专利名称：一种用于骨软骨缺损修复的支架及其制备方法
技术领域：
本发明属于骨软骨缺损修复构件，特别涉及一种用于骨软骨缺损修复的支架。
背景技术：
软骨损伤在骨科疾病中十分常见，但关节软骨损伤治疗困难。在临床及实验中， “支架”被用于骨软骨缺损的修复。CN 101219069A公开了一种用于骨软骨修复的双层复合支架，由基架构成，基架的一端为模拟软骨样层，其另一端为模拟软骨下骨层，所述两层紧密结合，位于所述模拟软骨下骨层外表面设置有螺纹。模拟软骨样层的材料采用几丁质、几丁质胶原、纤维蛋白、藻酸盐、蚕丝蛋白、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物的一种或几种的混合物；所述模拟软骨下骨层的材料采用羟基磷灰石、磷酸三钙、聚醚醚酮、聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物、聚羟基乙酸、聚乳酸、蚕丝蛋白中的一种或几种的混合物。此种结构的支架虽可用于骨软骨缺损的修复，但从其模拟软骨样层和模拟软骨下骨层所选用的制作材料可以看出，力学性能难以达到要求，生物相容性有待提高。CN 100522^5C公开了一种具有仿生功能界面骨软骨复合组织一体化工程支架， 所述支架从上至下由软骨层、钙化层和软骨下骨层组成，软骨层和软骨下骨层借助钙化层的结构紧密连接；软骨层的组成材料为II型胶原和壳聚糖，钙化层的组成材料为II型胶原和羟基磷灰石，软骨下骨层的材料为I型胶原和羟基磷灰石，采用三维打印成型技术制作。 该技术方案存在以下问题1、由于支架从上至下由软骨层、钙化层和软骨下骨层组成，其钙化层为预构软骨钙化层，会阻隔骨与软骨的自然过渡，因为正常软骨钙化层为活软骨细胞在生物力学及局部微环境作用下自然活动形成的细胞-基质复合体。2、支架为三层结构， 其结构繁复，，增加了制作难度和制作成本。3.支架力学性能有待进一步提高。4.采用三维打印技术，技术要求高，不利于大规模推广。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种用于骨软骨缺损修复的支架， 此种支架不仅具有良好的生物相容性和骨软骨诱导能力，而且机械强度大幅度提高。本发明所述用于骨软骨缺损修复的支架，由具有孔隙的软骨层和具有孔隙的软骨下骨层构成，所述软骨层和软骨下骨层紧密结合为一体，软骨层的材料为I型胶原和硫酸软骨素的混合物，软骨下骨层的材料为多孔钛或多孔氧化钛或多孔钛合金。本发明所述用于骨软骨缺损修复的支架，其软骨层中，I型胶原与硫酸软骨素的质量比为5 20 1。本发明所述用于骨软骨缺损修复的支架，其软骨层的厚度Hl和软骨下骨层的厚度H2根据需要确定，根据临床经验，软骨层的厚度Hl —般为3mm 20mm，软骨下骨层的厚度H2 —般为3mm 25mm。本发明所述用于骨软骨缺损修复的支架，其软骨层孔隙的孔径为ΙΟΟμπι 1000 μ m ；其软骨下骨层具有多级连通的多重复合孔，大孔孔径为1000 μ m 10000 μ m,小孔孔径为10 μ m 1000 μ m,孔隙率为55 % 85 %。本发明所述用于骨软骨缺损修复的支架，其制备方法如下(1)软骨下骨层的制作将多孔钛或多孔氧化钛或多孔钛合金加工成软骨下骨层所要求的形状和尺寸；(2)软骨层浆料的制备原料为I型胶原、硫酸软骨素和质量浓度0. 