专利名称：口蹄疫病毒vp1基因重组小反刍兽疫病毒活载体疫苗构建及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组病毒疫苗领域，更具体地，本发明涉及一种表达口蹄疫病毒VPl基因(编码VPl蛋白)的重组小反刍兽疫病毒疫苗。本发明还公开了制备所述重组小反刍兽疫病毒疫苗的方法和该重组小反刍兽疫病毒疫苗在制备预防小反刍兽疫和/或口蹄疫的疫苗中的应用。
背景技术：
小反会兽疫(Peste des petits ruminants, PPR)是由小反会兽疫病毒(Pestedes petits ruminants virus, PPRV)引起的一种高度接触性传染性疾病[I](参见后文参考文献列表)，严重危害山羊、绵羊、和野生小反刍兽[2]等动物，甚至曾经引起水牛发病。PPRV的致死率为70-80%，在新的OIE分类中，被列为重要经济动物疾病，且疫情必须通报0IE。PPR长期以来一直在非洲、中东、中亚、南亚及东南亚地区危害流行，和我国西部接壤的巴基斯坦[4]、塔吉克斯坦[5]近些年都有流行爆发。2007年PPRV传入我国西部边境地区，导致局部疫情，对我国的畜牧养殖业形成严重威胁。我国山羊和绵羊的饲养量数以亿计，但对于PPR的防控技术和经验不足，病原的研究和技术储备缺乏，给我国的PPRV的防控带来了极大的难度和挑战，迫切需要我们抓紧PPRV疫苗研发、诊断技术、监测、致病机制等研究，其中疫苗研发是重中之重。PPRV属副粘病毒科(Paramyxoviridae)麻疫病毒属(Morbillivirus)成员，与牛瘟病毒(Rinderpest virus, RPV)同属，基因组进化与抗原性关系密切，具有共同的中和抗体表位。PPRV为单链负股RNA病毒，由15948个碱基组成，不分节段。病毒粒子内主要含有6种结构蛋白，即核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素蛋白⑶和多聚酶大蛋白(L)。病毒囊膜表面的F和H蛋白为PPRV诱导中和抗体形成的主要免疫原，N蛋白不诱导中和抗体，但具有良好的免疫原性，是用于诊断的主要抗原[6-8]。针对PPR最早使用的疫苗是牛瘟弱毒病毒(Rinderpest Virus, RPV)，虽然能够提供免疫保护，但不能够产生PPRV的中和抗体[9]，后被经Vero细胞传代致弱的PPRV弱毒疫苗株(Nigeria75/1)所替代，后者能够产生较高的PPRV的中和抗体，提供坚强的免疫保护力。 把PPRV免疫保护抗原(H和F蛋白)的基因重组至山羊痘病毒基因组，则构建成PPRV重组山羊痘病毒疫苗[10-13]。以PPRV重组山羊痘病毒免疫山羊，不但能够提供足够的免疫保护抵抗PPRV强毒的攻击[10-13]，而且还可以利用PPRV N蛋白作为抗原，很容易地分免疫感染和自然感染，不影响血清学监测。本研究室采用我国分离的山羊痘病毒疫苗株，分别构建成了 PPRV H和F基因重组山羊痘病毒疫苗，疫苗防山羊痘和PPRV两种疾病，为我国的PPR的防控提供了一种重要的选择[12，13]。但PPRV重组痘病毒疫苗由于采用皮内注射和两次免疫程序[12，13]，劳动强度大，是其一大缺憾。
口蹄疫(foot and mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(foot and mouthdisease virus, FMDV)引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性人畜共患传染病，世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的疾病。该病传播途径多，传播速度快，在世界范围内曾多次发生流行，给各国造成了严重的经济损失。口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus, FMDV)属于小 RNA 病毒科(Picornaviridae) 口蹄疫病毒属(Aphthovirus)的成员，共有 A、O、C、Asia 1、SAT1、SAT2和SAT37个血清型，型与型之间不能产生交叉保护，且从临床症状上无法区别FMDV的血清型，这给疫苗免疫、诊断和防控带来困难。