专利名称：microRNA-320(miR-320a)及其反义核苷酸在诊断、防治心血管疾病中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种内源性的非编码小RNA的新医药用途，更具体地说涉及microRNA-320 (hsa-miR-320a)及其反义核苷酸序列hsa-anti_miR-320a在动脉粥样硬化性心脑血管疾病的风险评估和动脉粥样硬化性心脑血管疾病的预防和治疗中的用途，属于心血管疾病的诊断、预防和治疗领域。
背景技术：
动脉粥样硬化是引起多种临床心血管事件的病理生理基础之一，并已成为致死率和致残率首要病因。已有的研究表明，动脉粥样硬化是多因素导致的，由多种细胞共同参与的炎症免疫过程，在炎症等因素作用下，动脉粥样硬化斑块变得不稳定，血管急性 闭塞导致急性心梗等事件。脂质沉积于各类血管腔内是动脉粥样硬化最显著的病理改变，然而其具体病理生理机制和分子信号网络还未被完全认识和阐明。到目前为止，以HMG-CoA还原酶为靶点的他汀类降脂物是最成功的抗动脉粥样硬化药物，但对部分患者无效或效果不理想，新的治疗措施亟待发掘；另一方面，动脉粥样硬化的病因和危险因素并未完全阐明，因此需要寻找新的危险因素和采用更加有效的风险评估方法。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类新发现的在多种生物进程中具有重要调控作用的非编码RNA，是来源于内源性发夹结构转录本的长度大约为22个核苷酸的单链RNAs。通常miRNA作为引导分子，与靶mRNA的3’ UTR碱基互补结合，介导基因转录后调控。大多数情况下，miRNA与靶mRNA结合后将抑制蛋白质翻译并激活核酸外切酶降解mRNA，若miRNA与靶mRNA高度互补结合则可激活核酸内切酶活性。在复杂的病理生理过程中，miRNA或miRNAs簇协同参与多级调控是miRNA重要的生物学特征之一；也是针对miRNA的应用治疗的理论基础之一。与传统的单靶点药物治疗相比，miRNA治疗可以在单个核苷酸分子靶点治疗的情况下，从多个水平调控疾病病理生理状态，达到更有效的治疗效果。已有研究表明miRNA在细胞增殖、凋亡、炎症反应、脂质代谢和免疫应答等多种与动脉粥样硬化密切相关的病理生理过程中发挥重要作用。且RNA干扰技术作为具有突破性临床应用前景的生物技术，从出现开始的短短数年间就有多个产品进入临床试验，获得了巨大的成功。但是否存在一类miRNAs在动脉粥样硬化发生和发展的关键环节或共同通路中有着重要的调控作用，通过干预这类miRNA能为动脉粥样硬化的治疗提供新的策略仍是对该领域科研人员的挑战。有研究者发现miR-320参与急性心肌梗死的病理生理过程(Circulation. 2009 ; 119 (17) :2357-66)，但没有对具体亚型和miR-320对炎症反应、脂质代谢及动脉粥样硬化的病理生理过程的影响进行深入的研究。而本发明则在申请人的原创基础工作上进一步确定了 miR-320a亚型参与炎症反应、脂质代谢及动脉粥样硬化形成和发展的致病作用和作用机制；确定了其作为动脉粥样硬化性疾病预测中的作用；并研究确定了 miR-320a的反义序列anti_miR-320a作为治疗药物的前景，在预防和治疗动脉粥样硬化型心血管疾病中的作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有理论和技术的不足，确定在动脉粥样硬化、冠心病和急性心肌梗死等动脉粥样硬化性心脑血管疾病中起关键作用的miRNA的亚型种类。本发明人通过大量的实验发现，在动脉粥样硬化、冠心病、急性心肌梗死等心血管疾病患者及有心血管疾病危险因素但还未患冠心病的高危人群外周血中miRNA-320a表达上调。同时，本发明人发现在动脉粥样硬化小鼠主动脉中miR-320a显著高表达。本发明人用携带hsa-miRNA_320a的表达载体pSilencer_miR-320a,在动脉粥样硬化模型小鼠中高表达miR-320a,结果发现，miRNA-320a过表达可以明显加重主动脉脂质沉积、炎症反应,促进动脉粥样硬化的发生发展。