1-10%的乙酸溶液，I型胶原与硫酸软骨素的质量比为5 20 1，乙酸溶液的量以I型胶原和硫酸软骨素能完全溶解为限；将I型胶原放入质量浓度0. 1 10%的乙酸溶液中，在0°C 20°C下进行搅拌使I 型胶原完全溶解，然后加入的硫酸软骨素并继续搅拌，当硫酸软骨素完全溶解后除去气泡， 即获软骨层浆料；(3)支架的成型与处理①将步骤(1)制作的软骨下骨层放入模具中，然后将步骤( 制备的软骨层浆料注入模具并将模具放入冻干机冷冻至少5小时成型；②将成型了的支架放入真空干燥箱中，在温度105°C、压力小于50Τοπ·下热交联至少24小时；③将热交联后的支架进行化学交联，所述化学交联是将热交联后的支架放入碳化二亚胺-N-羟基丁二酰亚胺水溶液中，在常压、室温下浸泡至少2小时；④将化学交联后的支架放入无菌水中漂洗至少两次，每次至少60分钟，即获用于骨软骨缺损修复的支架。 上述方法中，碳化二亚胺-N-羟基丁二酰亚胺水溶液的配方是IOOmL三蒸水中加入碳化二亚胺0. 138g 5. 52g，N-羟基丁二酰亚胺0. 032g 1. 28go本发明所述支架应放入无菌培养基中，在4°C的环境下存储备用。本发明具有以下有益效果1、由于本发明所述用于骨软骨缺损修复的支架的软骨下骨层材料为钛或氧化钛或钛合金，实验表明，本发明所述支架不仅具有良好的生物相容性，骨软骨诱导能力，而且机械强度高(压缩强度可达60MPa，弹性模量可达1. 8GPa)，满足人体生理需要。2、将本发明所述用于骨软骨缺损修复的支架用于动物实验，显示出本发明所述支架材料具有良好的骨软骨缺损修复效果(见实施例6)。3、本发明所述用于骨软骨缺损修复的支架结构简单，生产技术要求低，设备要求不高，条件可控性强，便于大规模生产。
图1是本发明所述用于骨软骨缺损修复的支架的结构示意图；图2是本发明所述用于骨软骨缺损修复的支架的软骨下骨层的扫描电镜图；图3是本发明所述用于骨软骨缺损修复的支架的软骨层的扫描电镜图；图4是细胞在本发明所述用于骨软骨缺损修复的支架的软骨层的生长状态图；图5是细胞在本发明所述用于骨软骨缺损修复的支架的软骨层的生长曲线；图6是本发明所述用于骨软骨缺损修复的支架的软骨下骨层修复动物的软骨下骨的Micro-CT三维重建图；图7是本发明所述用于骨软骨缺损修复的支架的软骨层修复动物软骨的HE染色图；图8是本发明所述用于骨软骨缺损修复的支架的软骨下骨层修复动物软骨下骨的甲苯胺蓝图。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明所述用于骨软骨缺损修复的支架的结构及制备方法与效果作进一步说明。下述实施例中，制备软骨下骨层的多孔钛或多孔氧化钛或多孔钛合金及制备软骨层的I型胶原、硫酸软骨素为生物医用材料，通过市场购买。实施例1本实施例中，用于骨软骨缺损修复的支架如图1所示，为圆柱体，其直径为3mm，由软骨层1和软骨下骨层2构成，所述软骨层1的厚度Hl为20mm，软骨下骨层2的厚度H2为 25mm，软骨层1和软骨下骨层2紧密结合为一体。软骨层1的材料为I型胶原和硫酸软骨素的混合物，I型胶原与硫酸软骨素的质量比为20 1，软骨下骨层2的材料为具有多重复合孔的多孔钛铬合金，其大孔孔径为7000-10000 μ m、小孔孔径为700-1000 μ m,孔隙率为 85%。