FMDV基因组为单股正链RNA，约有8. 5kb。基因组的中部是一个大的开放阅读框(ORF)，编码病毒的多聚蛋白，该聚蛋白经裂解后形成L前导蛋白、Pl区结构蛋白、P2区和P3区非结构蛋白。FMDV Pl区结构蛋白最终成熟裂解为4种结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4，这4种结构蛋白构成了 FMDV衣壳，其抗原表位(antigenicepitope)多位于衣壳蛋白上,决定着病毒的抗原性。Pl区的研究对掌握FMDV生物学特性和增殖机理，开展免疫学研究，诊断技术研 究，新型疫苗开发都有着重要作用。Pl区约2208bp，依次编码85、218、220、213个氨基酸的结构多肽，依次形成1A(VP4)、1B(VP2)、1C(VP3)和ID (VPl) 4种结构蛋白。4种结构蛋白最终形成五聚体单位构成病毒衣壳蛋白。VPl是口蹄疫病毒中惟一能够产生中和抗体的最重要的结构蛋白，它以突起的形式暴露在病毒粒子的表面，在免疫中发挥着主要作用。负链RNA病毒的反向遗传操作技术日益成熟，提供了标记疫苗开发的新途径，如水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus, VSV) [14-16]、麻疫病毒(measles virus)、狂犬病毒(rabies virus) [18]、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV) [19]和新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV) [20]等。以病毒为载体的基因工程疫苗可被视为减毒活疫苗和亚单位蛋白质疫苗的结合，它既可以避免亚单位疫苗需要佐剂和多次接种注射的缺点，又可以诱导全面而持久的免疫反应。可作为减毒活疫苗的病毒载体有痘病毒、腺病毒、杆状病毒、脊髓灰质炎病毒和伪狂犬病毒等。目前已用于FMD疫苗研究的载体主要有痘病毒[21]、腺病毒[22]、伪狂犬病毒[23，24]和牛瘟病毒[25]等。但未有使用PPRV作为载体的报道。由于PPRV和FMDV对山羊和绵羊都是危害巨大的烈性传染病，如果能够开发出重组病毒能够同时预防两种疾病，那么将会更有利于两种疾病的防控，并节约防控成本，具有巨大的社会效益和经济效益。
发明内容
针对上述研究背景，本发明人在已建立的PPRV反向遗传操作技术平台(已申请专利，中国专利申请号201010559545.8)基础上，体外拯救重组FMDV VPl蛋白的PPRV重组病毒，并研究其免疫效力。因此，本发明的一个目的是提供一种表达口蹄疫病毒VPl基因的重组小反刍兽疫病毒疫苗，其中所述口蹄疫病毒VPl基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示。在一个实施方案中，所述口蹄疫病毒VPl基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。在另一个实施方案中，用于表达口蹄疫病毒VPl基因的小反会兽疫病毒疫苗是PPRV Nigeria75/1(PPRV/N75/1)。在另一个实施方案中，所述口蹄疫病毒VPl基因位于所述小反刍兽疫病毒疫苗的编码磷蛋白(P)的基因和编码基质蛋白(M)的基因之间。在另一个实施方案中，所述的重组小反刍兽疫病毒疫苗其为rPPRV/lOlVPl。本发明还有一个目的是提供根据本发明的重组小反刍兽疫病毒疫苗在制备预防小反刍兽疫和/或口蹄疫(优选Aisa I型)的疫苗中的应用。