另一方面，本发明人根据hsa-miR-320a碱基序列，设计并合成了表达反义互补的序列anti-hsa-miR-320a,并成功的插入真核表达载体中构建成重组质粒pSilencer-anti_miR-320a,在动脉粥样硬化小鼠中过表达anti_miR-320a,可以逆转 上述的病理生理过程。具体的，本发明的第一个目的是提供动脉粥样硬化患者及有心血管疾病危险因素但还未患冠心病的高危人群的外周血miRNA表达谱，其中miRNA-320a显著的升高，这意味着miRNA可作为一种早期诊断和预测动脉粥样硬化性疾病的生物标志物。本发明的第二个目的是在第一个目的的基础上，本发明人通过实验确证miRNA-320a的反义核苷酸anti_miR-320a对动脉粥样硬化具有保护作用，anti_miR-320a可成为一种预防和治疗动脉粥样硬化性心脑血管疾病包括动脉粥样硬化、冠心病和急性心肌梗死、脑中风的药物。
四
摘要
十种微小RNA(microRNA，miRNA)在冠心病患者、冠心病高危人群和正常对照人群血浆中的相对水平(*表示与对照组相比，P < O. 05 表示与对照组相比，P < O. 01) ο说明书
从下面给出的说明结合附图，本发明的上面和其他目的和特征将变得明了。其中图I.动脉粥样硬化患者外周血miRNA筛查结果；图IA为采用探针法微阵列芯片筛查结果微阵列芯片检测急性心梗患者、动脉粥样硬化患者和正常对照人群血浆中的miRNA表达谱(绿色表示与对照组相比表达下调；红色表示与对照组相比表达上调)，图IB为采用Real-time PCR法验证结果十种微小RNA(microRNA，miRNA)在冠心病患者、冠心病高危人群和正常对照人群血浆中的相对水平Γ表示与对照组相比，P < O. 05广*表示与对照组相比，P < 0.01)。图2.不同处理组别的动脉粥样硬化小鼠主动脉中miR_320a的表达情况(wt :野生型小鼠；ApoE-/-:动脉粥样硬化小鼠表示与相同背景对照组小鼠相比，P <0.01 ；##表示与未处理野生型小鼠相比，P <0.01) 0图3.不同处理组别的动脉粥样硬化小鼠外周血血脂水平检测结果(wt :野生型小鼠；ApoE-/-:动脉粥样硬化小鼠广表示与相同背景对照组小鼠相比，P < O. 05 ;#表示与未处理野生型小鼠相比，P < O. 05);图3A为甘油三酯水平；图3B为胆固醇水平；图3C为高密度脂蛋白水平；图3D为低密度脂蛋白水平。图4.不同处理组别的动脉粥样硬化小鼠血浆炎症因子水平检测结果(wt :野生型小鼠；ApoE-/-:动脉粥样硬化小鼠表示与相同背景对照组小鼠相比，P < O. 01 ;##表示与未处理野生型小鼠相比，ρ < O. 01)。图4A为IL-6 ;图4B为MCP-1 ;图4C为slCAM ;图4D 为 pSelectin ;图 4E 为 TNF-alpha ;图 4F 为 fibrinogen。图5.不同处理组别的动脉粥样硬化小鼠主动脉斑块检测结果(wt :野生型小鼠；ApoE-/-:动脉粥样硬化小鼠表示与相同背景对照组小鼠相比，P <0.01 ；##表示与未处理野生型小鼠相比，P < O. 01)。图5A为油红染色结果反映小鼠主动脉中脂质沉积情况；图5B为胶原沉积面积检测；图5C为平滑肌细胞染色检测；图为巨噬细胞染色检测。图6.体外转染miR_320a抑制内皮细胞增殖、促进内皮细胞凋亡(2H-11 :小鼠 来源内皮细胞；HUVEC :人源内皮细胞；LF2K :转染试剂广表示与相同剂量Random相比，ρ<0.05; 〃表示与相同剂量Random相比，ρ < O. 01)。图6A为SRB法检测细胞存活率，图6B为BrdU掺入法检测细胞增殖结果；图6C为Annexin V/PI法检测细胞凋亡的结果。图7.脑卒中患者外周血miR_320a的表达水平表示与对照组相比，ρ <0.01)。