制备方法的工艺步骤如下(1)软骨下骨层的制作将具有多重复合孔的多孔钛铬合金加工成如上所述的软骨下骨层2的形状和尺寸；(2)软骨层浆料的制备原料为I型胶原、硫酸软骨素和质量浓度10%的乙酸溶液，I型胶原与硫酸软骨素的质量比为20 1，乙酸溶液的量以I型胶原和硫酸软骨素能完全溶解为限；将I型胶原放入质量浓度10%的乙酸溶液中，在20°C下进行搅拌使I型胶原完全溶解，然后加入的硫酸软骨素并继续搅拌，当硫酸软骨素完全溶解后除去气泡，即获软骨层浆料；(3)支架的成型与处理①将步骤(1)制作的软骨下骨层放入模具中，然后将步骤( 制备的软骨层浆料注入模具并将模具放入冻干机冷冻48小时成型；②将成型了的支架放入真空干燥箱中，在温度105°C、压力45ΤΟΠ·下热交联36小时；③将热交联后的支架进行化学交联，所述化学交联是将所述支架放入碳化二亚胺-N-羟基丁二酰亚胺水溶液中，在常压、室温下浸泡5小时，碳化二亚胺-N-羟基丁二酰亚胺水溶液的配方是=IOOmL三蒸水中加入碳化二亚胺3. 52g，N-羟基丁二酰亚胺0. 78g ；④将化学交联后的支架放入无菌水中漂洗三两次，每次60分钟，即获用于骨软骨缺损修复的支架，将所述支架放入无菌DMEM培养基中，在4°C的环境下存储备用。实施例2本实施例中，用于骨软骨缺损修复的支架如图1所示，为圆柱体，其直径为20mm，由软骨层1和软骨下骨层2构成，所述软骨层1的厚度Hl为5mm，软骨下骨层2的厚度H2 为3mm，软骨层1和软骨下骨层2紧密结合为一体。软骨层1的材料为I型胶原和硫酸软骨素的混合物，I型胶原与硫酸软骨素的质量比为5 1，软骨下骨层2的材料为具有多重复合孔的多孔钛，其大孔孔径为1000-3000 μ m、小孔孔径为10-300 μ m，孔隙率为55%，工艺步骤如下(1)软骨下骨层的制作将具有多重复合孔的多孔钛加工成如上所述的软骨下骨层2的形状和尺寸；(2)软骨层浆料的制备原料为I型胶原、硫酸软骨素和质量浓度0. 的乙酸溶液，I型胶原与硫酸软骨素的质量比为5 1，乙酸溶液的量以I型胶原和硫酸软骨素能完全溶解为限；将I型胶原放入质量浓度0. 的乙酸溶液中，在0°C下进行搅拌使I型胶原完全溶解，然后加入的硫酸软骨素并继续搅拌，当硫酸软骨素完全溶解后除去气泡，即获软骨层浆料；(3)支架的成型与处理①将步骤(1)制作的软骨下骨层放入模具中，然后将步骤( 制备的软骨层浆料注入模具并将模具放入冻干机冷冻5小时成型；②将成型了的支架放入真空干燥箱中，在温度105°C、30TOrr下热交联48小时；③将热交联后的的支架进行化学交联，所述化学交联是将所述支架放入碳化二亚胺-N-羟基丁二酰亚胺水溶液中，在常压、室温下浸泡8小时，碳化二亚胺-N-羟基丁二酰亚胺水溶液的配方是=IOOmL三蒸水中加入碳化二亚胺0. 138g，N-羟基丁二酰亚胺 0. 032g ；④将化学交联后的支架放入无菌水中漂洗两次，每次60分钟，即获用于骨软骨缺损修复的支架，将所述支架放入无菌F12培养基中，在4°C的环境下存储备用。实施例3本实施例中，用于骨软骨缺损修复的支架如图1所示，为圆柱体，其直径为6mm，由软骨层1和软骨下骨层2构成，所述软骨层1的厚度Hl为3mm，软骨下骨层2的厚度H2为 6mm，软骨层1和软骨下骨层2紧密结合为一体。