本发明还有一个目的是提供一种生产根据 本发明的重组小反刍兽疫病毒疫苗的方法，该方法包括(I)构建转录质粒，该转录质粒包括其中插入口蹄疫病毒VPl基因的小反刍兽疫病毒疫苗的基因组全长cDNA序列；(2)构建一个或多个转录辅助质粒，所述辅助质粒能够分别表达所述小反刍兽疫病毒的核蛋白(N)、憐蛋白(P)、和多聚酶大蛋白(L)；(3)将所述转录质粒和转录辅助质粒共转染小反刍兽疫病毒疫苗复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞，优选所述小反刍兽疫病毒疫苗复制许可的宿主细胞是BHK细胞或Veix)细胞；和(4)从转染细胞的细胞悬液中拯救重组小反刍兽疫病毒。在一个实施方案中，所述转录质粒是pCI-PPRV/101VPl。在另一个实施方案中，所述转录辅助质粒分别是质粒pCI-N、pCI-P和pCI-L。本发明还有一个目的是提供根据本发明的方法制备的重组小反刍兽疫病毒疫苗，优选为 rPPRV/lOlVPl。本发明相对于现有技术的创新点本发明构建的表达FMDV (Aisa I型)VPl的重组PPRV (rPPRV/lOlVPl)与传统口蹄疫疫苗相比具有许多创造性和优越性。我国现行使用的口蹄疫(FMD)灭活疫苗是以灭活的口蹄疫病毒(FMDV)抗原为基础的一类疫苗，即通过当前流行的口蹄疫亚型代表毒株为疫苗毒种，经大量增殖培养后，使用适当的灭活剂灭活处理，并加入油佐剂配制而成的的疫苗。灭活疫苗对我国目前口蹄疫的防控起着重要的作用，仍然被广泛应用，但是也存在许多问题。首先，灭活苗使用的是强毒株，在生产中具有很大的生物安全危害，在灭活过程中存在灭活不彻底的情况，继而在使用过程中会散毒，反而导致疾病的流行；而rPPRV/lOlVPl完全没有生物安全性问题，其载体为弱毒疫苗，在几十年的使用中证实此弱毒疫苗的安全性，不需要灭活，使用中不会存在散毒的情况。其次，灭活疫苗使用中，会导致很难区别自然野毒感染和疫苗免疫，导致无法进行必要的血清学监控；而rPPRV/lOlVPl由于只表达了 VPl基因，因此可以使用FMDV的其它结构蛋白作为检测抗原，可以区分FMDV的自然野毒感染和疫苗免疫，大大方便了血清学监控，有利于实现FMDV在全球范围内的消灭计划。第三，灭活疫苗由于抗原量大，成分更复杂，而且加入了佐剂，对动物有较大毒性，因此会导致过敏反应等副作用，反而影响免疫效果，现在生产工艺对抗原进行浓缩纯化，但这又大大增加了生产成本；而rPPRV/lOlVPl为弱毒疫苗，不需要佐剂，成分简单，几乎无副作用，且生产成本较低，生产工艺简单，一般无需纯化。第四，灭活疫苗由于加入了佐剂，在长期储存条件下不稳定；而冲 1^/101￥ 1弱毒疫苗在冻干后，非常稳定，利于保存和运输。第五，灭活疫苗只能维持约6个月的短期免疫性和不能刺激高效的细胞免疫应答，且由于灭活疫苗在灭活后，抗原性发生改变，与天然状态已经不同了，这也影响了其免疫原性；而rPPRV/lOlVPl弱毒疫苗由于在动物体内能够复制，因此能够刺激细胞免疫，能够维持较长的免疫期，且其表达的是天然的VPl蛋白，免疫原性基本无改变。综上，此构建的rPPRV/lOlVPl弱毒疫苗在许多方面与传统疫苗相比具有很强的创新性和优越性，具有较强的使用价值，具有良好的应用前景。
图I.插入FMDV VPl的小反刍兽疫病毒基因组cDNA的构建示意图。含有VPl基因的重组PPRV基因组cDNA克隆构建策略其中大写加粗的序列CTT为基因间三核苷酸；“粗体小写字母”序列为kozak序列，“加下划线的大写字母”序列为Not I酶切位点，“斜体大写字母序列”为Pme I酶切位点；图2.间接免疫荧光和Western blot检测rPPRV/lOlVPl表达FMDV VPl蛋白wtPPRV/N75/l和rPPRV/lOlVPl分别感染Vero细胞。(I)分别以鼠抗PPRV全病毒高免血清和FMDV VPl原核表达蛋白免疫兔子制备的高免血清[28]为一抗，红色荧光素(TRITC) 标记的兔抗鼠IgG和绿色荧光素(FITC)标记的鼠抗兔IgG为二抗,进行免疫荧光检测。同时设未感染病毒Vero细胞的空白对照。(II)待Vero细胞CPE达到60% 80%时收获细胞，分别以FMDVVP1原核表达蛋白免疫兔子制备的高免血清[28]为一抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为二抗进行Western blot试验，同时设未感染病毒Vero细胞的空白对昭.
