下基础，积极推动糖尿病天然药物活性成分的研究开发。
图I是沉淀上DEAE Sepharose Fast Flow色谱柱的色谱分析图；图2是懼分F3上Sephacryl S300色谱柱的色谱分析图；图3是多糖对照品的凝胶色谱校正曲线；图4是灵芝多糖F31的HPLC分析图；
图5是灵芝多糖F31的红外光谱(IR)的扫描图；图6是灵芝多糖F31的1H-NMR谱图；图I是灵芝多糖F31的13C-NMR谱图。
具体实施例方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。实施例I :一、灵芝多糖F31的制备取灵芝(Ganodermalucidum karst)子实体 250g,粉碎,用 5000ml 80°C 的热水抽提8h，过滤，滤液减压浓缩至IOOOml，再加入4倍体积乙醇沉淀，5000rpm离心，得沉淀，将沉淀重新溶解于热水中，用0. 45 y m直径的微孔滤膜过滤，滤液装入3000D孔径的透析袋透析24h，得粗多糖溶液，再调整粗多糖溶液中灵芝粗多糖的浓度为10mg/ml。取上述粗多糖溶液IOOml过滤，滤液上DEAE Sepharose Fast Flow色谱柱(4. 5 X 30cm)，用300ml的Tris-HCl (IOmM, pH = 8. 0)平衡，收集馏分浓缩得到馏分Fl ;接着用300ml的含0. IM NaCl的Tris-HCL (10mM，pH = 8. 0)洗脱，收集馏分浓缩得到馏分F2 ；最后用300ml的含0. 5M NaCl的Tris-HCL(10mM，pH = 8. 0)洗脱，收集馏分浓缩得到馏分F3，洗脱过程中的检测图如图I所示，F1、F2和F3相对应0D490中的Fraction 1、2和3。馏分F3上分子筛S^hacryl S300色谱柱，用H2O平衡，接着用H2O洗脱，第一个峰为有效峰，收集第一个洗脱峰F31(0D490中的F31峰)，减压浓缩，透析，冻干得灵芝多糖F31，洗脱过程中的检测图如图2所示。二、灵芝多糖F31的纯度和分子量测定取灵芝多糖F31 10mg，溶于Iml超纯水中，然后进行HPLC分析色谱条件TSK-GELG3000SffXL 色谱柱(300_X 718mm)，柱温 35°C ;流动相0. 05M的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液(pH6. 7，加0. 05% NaN3);体积流量0. 5mL/min ;示差折光检测器，恒温35°C ;进样量20uLoGPC 校正曲线的建立取 Mr 为 738、5800、1. 22X 104、2. 37X 104、4. 80X 104、
I.OOXlO5U. 86X 105、3. 80X 105、8. 53 X IO5 的多糖对照品 10mg，用 Iml 含 0. 05M 的NaH2PO4-Na2HPO4 缓冲液(pH 6. 7，加 0. 05 % NaN3)溶解，经 0. 45 y m 滤膜滤过，进行 GPC 分析。已知Mr多糖对照品的相应保留时间见表I。以多糖对照品的淋洗体积为横坐标，Mr为纵坐标做GPC的校正曲线，见图3。灵芝多糖F31的纯度和分子量的测定取IOmg灵芝多糖F31，用Iml的0. 05M的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液(pH6. 7，加0. 05 % NaN3)溶解，经0. 45 y m滤膜滤过，进行GPC分析。根据峰面积归一化求得该灵芝多糖F31的纯度> 98% (图4)，纯度较高，通过GPC色谱工作站自动计算得灵芝多糖F31的平均分子量为I. 90X 104D。表I :多糖对照品的保留时间
权利要求
1.一种灵芝多糖F31的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 (a)取灵芝(Ganodermalucidum karst)子实体,粉碎用热水抽提,然后再过滤,在滤液中加入乙醇沉淀，分离沉淀； (b)沉淀DEAE Sepharose Fast Flow 色谱柱，先用 Tris-HCl (IOmM, pH = 8. O)平衡，接着用含O. IM NaCl的Tris-HCL (10mM，pH = 8. O)洗脱，最后用含O. 5M NaCl的Tris-HCLdOmM, pH = 8. O)洗脱，分别得到馏分FU F2和F3 ;馏分F3分子筛SephacrylS300，用H2O平衡，接着用H2O洗脱，收集有效峰，减压浓缩，透析，干燥得灵芝多糖F31。
2.根据权利要求I所述的灵芝多糖F31的制备方法，其特征在于，所述的步骤(a)的沉淀先用热水溶解，再用O. 45 μ m直径的微孔滤膜过滤，滤液装入3000D孔径的透析袋透析，得粗多糖溶液，再调整粗多糖溶液中灵芝粗多糖的浓度，将此粗多糖溶液作为样品进行步骤(b)的上样层析分离。
3.根据权利要求I所述的灵芝多糖F31的制备方法制备得到的灵芝多糖F31。
4.权利要求3所述的灵芝多糖F31在制备治疗糖尿病药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的糖尿病为2型糖尿病。
6.一种治疗糖尿病的药物，其特征在于，该药物以权利要求3所述的灵芝多糖F31作为活性成分。
7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述的糖尿病为2型糖尿病。
全文摘要
本发明公开一种灵芝多糖F31的制备方法及其降血糖功能。灵芝多糖F31其制备方法为取灵芝(Ganoderma lucidum karst)子实体，粉碎用热水抽提，然后再过滤，在滤液中加入乙醇沉淀，分离沉淀；沉淀上DEAE Sepharose Fast Flow色谱柱，先用Tris-HCl(10mM，pH＝8.0)平衡，接着用含0.1M NaCl的Tris-HCL(10mM，pH＝8.0)洗脱，最后用含0.5M NaCl的Tris-HCL(10mM，pH＝8.0)洗脱，分别得到馏分F1、F2和F3；馏分F3上分子筛Sephacryl S300，用H2O平衡，接着用H2O洗脱，收集有效峰，减压浓缩，透析，干燥得灵芝多糖F31。本发明从灵芝子实体中分离出一种新的灵芝多糖F31，该灵芝多糖F31具有降血糖活性，可以用于制备治疗糖尿病的药物，尤其是治疗2型糖尿病的药物，为开发治疗糖尿病的新药打下基础，积极推动糖尿病天然药物活性成分的研究开发。
文档编号A61K31/715GK102617745SQ20121005608
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月5日 优先权日2012年3月5日
发明者吴清平, 李森柱, 杨小兵, 肖春, 谢意珍 申请人:广东省微生物研究所, 广东粤微食用菌技术有限公司