五具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例I.动脉粥样硬化患者外周血miRNA表达的筛查I.收集10例动脉粥样硬化、10例急性心梗患者及10例正常对照者外周血样本(取自2005-2010年在心血管内科住院患者，每个病例均由两个或以上临床医师确诊分类)。取材后，室温3，500rpm离心6min，取上层血浆，保存于-80°C冰箱。每O. 25ml外周血血衆中加入ImlTRIZOL LS (Invitrogen公司)，电动勻衆器勻衆。室温下放置5min后，加入O. 2ml氯仿,混勻后室温下放置5min,4°C 12, OOOg离心15min。将上层水相转移至新EP管中，加入O. 5ml异丙醇,混勻后室温下放置lOmin, 4°C 12, OOOg离心lOmin。弃上清,力口Λ Iml 75%乙醇，混匀后4°C 7，500g离心5min。弃上清，空气干燥沉淀5min，加入20 μ IDEPC 处理水，55-60 0C 水浴 IOmin 溶解 RNA。使用 Nanodrop ND-1000 检测 RNA 质量。miRCURY Hy3 /Hy5 Power labeling kit (Exqion)标记后，在杂交工作站进行 miRCURY LNA Array (v. 11. 0) (Exqion)杂交实验。Axon GenePix 4000B microarray scanner 扫描获得芯片图像。GenePix pro V6. O软件分析获得数据,利用microarray技术高通量筛选出在中差异性表达的miRNA谱(图1A)。2.另外分别收集20例冠心病患者、20例有冠心病危险因素但排除了冠心病的高危人群和20例正常对照人群外周血，按照上述方式提取RNA。采用广州锐博公司miRNA检测试剂盒对芯片初筛的10种miRNAs的表达进行检测miRNAs 逆转录
逆转录引物(RT Primer Mix)配置miRNA RT Primer I μ IU6RT Primer I μ IRNase free H2O 78 μ I逆转录反应体系RNA template 2 μ gRT Primer Mix 4 μ IRNase free H2O up to 19 μ I 以上体系混匀后，瞬时离心，70°C孵育IOmin后，冰育2min，再加入以下试剂2 X TS reaction buffer 25 μ ITS enzyme 2. 5 μ IRNase free H2O 3. 5 μ I逆转录反应程序420C 60min，70°C IOmin ;停止后 4°C备用，产物保存于-20°C。miRNAs real-time PCR 反应体系2XSYBRGreen Mix 9μ IRT product 2 μ ImiRNA Forward Primer 2 μ ImiRNA Reverse Primer 2 μ IRNase-free H2O 5 μ I反应程序95°C 30sec—(95°C IOsec—60°C 20sec—70°C lsec) X40cycles—Melting Curve结果显示其结果与芯片检测结果一致，其中，高危人群和冠心病患者外周血中miR-320a变化最明显(图1B)。表明miRNA_320a可作为一种动脉粥样硬化性心脑血管疾病早期风险评估和预测预防动脉粥样硬化性疾病、冠心病、急性心肌梗塞的候选生物标志物。实施例2.动脉粥样硬化小鼠主动脉miRNA_320a表达的检测I.本实验采用4周龄ApoE+小鼠及对照小鼠(C57BL6)，高脂饮食饲养8周，并按照5mg/kg体重的剂量分别给予尾静脉注射pSilencer-miR-320a质粒和pSilencer-anti-miR-320a质粒的处理。具体分为6组野生型小鼠对照(高脂饲养C57BL6小鼠)、野生型小鼠miR-320a处理干预(高脂饲养C57BL6+pSilencer_miR-320a)、野生型小鼠 anti_miR-320a 处理干预(高脂饲养 C57BL6+pSilencer-anti_miR-320a)、ApoE+小鼠(高脂饲养ApoE+小鼠)、ApoE+小鼠miR_320a处理干预(高脂饲养ApoE++pSilencer_miR-320a)和 ApoE+ 小鼠 anti_miR-320a 处理干预(高脂饲养 ApoE++pSilencer-anti_miR-320a)。2.实验终点时(周)，常规提取小鼠主动脉RNA 每IOOmg组织中加入Iml TRIZOL试剂，电动匀浆器匀浆。