>、、、 图3. wtPPRV/N75/l和rPPRV/lOlVPl在Vero细胞上的生长动力学曲线；图4. rPPRV/lOlVPl 的山羊免疫后 FMDV 中和抗体检测。将 wtPPRV/N75/l (361、28、32,35 号羊)、rPPRV/lOlVPl (18、20、22、25、26、29 号羊)按 6 X IO6TCID5tl/ 只的剂量免疫山羊，免疫后第14、21、28和40天时颈部采血，分离血清进行FMDV中和抗体测定。用GraphPadPrism软件对两者进行2way ANOVA分析，结果差异显著(P < 0. 01)；图5. FMDV攻毒试验后的体温检测。用GraphPad Prism软件对免疫组和对照组的体温进行2way ANOVA分析，两者差异不显著(P > 0. 05)；图6. FMDV攻毒试验后的临床症状评分。采用t检验对免疫组和对照组进行分析，两者差异显著(P<0.01)；图7. pCI-PPRV质粒序列(具体构建参见中国专利申请No. 201010559545. 8说明书实施例 I)(从 5'端到 3'端)，其中 1096-1153 为 HamRz 序列，1154-17101 为 PPRV/N75/1基因组序列，17102-17192为HdvRz序列；图8.质粒pCI-PPRV和质粒pCI-PPRV/101EGFP的示意图(具体构建参见中国专利申请No. 201010559545. 8说明书实施例I)。质粒pCI-PPRV/101EGFP是在质粒pCI-PPRV序列中的4558和4559nt之间插入如下序列(从5'端到3'端)而获得的aggagcaagggcaactgagcttcacagacaaggcggccgcgccgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaagtttaaaccacatcctataatcaacatctcatactcggttgaaaacatcctctcaatcaggctattacaa
BBBBC其中1-32为基因转录信号起始序列(gene-start，GS) ；33-40为Not I位点；41-49为Kozak序列;50_769为EGFP序列；770_777为Pme I位点；778_843为基因转录信号终止序列(gene-end, GE) ;844_846为基因间隔三核苷酸；图9. pCI-PPRV/101VPl质粒序列。该质粒是在质粒pCI-PPRV序列中的4558和 4559nt之间插入如下序列(从5'端到3,端)(SEQ IDNo. 3)而获得的AGGAGCAAGGGCAACTGAGCTTCACAGACAAGGCGGCCGCGCCGCCACCATGactaccaccactggcgagtccgcggacccagtcaccaccacggttgagaactacggaggagagacccagacggcccgacggcttcacactgatgtcgccttcgttctcgacaggttcgtgaaactcacccagcccaagagcacccaaacccttgatctcatgcagatcccctcacacacactggtcggggcgcttctccggtctgcgacgtactacttctcagacctggaggttgcgctcgtccacacaggaccggtcacgtgggtgcccaatggtgcgcctaagaccgccttgaacaaccacaccaacccgactgcctaccagaagcagcctatcacccgcttggcactcccctacaccgctccccaccgtgtgctgtcaacagtgtacaacgggaagacaacgtacggagaagaatcctcgcggcgtggtgatcttgccgccctcgcacgcagagtgagcaaccggctgcccacttccttcaactacggcgctgtgaaggccgacaccatcacggagctgttgatccgcatgaagcgtgcggaaacatactgccccaggcccttgctggctcttgacaccacacaagaccgccgtaaacaggagatcattgcacctgagaaacagTAAGTTTAAACCACATCCTATAATCAACATCTCATACTCGGTTGAAAACATCCTCTCAATCAGGCTATTACAAAAAACTT其中1-32为 GS ；33-40 为 Not I 位点;41_49 为 Kozak 序列;50_682 为 VPl 基因序列；683-690为Pme I位点;691_756为GE序列;757_759为基因间隔三核苷酸。图10. pCI-N质粒序列(从5 '端到3 '端)，其中1069-1077为kozak序列；1078-2655为PPRVN蛋白基因序列；图11. pCI-P质粒序列(从V端到3 '端)，其中1092-1100为kozak序列；