软骨层1的材料为I型胶原和硫酸软骨素的混合物，I型胶原与硫酸软骨素的质量比为5. 63 1，软骨下骨层2的材料为具有多重复合孔的多孔氧化钛，其大孔孔径为1000-7000 μ m、小孔孔径为100-700 μ m，孔隙率为70%， 工艺步骤如下(1)软骨下骨层的制作将具有多重复合孔的多孔氧化钛加工成如上所述的软骨下骨层2的形状和尺寸；(2)软骨层浆料的制备原料为I型胶原、硫酸软骨素和质量浓度0. 3%的乙酸溶液，I型胶原与硫酸软骨素的质量比为5. 63 1，乙酸溶液的量以I型胶原和硫酸软骨素能完全溶解为限；将I型胶原放入质量浓度0. 3%的乙酸溶液中，在4°C下进行搅拌使I型胶原完全溶解，然后加入的硫酸软骨素并继续搅拌，当硫酸软骨素完全溶解后除去气泡，即获软骨层浆料；(3)支架的成型与处理
①将步骤(1)制作的软骨下骨层放入模具中，然后将步骤( 制备的软骨层浆料注入模具并将模具放入冻干机冷冻17小时成型；②将成型了的支架放入真空干燥箱中，在温度105°C、20TOrr下热交联M小时；③将热交联后的的支架进行化学交联，所述化学交联是将所述支架放入碳化二亚胺-N-羟基丁二酰亚胺水溶液中，在常压、室温下浸泡2小时，碳化二亚胺-N-羟基丁二酰亚胺水溶液的配方是=IOOmL三蒸水中加入碳化二亚胺5. 52g，N-羟基丁二酰亚胺1. 28g ；④将化学交联后的支架放入无菌水中漂洗三次，每次60分钟，即获用于骨软骨缺损修复的支架，将所述支架放入无菌培养基中，在4°C的环境下存储备用。将本实施例制备的支架的软骨下骨层及软骨层用扫描电镜(S4800，日立公司)扫描，所获扫描电镜图见图2、图3。从图2可以看出，软骨下骨层中大孔与小孔并存，具有多重复合孔结构，各个大孔之间通过小孔相连；从图3可以看出，软骨层中存在大量孔隙，胶原纤维丝较交联前有明显变粗，卷曲，可见成片状连接，孔隙的孔径为100 300μπι。实施例4 细胞相容性试验将骨髓间充质细胞种入实施例3制备的支架的软骨层中，在37°C、常压、CO2孵箱中三维培养，培养7天后行HE染色及MTT试验。试验结果见图4，图5。从图4可以看出， 所述细胞在软骨层纤维中生长正常，从图5可以看出，所述细胞生长过程中增长正常，表明本发明所述支架软骨层具有优异的生物相容性。实施例5 力学性能试验使用微机控制电子万能试验机(长春市朝阳试验仪器有限公司，型号WDW-50) 测试实例3制备的支架的软骨下骨层的最大抗压强度及弹性模量。样品(n = 5)大小为 10 X 10 X 10mm3，加载速率为0. 5mm/分，试验机的设定最大载荷为20KN。实验结果最大抗压强度为60. 1 士 2. 35MPa，弹性模量为1. 8 士 0. 16GPa。实施例6 修复效果试验将本实施例3制备的支架植入4只比格犬的8个膝关节关节软骨缺损处修复其骨软骨缺损，三月后取出行Micro CT、HE染色、甲苯胺蓝染色。试验结果见图6、图7、图8。从图6可以看出，比格犬的骨组织(红色)长入软骨下骨层(白色)中，且与软骨下骨层结合紧密。从图7可以看出，修复的比格犬软骨组织与正常软骨等高，软骨表面较为光滑，修复的软骨中可见软骨陷窝细胞，其周围可见软骨基质；软骨修复组织中未见血管，正常软骨与修复的软骨结合紧密，未见明显界限。从图8可以看出，软骨下骨层(黑色)与比格犬软骨下骨(灰色)界面紧密结合，大量骨组织长入软骨下骨层中，新生骨组织结构完整，并可见骨陷窝。实验结果表明，本发明所述支架修复骨软骨缺损效果良好。