室温下放置5min后，力口入O. 2ml氯仿,混勻后室温下放置5min, 4V 12, OOOg离心15min。将上层水相转移至新Ep管中，加入O. 5ml异丙醇,混勻后室温下放置lOmin, 4°C 12, OOOg离心lOmin。弃上清,加入Iml 75%乙醇，混匀后4°C7，500g离心5min。弃上清，空气干燥沉淀5min，加入20μ1 DEPC处理水，于55-60°C水浴IOmin溶解RNA。获得的RNA溶液保存于_8(TC。3.紫外吸收法测定RNA浓度及纯度按照BioPhotometer plus (Eppendorf)仪器使用说明进行操作，测量前先用溶解RNA用的DEPC水调零。根据260nm处读值获得RNA浓度，以A260/A280的比值判定RNA纯度。4.变性琼脂糖凝胶电泳Ig琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60°C ，加入IOml的10XMOPS电泳缓冲液和18ml的37%甲醛溶液(12. 3M)。取3μ g RNAjP 3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10 μ g/mlo加热至7(TC孵育5min使样品变性。上样于胶孔中，5_6V/cm电压下电泳至溴酷兰指示剂进胶至少2-3cm，紫外透射光下观察并拍照。5.釆用广州锐博公司miRNA检测试剂盒对hsa_miR-320a的表达进行检测miRNAs 逆转录逆转录引物(RT Primer Mix)配置miRNA_320a RT Primer I μ IU6RT Primer I μ IRNase free H2O 78 μ I逆转录反应体系RNA template 2 μ gRT Primer Mix 4 μ IRNase free H2O up to 19 μ I以上体系混匀后，瞬时离心，70°C孵育IOmin后，冰育2min，再加入以下试剂2 X TS reaction buffer 25 μ ITS enzyme 2. 5 μ IRNase free H2O 3. 5 μ I逆转录反应程序420C 60min，70°C IOmin ;停止后 4°C备用，产物保存于-20°C。miRNAs real-time PCR 反应体系2XSYBRGreen Mix 9μ IRT product 2 μ ImiRNA Forward Primer 2 μ ImiRNA Reverse Primer 2 μ IRNase-free H2O 5 μ I反应程序95°C 30sec—(95°C IOsec—60°C 20sec—70°C lsec) X40cycles—Melting Curve结果显示=ApoE+小鼠主动脉中的miR_320a的含量为对照正常C57BL6小鼠主动脉中的4倍，且pSilencer-miR-320a处理能显著增加C57BL6小鼠和ApoE+小鼠主动脉miR-320a的表达(约2倍)，而pSilencer-anti_miR-320a处理可以降低C57BL6小鼠和ApoE+小鼠主动脉miR-320a的表达(约50% )(图2)。说明pSilencer-miR_320a能有效增加主动脉miR_320a的表达，而pSilencer-anti-miR-320a能有效的抑制主动脉miR_320a的表达。实施例3. miR-320a及anti_miR-320a在动脉粥样硬化小鼠血脂调控中的作用本实验采用4周龄ApoE+小鼠及对照小鼠(C57BL6)，高脂饮食饲养8周，并按照5mg/kg体重的剂量分别给予尾静脉注射pSilencer-miR-320a质粒和pSilencer-anti-miR-320a质粒的处理。具体分为6组野生型小鼠对照(高脂饲养C57BL6小鼠)、野生型小鼠miR-320a处理干预(高脂饲养C57BL6+pSilencer_miR-320a)、野生型小鼠 anti_miR-320a 处理干预(高脂饲养 C57BL6+pSilencer-anti_miR-320a)、ApoE+小鼠(高脂饲养ApoE+小鼠)、ApoE+小鼠miR_320a处理干预(高脂饲养ApoE++pSilencer_miR-320a)和 ApoE+ 小鼠 anti_miR-320a 处理干预(高脂饲养 ApoE++pSilencer-anti_miR-320a)。 