1101-2630为PPRVP蛋白基因序列；和图12. pCI-L质粒序列(从5'端到:T端)，其中1093-1101为kozak序列；
1102-7653为PPRVL蛋白基因序列。pCI-N、pCI_P和pCI-L质粒序列也可参见中国专利申请No. 201010559545. 8的说明书附图9_11。
具体实施例方式下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。实施例I表达口蹄疫病毒VPl基因的重组小反刍兽疫病毒疫苗的构建I材料与方法I. I 材料PPRV Nigeria75/1 (PPRV/N75/1)疫苗株购自中国兽药监察所，口蹄疫强毒株(Asia-l/JSL/GSZY/06株)购自中牧实业股份有限公司保山生物药厂；BHK_21细胞(ATCCNo. CCL-10)和Vero细胞(ATCC No. CCL-81)由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所人兽共患病研究室保存，培养液均为含10%胎牛血清的DMEM ;质粒pCI购自Promega ;质粒pBluescript和pIRES-EGFP购自 Clontech ；PrimeSTAR HS DNA聚合酶，T4DNA连接没及其它限制性内切酶均购自TaKaRa公司；RNA提取试剂Trizol、鼠源反转录酶(MLV)、胎牛血清、DMEM 以及憐酸|丐转染试剂盒(Calcium phosphate Transfection Kit)购自 Invitrogen ;蛋白预染marker购自MBI公司；鼠抗PPRV全病毒高免血清由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所人兽共患病研究室制备[12];红色荧光素(TRITC)标记的兔抗鼠二抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购自Sigma公司；荧光倒置显微镜购自Zeiss公司；口蹄疫强毒株(Asia-l/JSL/GSZY/06株)毒价(山羊半数感染量，GID5tl)在山羊上测定。
I. 2表达FMDV VPl的重组PPRV基因组全长cDNA克隆的构建根据FMDV Aisa I 疫苗株的 VPl 序歹丨J (GenBank accession No. GU931682)合成VPl基因，同时在5’端引入序列GCGGCCGCGCCGCCACCAm ( ”为Not I酶切位点，“」，为kozak序列，“ ”为起始密码子)，亦3’端引入序列TAATAAGTTTAAAC (“=’为终止密码子”为额外加入的3个密码子，保证全cDNA感染性克隆序列长度能够被6整除；“―”为Pme I酶切位点)。参见图1，把以Not I和Pme I双酶切的VPl片段克隆至同样双酶切的pCI-PPRV/101EGFP (该质粒的构建方法和示意图参照已提交的中国专利申请号201010559545. 8的说明书实施例I)之中，获得质粒pCI-PPRV/101VPl，其中HamRz与HdvRz之间的序列长度序列符合“6碱基原则” [26，27]。I. 3病毒的拯救及扩增BHK-21细胞接种于35mm六孔板中，待生长至50% 80%单层时，采用磷酸钙转染试剂(Invitrogen)将感染性克隆质粒(pCI-PPRV/101VPl)及辅助质粒pCI_N、pCI_P和pCI-L(这些质粒的构建方法和示意图参照已提交的中国专利申请号201010559545. 8的说明书实施例I)分别以5 ii g、2. 5 ii g、I. 25 ii g和I. 25 ii g的量共转染BHK-21细胞，5% CO2,37°C培养，具体操作按试剂盒说明书进行。转染后8 12小时，弃去转染混合物，用含10%DMSO的PBS溶液休克细胞2. 