一种血脑屏障药动学持续给药系统及检测系统的制作方法

专利名称：一种血脑屏障药动学持续给药系统及检测系统的制作方法
技术领域：
本发明属于医学检测系统领域，涉及一套实时检测药物透过血脑屏障的检测系统，具体涉及一种血脑屏障药动学持续给药系统及检测系统，尤其涉及一套在大鼠清醒状态下的持续给药装置和持续抽取脑脊液进行HPLC分析以实时检测血脑屏障的药物动力学系统。
背景技术：
脑屏障是维持中枢神经系统内神经元周围微环境稳定性的结构，从而保证神经元正常功能活动。根据形态的不同，脑屏障分三类血-脑屏障(BBB)、血-脑脊液屏障、脑脊液-脑屏障。其中，血脑屏障为三者中最重要的组成部分。血脑屏障起着限严格制外部物质进入脑组织神经系统并维持中枢神经系统微环境稳定的作用。药物能否透过血脑屏障对研究药物的体内分布、药物量效关系具有十分重要的意义，其透过程度也是药物是否作用·于中枢神经系统内神经元的一个重要指标，因此，评价药物是能否透过血脑屏障及透过程度成为药物学研究中的一个重要课题，同时也是当前药物学家所面临的一个难题。目前，检测药物能否通过血脑屏障的方法主要有四大类动物活体法、离体脑组织法、建立体外血脑屏障模型、建立数学模型。具体实验中可根据实验动物的不同选择适当的检测方法。动物活体检测法评价药物通过血脑屏障状况的方法主要分为四类第一，监测脑脊液(CSF)。脑脊液-脑屏障可使CSF与细胞外液互相交通，现认为物质一旦从血液进入CSF，便可自由扩散进入脑组织，监测CSF是筛查能通过血脑屏障的药物的重要手段，故多年来一直以CSF的变化来反映脑内神经元生存环境。第二，脑内微透析法是一种在动物清醒状态下连续灌注药物并采集特定脑区灌流液的方法。由于此技术是经半透膜收集标本的，标本基本上不含大分子蛋白质等物质，因此标本可直接进行HPLC分析。该检测方法的不足是其提取物仅是经探针半透膜透析而来的局部细胞间液的小分子物质，无法反映整个大脑内的状况；第三，药物放射性标记法是一种利用放射影像学方法检测药物是否可通透血脑屏障的方法。如经大鼠尾静脉注射99Tc标记的磁性纳米粒子，并将大鼠头部置于磁场，然后通过单光子发射计算机断层显像仪进行观察，检测结果可以表明该载体系统能成功携带99Tc跨过正常大鼠血脑屏障到达脑部；第四，在活体动物进行药代参数测定也可间接证明药物透过血脑屏障的能力。活体动物的观察监测可充分利用机体整体调节机制，等同于药物实际使用时的生理状况。但该方法由于受限于时间、经费、技术条件等，难以进行大规模药物筛查，其对药物过血脑屏障的生理、病理机制的观察研究存在局限性。通过离体脑组织检测评价药物透过血脑屏障情况的方法有五种第一，单次颈动脉注射技术。动物颈动脉置管后，把溶有待检药物和已进行放射性标记的内对照物的林格液快速推注入颈总动脉，断头，取脑，进行分析计算。此技术操作快，适于高通量筛查，但因实验中未实行外部动脉结扎，目标化合物可扩散到全身，且由于时间限制，技术难度较大；第二，原位脑灌流技术。操作需结扎颈外动脉分支枕动脉、甲状腺上动脉以及结扎颈内动脉翼突腭动脉。经颈外动脉输药，输入时要夹闭颈总动脉，输药完毕后继续输入生理盐水以灌洗。本技术敏感性高，可以准确研究PH值、离子、流速、蛋白质量浓度等因素对物质吸收入脑的影响。但此方法技术操作难度大，完成实验所需动物数量多，实验数据分析工作量大。第三，静脉注射技术。该技术被誉为评价BBB通透性的“金标准”。大鼠或小鼠经股静脉或尾静脉置管注入目标化合物及血浆体积标记物，经股动脉置管于不同时间点取血。实验毕，杀死动物，测脑内化合物浓度。此操作被认为是最接近药物在人体内真实状况的检测技术。