实验终点时留取小鼠全血，EDTA抗凝，采用Abbott公司AEROSET ClinicalChemistry System检测血楽;甘油三酯、胆固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白水平。结果显示ApoE+小鼠外周血中的甘油三酯、胆固醇和低密度脂蛋白的含量均明显高于对照正常C57BL6小鼠(分别约为2. I倍、4. I倍和6. 4倍)，且pSilencer_miR-320a处理能进一步显著增加ApoE+小鼠外周血中的甘油三酯、胆固醇和低密度脂蛋白的含量(分别约为2. I倍、I. 3倍和I. 5倍)，而pSilencer-anti_miR-320a处理可以降低ApoE+小鼠外周血中的甘油三酯、胆固醇和低密度脂蛋白的含量(分别约为58. 3%,83. 5%和67. 8% )(图3A、3B和3D);同时，ApoE-7-小鼠外周血中的高密度脂蛋白的含量明显低于对照正常C57BL6小鼠(约为30. 6% )，且pSilencer-miR-320a处理能进一步降低ApoE+小鼠外周血中的高密度脂蛋白的含量(约为79. 5% ),而pSilencer-anti-miR-320a处理可以增加ApoE+小鼠外周血中的高密度脂蛋白的含量(约为I. 8倍)(图3C)。这些结果表明miR_320a具有促进ApoE+小鼠血脂紊乱的作用，而anti_miR-320a能显著改善ApoE+小鼠血脂紊乱。实施例4. miR-320a及antiniR-320a在ApoE+小鼠炎症反应调控中的作用本实验采用4周龄ApoE+小鼠及对照小鼠(C57BL6)，高脂饮食饲养8周，并按照5mg/kg体重的剂量分别给予尾静脉注射pSilencer-miR-320a质粒和pSilencer-anti-miR-320a质粒的处理。具体分为6组野生型小鼠对照(高脂饲养C57BL6小鼠)、野生型小鼠miR-320a处理干预(高脂饲养C57BL6+pSilencer_miR-320a)、野生型小鼠 anti_miR-320a 处理干预(高脂饲养 C57BL6+pSilencer-anti_miR-320a)、ApoE+小鼠(高脂饲养ApoE+小鼠)、ApoE+小鼠miR_320a处理干预(高脂饲养ApoE++pSilencer_miR-320a)和 ApoE+ 小鼠 anti_miR-320a 处理干预(高脂饲养 ApoE++pSilencer-anti_miR-320a)。实验终点时留取小鼠全血，EDTA抗凝，采用R&D公司ELISA试剂盒对IL_6、MCP_1、slCAM、pSelectin和TNF-α水平进行检测；采用AssayPro公司ELISA试剂盒检测血浆fibrinogen 水平进行。结果显示ApoE_7_ 小鼠外周血中的 IL-6、MCP_l、slCAM、pSelectin、TNF-α和fibrinogen含量均明显高于对照正常C57BL6小鼠(分别约为2. I倍、2. 7倍、2. I倍、2. 5倍、11. 3倍和5. 8倍)，且pSilencer-miR-320a处理能进一步显著增加ApoE+小鼠外周血中上述炎症因子的含量(分别约为I. 4倍、I. 4倍、I. 2倍、I. 5倍、2. 5倍和I. 2倍)，而pSilencer-anti_miR-320a处理可以降低ApoE+小鼠外周血中上述炎症因子的含量(分别约为 77. 8%,81. 8%,84. 6%,60. 7%,39. 8%和 82. 1% )(图 4)。这些结果表明miR_320a促进ApoE+小鼠炎症反应,而anti_miR-320a能显著减轻ApoE+小鼠炎症反应状态。实施例5. miR-320a及anti_miR-320a对动脉粥样硬化小鼠主动脉斑块的影响本实验采用4周龄ApoE+小鼠及对照小鼠(C57BL6)，高脂饮食饲养8周，并按照5mg/kg体重的剂量分别给予尾静脉注射pSilencer-miR-320a质粒和pSilencer-anti-miR-320a质粒的处理。