5min，加入完全DMEM培养液继续于5% C02、37°C培养；3天后将细胞刮下来，细胞悬液冻融两次后，取300 u L接种于生长过夜、密度约70%的单层Vero细胞，感作I小时后加入含5%胎牛血清的DMEM，5% C02、37°C培养6-10天，显微镜下观察细胞病变(cytopathic effect, CPE)或荧光；待出现CPE时，收获细胞悬液，作为种毒保存于-70°C。救获表达VPl的重组病毒命名为rPPRV/lOlVPl。I. 4间接免疫荧光检测救获的病毒Vero细胞接种于24孔板中，待生长至70% 80%单层时，分别按MOI 0. I接种wtPPRV/N75/l (即亲本野生型 PPRV，PPRV/N75/1)和 rPPRV/lOlVPl ；4 天后，PBS 洗涤细胞 2次，3%多聚甲醛室温固定30min。分别以I : 50倍稀释的鼠抗PPRV全病毒高免血清[12]和以I : 200倍稀释的FMDV VPl原核表达蛋白免疫兔子制备的高免血清[28]为一抗，作用30min。PBST洗涤后加入I : 200倍稀释红色荧光素(TRITC)标记的兔抗鼠IgG和I : 64倍稀释绿色荧光素(FITC)标记的鼠抗兔IgG为二抗，作用30min，PBST洗涤后用荧光倒置显微镜(Zeiss)观察结果。I. 5ffestern blot 检测 rPPRV/lOlVPl 表达 FMDV VPl 蛋白
Vero细胞接种于6孔板中，待生长至70% 80%单层时，分别按MOI 0. I接种wtPPRV/N75/l和rPPRV/lOlVPl ;待CPE达到60 % 80 %时收获细胞，细胞样品用于Western blot分析，分别以FMDV VPl原核表达蛋白免疫兔子制备的高免血清[28]为一抗，以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为二抗。2 结果2. I间接免疫荧光及Western blot检测重组病毒表达VPl蛋白参见图2，间接免疫荧光结果表明，在绿色荧光模式下(以兔抗VPl多抗检测VPl的表达)，wtPPRV/N75/l显示绿色荧光信号阴性(图2，(I)E)，而rPPRV/lOlVPl显示绿色荧光信号阳性(图2，(I)D), rPPRV/lOlVPl成功表达FMDV VPl ;在红色荧光模式下(以鼠抗PPRV全病毒全病毒高免血清检测PPRV)，wtPPRV/N75/l (图2，(I)B)和rPPRV/lOlVPl (图2，(I)A)均显示阳性红色荧光信号。同时空白对照无红色和绿色荧光信号。结果表明，通过反向遗传操作技术，利用PPRV/N75/1疫苗株基因组cDNA克隆，成功救获具有感染性的野生 型 PPRV 疫苗株 rPPRV/lOlVPl。同时，Western blot 结果(图 2，(II))表明，rPPRV/lOlVPl成功表达了约30KDa的FMDV VPl蛋白[29]，而wtPPRV/N75/l未表达此蛋白，空白对照也无阳性条带。以上结果表明，rPPRV/lOlVPl能够正确表达FMDV VPl蛋白。实施例2重组病毒与亲本病毒株在Veix)细胞上的生长动力学特性比较将wtPPRV/N75/l和rPPRV/lOlVPl分别按MOI为0. 01接种于生长过夜、密度约为70% 80%单层Vero细胞，37°C感作Ih后，加入含2%胎牛血清的DMEM完全培养液，于5% C02、37°C培养。分别于感染后3、4、5、6、7和8天收获病毒，冻融2次后，病毒做10倍梯度稀释，在Veix)细胞上于96孔板中滴定TCID5tl (半数组织感染量)，感染后第14天于荧光倒置显微镜下观察CPE或荧光，计算病毒毒价(TCID5tl)，评价各病毒在Vero细胞上的生长动力学特点。wtPPRV/N75/l和rPPRV/lOlVPl在Vero细胞上的动力学生长曲线如图3所示，两株病毒的动力学生长曲线相似，表明外源基因的插入对于病毒的生长基本没有影响。实施例3动物免疫试验和攻毒试验I.方法I. I动物免疫试验选取10只口蹄疫病毒抗体阴性(病毒中和试验抗体效价小于I : 4)和PPRV抗体阴性(病毒中和试验抗体效价小于I : 5)的健康山羊，其中6只于两侧颈部肌肉免疫接种2ml/头细胞悬液(6 X IO6TCID5tl/只)接种后每日测量体温(每只所用的温度计不可交叉使用)至免疫后10天，并观察整个免疫期羊体的临床症状。