权利要求
1.一种用于骨软骨缺损修复的支架，由具有孔隙的软骨层(1)和具有孔隙的软骨下骨层(2)构成，所述软骨层(1)和软骨下骨层( 紧密结合为一体，其特征在于软骨层(1)的材料为I型胶原和硫酸软骨素的混合物，软骨下骨层O)的材料为多孔钛或多孔氧化钛或多孔钛合金。
2.根据权利要求1所述的用于骨软骨缺损修复的支架，其特征在于所述软骨层(1)中， I型胶原与硫酸软骨素的质量比为5 20 1。
3.根据权利要求1或2所述的用于骨软骨缺损修复的支架，其特征在于所述软骨层 (1)的厚度Hl为3mm 20mm，所述软骨下骨层(2)的厚度H2为3mm 25mm。
4.一种用于骨软骨缺损修复的支架的制备方法，其特征在于工艺步骤如下(1)软骨下骨层的制作将多孔钛或多孔氧化钛或多孔钛合金加工成软骨下骨层所要求的形状和尺寸；(2)软骨层浆料的制备原料为I型胶原、硫酸软骨素和质量浓度0. 1 10%的乙酸溶液，I型胶原与硫酸软骨素的质量比为5 20 1，乙酸溶液的量以I型胶原和硫酸软骨素能完全溶解为限；将I型胶原放入质量浓度0. 1 10%的乙酸溶液中，在0°C 20°C下进行搅拌使I型胶原完全溶解，然后加入硫酸软骨素并继续搅拌，当硫酸软骨素完全溶解后除去气泡，即获软骨层浆料；(3)支架的成型与处理①将步骤(1)制作的软骨下骨层放入模具中，然后将步骤( 制备的软骨层浆料注入模具并将模具放入冻干机冷冻至少5小时成型；②将成型了的支架放入真空干燥箱中，在温度105°C、压力小于50Τοπ·下热交联至少 24小时；③将热交联后的支架进行化学交联，所述化学交联是将热交联后的支架放入碳化二亚胺-N-羟基丁二酰亚胺水溶液中，在常压、室温下浸泡至少2小时；④将化学交联后的支架放入无菌水中漂洗至少两次，每次至少60分钟，即获用于骨软骨缺损修复的支架。
5.根据权利要求4所述用于骨软骨缺损修复的支架的制备方法，其特征在于碳化二亚胺-N-羟基丁二酰亚胺水溶液的配方是100mL三蒸水中加入碳化二亚胺0. 138g 5. 52g， N-羟基丁二酰亚胺0. 032g 1. 28go
全文摘要
一种用于骨软骨缺损修复的支架，由具有孔隙的软骨层和具有孔隙的软骨下骨层构成，所述软骨层和软骨下骨层紧密结合为一体，软骨层的材料为I型胶原和硫酸软骨素的混合物，软骨下骨层的材料为多孔钛或多孔氧化钛或多孔钛合金。其制备方法如下(1)将多孔钛或多孔氧化钛或多孔钛合金加工成软骨下骨层所要求的形状和尺寸；(2)软骨层浆料的制备；(3)支架的成型与处理，将步骤(1)制作的软骨下骨层放入模具中，然后将步骤(2)制备的软骨层浆料注入模具并将模具放入冻干机冷冻至少5小时成型；将成型了的支架进行热交联和化学交联，将化学交联后的支架放入无菌水中漂洗后即获用于骨软骨缺损修复的支架。
文档编号A61L27/02GK102526809SQ201210056068
公开日2012年7月4日 申请日期2012年3月6日 优先权日2012年3月6日
发明者吕晶同, 段鑫, 项舟 申请人:四川大学华西医院