具体分为6组野生型小鼠对照(高脂饲养C57BL6小鼠)、野生型小鼠miR-320a处理干预(高脂饲养C57BL6+pSilencer_miR-320a)、野生型小鼠 anti_miR-320a 处理干预(高脂饲养 C57BL6+pSilencer-anti_miR-320a)、ApoE+小鼠(高脂饲养ApoE+小鼠)、ApoE+小鼠miR_320a处理干预(高脂饲养 ApoE++pSilencer_miR-320a)和 ApoE+ 小鼠 anti_miR-320a 处理干预(高脂饲养 ApoE++pSilencer-anti_miR-320a)。实验终点时留取小鼠主动脉，采用冰冻切片进行油红O颜色，采用石蜡包埋切片进行Masson染色和针对alpha-actin及MAM0-2的免疫组化染色。结果显示，与C57BL6小鼠比较，ApoE+小鼠主动脉有明显的脂质沉积、胶原沉积、平滑肌细胞浸润和巨噬细胞浸润，且pSilencer-miR_320a处理能显著加重ApoE+小鼠主动脉的上述改变，而pSilencer-anti-miR-320a处理可以缓解ApoE+小鼠主动脉的上述病理改变(图5)。表明miR_320a具有促进ApoE+小鼠动脉粥样硬化斑块形成的作用，而anti-miR-320a能显著减轻ApoE+小鼠动脉粥样硬化斑块形成。实施例6. miR-320a及anti_miR-320a体外对内皮细胞增殖、凋亡的影响采用SRB法检测miR_320a对内皮细胞存活率的影响小鼠来源内皮细胞(2H-11)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)接种于96孔板中，5% CO2培养，待细胞长至60% -70%融合时，转染miRNA。具体分组control (空白对照组)、LF2K(转染试剂对照组)、低剂量随机对照(Random 50nM)、低剂量miRNA模拟物(miR_320a 50nM)、低剂量miRNA抑制剂(inhibitor 50nM)、高剂量随机对照(Random IOOnM)、高剂量miRNA模拟物(miR-320al00nM)和高剂量miRNA抑制剂(inhibitor IOOnM)。24 小时后，每孔加入 100 μ I三氯醋酸4°C固定I小时，倒掉固定液，每孔用去离子水洗5遍，甩干，空气干燥。每孔加入100 μ I SRB液，在室温放置10分钟，未与蛋白质结合的SRB用I %醋酸洗5遍，空气干燥。结合的SRB用150 μ I IOmmoI/L非缓冲Tris碱液(ρΗΙΟ. 5)振荡溶解。酶联免疫检测仪540nm波长处测各孔吸光值。这些结果显示miR-320a显著的抑制了内皮细胞的存活率，而anti-miR_320a则增加了内皮细胞的存活率，且这种效应呈剂量依赖关系(图6A)。采用BrdU掺入法检测miR_320a对内皮细胞增殖的影响小鼠来源内皮细胞(2H11)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)接种于96孔板中，5 % CO2培养，待细胞长至60% -70%融合时，转染miRNA。具体分组control (空白对照组)、LF2K(转染试剂对照组)、低剂量随机对照(Random 50nM)、低剂量miRNA模拟物(miR_320a 50nM)、低剂量miRNA抑制剂(inhibitor 50nM)、高剂量随机对照(Random IOOnM)、高剂量miRNA模拟物(miR-320al00nM)和高剂量miRNA抑制剂(inhibitor IOOnM)。4小时后，加入标记的fcdU。24小时后，采用Merck公司BrdU Cell Proliferation Assay试剂盒检测增殖。这些结果显示miR-320a显著的抑制了内皮细胞的增殖，而anti-miR_320a则促进了内皮细胞的增殖，且这种效应呈剂量依赖关系(图6B)。采用Annexin V/PI双染法检测miR_320a对内皮细胞凋亡的影响小鼠来源内皮细胞(2H11)接种于6孔板中，5 % CO2培养，待细胞长至60 % _70 %融合时，转染miRNA。具体分组control (空白对照组)、LF2K (转染试剂对照组)、随机对照(Random IOOnM)、miRNA模拟物(miR-320a IOOnM)和miRNA抑制剂(inhibitor IOOnM)。24小时后，收取细胞，采用南京凯基公司Annexin V/PI试剂盒检测凋亡。这些结果显示miR-320a显著的促进了内皮细胞的凋亡,而anti_miR-320a则抑制了内皮细胞的凋亡(图6C)。