另外4只免疫WtPPRV/N75/1 (6X IO6TCID50/只)，作为FMDV攻毒对照。免疫后第14、21、28和40天时颈部采血，分离血清用于PPRV和FMDV中和抗体测定，所有样品采集后，-20°C保存。PPRV和FMDV中和抗体效价检测方法按0. I. E.推荐方法进行(World Organisation for Animal Health.Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, 2004)。若抗体值小于I : 5效价记为2. 5。I. 2动物攻毒试验在免疫后第40天时，使用口蹄疫强毒株(Asia-l/JSL/GSZY/06株)进行攻击，在羊舌皮内分两点接种0. 2ml上述口蹄疫强毒株液(即IOOGID5tl/只)，接种后I 10天，每日测量体温(每只所用的温度计不可交叉使用)和观察临床症状(根据临床症状进行计分评价)。临床症状计分标准如下(最终结果按第10天的症状评价)0分一未出现任何水泡或溃疡症状；I分一仅接种部位出现水泡或溃疡症状；2分一接种部位以外的舌面、鼻镜或唇之一出现一个病灶的水泡或溃疡症状；
3分一舌面、鼻镜或唇之一出现两个或以上病灶或有一蹄出现水泡或溃疡症状；4分一舌面、鼻镜或唇之一处出现一个病灶同时一蹄出现一个病灶，或两蹄及两蹄以上出现水泡或溃疡症状。2.结果将wtPPRV/N75/l、rPPRV/101VPl 按 6X IO6TCID5tl/ 只的剂量免疫山羊，免疫后 I 10天体温正常，无明显临床症状，免疫后40天，免疫组和对照组的PPRV中和抗体效价全部大于10 (数据未显示)；FMDV的抗体效价如图4所示，rPPRV/lOlVPl免疫组(18、20、22、25、26,29号羊)的FMDV病毒中和抗体效价在免疫后40天后都大于10，而wtPPRV/N75/l对照组(361、28、32、35号羊)的FMDV病毒中和抗体效价在免疫后14 40天后都小于10，用GraphPad Prism软件对免疫组和对照组进行2wayAN0VA分析，两者诱导的FMDV中和抗体水平差异极显著(P < 0. 01)，表明rPPRV/lOlVPl免疫山羊诱导产生了充分的中和抗体。攻毒后I 10天的体温测量结果如图5所示，攻毒后，体温有所升高，6天后降至正常水平。用GraphPad Prism软件对免疫组和对照组进行2way ANOVA分析,差异不显著(P > 0. 05)。攻毒后第10天，免疫组山羊羊只有22、26号在接种部位出现水泡或溃疡，而对照组所有羊均在舌面注射部位出现溃疡，其中28、32、35号羊的舌面在非注射部位也出现了溃疡；此外，361和32号在蹄上出现溃疡，28号在齿龈上出现溃疡，评分结果见图6，采用t检验对免疫组和对照组进行分析，两者差异显著(P < 0. 01)，表明rPPRV/lOlVPl免疫山羊产生了充分的保护效力。本研究在前面建立的PPRV反反向遗传操作技术平台的基础上，在世界范围内首次成功构建并体外拯救出了表达FMDV (Aisa I型)VPl的重组PPRV (rPPRV/lOlVPl)。通过免疫荧光和western blot鉴定，该重组病毒能够成功表达VPl蛋白。该重组病毒免疫山羊，能够诱导显著的FMDV中和抗体，能够提供对FMDV (Aisa I型)强毒株的攻毒保护。利用反向遗传技术，构建的表达禽流感病毒HA基因的NDV重组病毒，已经成为中国禽流感防控疫苗体系中的重要一员[30]。因此本研究拯救的rPPRV/lOlVPl可作为疫苗，从而提供对PPRV和FMDV两种对羊具有巨大危害的疾病的免疫保护，将具有显著的经济效益和社会效益。参考文献I. Gibbs,E. P. , et al. ,Classification of peste des petits ruminants virusas the fourth member of the genus Morbillivirus. Intervirology,1979.11 (5)p. 268-74.2. Furley, C. W.，W. P. Taylor, and T. U. Obi，An outbreak of peste des petitsruminants in a zoological collection. Vet Rec,1987. 121 (19) p. 443-7.
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权利要求
1.一种表达口蹄疫病毒VPl基因的重组小反刍兽疫病毒疫苗，优选所述口蹄疫病毒为Aisa I型，更优选所述口蹄疫病毒VPl基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示。
2.根据权利要求I所述的重组小反刍兽疫病毒疫苗，其中所述口蹄疫病毒VPl基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
3.根据权利要求I所述的重组小反刍兽疫病毒疫苗，其中用于表达口蹄疫病毒VPl基因的小反刍兽疫病毒疫苗是PPRV Nigeria75/1 (PPRV/N75/1)。
4.根据权利要求1-3中任何一项所述的重组小反刍兽疫病毒疫苗，其中所述口蹄疫病毒VPl基因位于所述小反刍兽疫病毒疫苗的编码磷蛋白(P)的基因和编码基质蛋白(M)的基因之间。
5.根据权利要求4所述的重组小反刍兽疫病毒疫苗，其为rPPRV/lOlVPl。
6.根据权利要求1-5中任何一项所述的重组小反刍兽疫病毒疫苗在制备预防小反刍兽疫和/或口蹄疫的疫苗中的应用。
7.—种生产根据权利要求1-5中任何一项所述的重组小反刍兽疫病毒疫苗的方法，该方法包括 (1)构建转录质粒，该转录质粒包括其中插入口蹄疫病毒VPl基因的小反刍兽疫病毒疫苗的基因组全长cDNA序列； (2)构建一个或多个转录辅助质粒，所述辅助质粒能够分别表达所述小反刍兽疫病毒的核蛋白(N)、憐蛋白(P)、和多聚酶大蛋白(L)； (3)将所述转录质粒和转录辅助质粒共转染小反刍兽疫病毒疫苗复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞，优选所述小反刍兽疫病毒疫苗复制许可的宿主细胞是BHK细胞或Veix)细胞；和 (4)从转染细胞的细胞悬液中拯救重组小反刍兽疫病毒。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述转录质粒是pCI-PPRV/lOlVPl。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述转录辅助质粒分别是质粒pCI-N、pCI-P和 pCI-L。
10.根据权利要求7-9中任何一项的方法制备的重组小反刍兽疫病毒疫苗，优选为rPPRV/101VPlo
全文摘要
本发明涉及一种表达口蹄疫病毒VP1基因的重组小反刍兽疫病毒疫苗。本发明还公开了制备所述重组小反刍兽疫病毒疫苗的方法和该重组小反刍兽疫病毒疫苗在制备预防小反刍兽疫和/或口蹄疫的疫苗中的应用。
文档编号A61P31/14GK102641499SQ20121005607
公开日2012年8月22日 申请日期2012年3月6日 优先权日2012年3月6日
发明者印春生, 步志高, 陈伟业 申请人:中国兽医药品监察所, 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所, 哈尔滨维科生物技术开发公司