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上述研究表明，miR_320a具有抑血管内皮细胞制增殖、促进凋亡的作用，而anti-miR-320a能促进增殖、抑制凋亡。实施例7.中风患者外周血miR_320a的表达情况收集10例脑中风患者及10例正常对照者外周血样本(取自2008-2010年武汉市医院住院患者，每个病例均由两个或以上临床医师确诊分类)。按照前述方法提取RNA，并检测miR-320a的表达。结果显示中风患者外周血中miR_320a明显增高，与动脉粥样硬化患者、冠心病和急性心肌梗死患者外周血中miR-320a的表达改变一致(图7)。表明miRNA_320a可作为一种早期风险评估或协助诊断动脉粥样硬化性心脑血管疾病如大动脉粥样硬化、冠心病、急性心肌梗塞和缺血性脑卒中的生物标志物。实施例8.制备检测动脉粥样硬化风险评估的试剂盒试剂盒成分检测试剂盒包括用于扩增miR_320a的特异性逆转录引物及real-time PCR引物对一套；用于扩增对照RNA (U6)的特异性逆转录引物及real-time PCR
引物对一套及相关试剂，成分和含量如下(100次)，保存于-20度
权利要求
1.一种包含Sequence ID No. I所示的核酸序列的，用于诊断或者评估动脉粥样硬化性心脑血管疾病患病风险的试剂盒。
2.按照权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述的心脑血管疾病包括动脉粥样硬化、冠心病、急性心肌梗死和动脉粥样硬化性脑卒中等动脉粥样硬化性心脑血管疾病。
3.一种预防或治疗心血管疾病的药物组合物，由有效量的权利要求I所述的核酸序列和药学上可接受的载体或辅料组成。
4.一种包含Sequence ID No. 2所示的核酸序列的，用于诊断或者评估动脉粥样硬化性心脑血管疾病患病风险的试剂盒。
5.按照权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的心脑血管疾病包括动脉粥样硬化，冠心病、急性心肌梗死和脑卒中等动脉粥样硬化性心脑血管疾病。
6.一种预防或治疗心血管疾病的药物组合物，由有效量的权利要求4所述的核酸序列和药学上可接受的载体或辅料组成。
全文摘要
本发明公开了miR-320a及其反义核苷酸分别在动脉粥样硬化性心脑血管疾病的风险评估/诊断和预防及治疗动脉粥样硬化性心脑血管疾病中的用途。本发明人通过大量的实验研究证明miR-320a在动脉粥样硬化型心脑血管疾病(动脉粥样硬化、冠心病、心肌梗死和脑卒中)及冠心病的高危人群中血浆(或血清)水平改变(增高)并有明显致动脉粥样硬化、炎症状态和血脂代谢紊乱作用；证明miR-320a的其反义核苷酸anti-miR-320a对上述动脉粥样硬化性心脑血管疾病及其相关的紊乱状态有明显减轻和防治作用。最终确定(1)将其作为一种新型的药物作用靶点，可能通过使用反义核苷酸anti-miR-320a预防和治疗动脉粥样硬化性心脑血管疾病(如动脉粥样硬化、冠心病、心肌梗死和脑卒中等)；(2)外周血液miR-320a水平可以作为一种新的生物标志物，检测它的表达水平可用来预测和评估动脉粥样硬化性心血管系统疾病的风险或协助诊断已经存在的动脉粥样硬化性心血管疾病。还可以通过荧光定量PCR技术检测患者外周血液中的miR-320a的表达水平，用于协助对上述心血管疾病的诊断。
文档编号A61P9/10GK102965429SQ201210069179
公开日2013年3月13日 申请日期2012年3月15日 优先权日2012年3月15日
发明者汪道文, 陈琛, 杨盛兰, 王峰, 龙光文 申请人:汪道文, 陈琛, 杨盛兰