第四，放射自显影技术。该技术是将放射性同位素标记化合物导入生物体内，经过一段时间后，将标本制成切片或涂片，一定时间的放射性曝光处理，然后经过显影、定影处理显示还原的黑色银颗粒，即可得知标本中标记物的准确位置和浓度。但有该法存在一个缺陷，即无法分辨究竟是目标化合物还是其代谢产物的显影。第五，高效液相色谱分析，该技术具有分离效率高，选择性好，分析速度快，灵敏度高等特点，在物质检测分析中被广泛运用。应用体外血脑屏障模型(blood-brain barrier model, BBBM)检测评价药物通过BBB的方法近来脑血管碎段BBBM在实验中应用广泛，也能长期保存且保留具有大量活体BBB特征(如紧密连接复合体、囊泡结构、紧密连接转运子、ABC转运蛋白、来普汀受体等)的被培养出来的离体BBBM。BBBM因其可在实验中取代活体动物，省时省力，且避免了伦理学上的争议，故在研究药物通过BBB的动力学方面得到广泛应用。但其也有局限性，如培养·
评价药物通过血脑屏障及通过程度是非常困难的，现有的检测手段都有其优势和劣势，而不同的药物也往往呈现出不同的药物分布，因此，现有的检测手段中没有哪种方法可以适用于所有的药物分布评价，因而研发一种适用面广、效率高、操作简便的通过血脑屏障的技术方式成为目前医药研发过程中所亟需的，这对于药物开发特别是脑疾病治疗药物的开发具有十分重要的意义。

发明内容
鉴于上述一系列的血脑屏障药物动力学检测技术的局限性，本发明提供了一种血脑屏障药动学持续给药系统及检测系统，尤其涉及一种在动物清醒状态下的持续给药装置以及持续抽取脑脊液进行HPLC分析的实时检测血脑屏障药物动力学的系统，通过建立经颈静脉持续给药系统模型和清醒状态下脑脊液持续抽取系统以及使用HPLC作脑脊液检测，达到建立一种检测药物能否通过血脑屏障以及通过程度的测定方法。本发明所提供的检测血脑屏障药物动力学的系统操作简单，检测准确性高，避免了持续给药给动物造成的痛苦，其应用对动物实验科学具有十分重要的意义。本发明的一种动物清醒状态下血脑屏障药物动力学检测系统包括经颈静脉持续给药系统、实验动物清醒状态下脑脊液持续抽取系统和HPLC脑脊液检测系统。本发明的第一个方面是提供了一种结构简单、操作简便且成本低廉的经颈静脉持续给药系统。本发明建立的经颈静脉持续给药系统，包括给药部分、连接部分。其中给药部分包括肝素帽、螺丝、硬性导管、注射内管、螺帽。肝素帽，连接于硬性导管竖直部末端，防止漏液和气栓。螺丝，上端可与肝素帽旋紧，防止漏液；下端可与螺帽旋紧，从而固定注射内管和硬导管连接。硬性导管，呈L形弯折状，分竖直部和水平部，竖直部上部外面套有螺丝，可与导管帽和螺帽锁紧，硬性导管的外径优选为O. 56mm±0. IOmm ;注射内管，后连接PE软管，前端插入硬性导管内，用于注射药物；螺帽位于螺丝外侧，用于锁紧注射内管和硬性导管；连接部分由PE软管组成，PE软管的一端与前述的硬性导管的水平部连接，另一端为自由端；PE软管的规格可以根据具体血管管腔的内径进行调整，优选为外径O. 85mm,内径O. 42mm的PE软管；PE软管的长度也可根据具体情况进行确定,优选为3cm_10cm。上述经颈静脉持续给药系统的还可以包括垫片、粘结块、Epon、止血夹和线结，其中垫片位于硬性导管转弯处垂直于硬性导管的竖直部放置，可以起到固定和防止静脉给药时药液溢出的作用；所述粘结块由AB胶制成，位于硬性导管和垫片之间，作用是将前述的硬性导管粘结于垫片的端面上，而前述的竖直部则垂直垫片设置；所述Epon(环氧树脂)是由AB胶水绕软管自由端做成的球状物，便于固定；止血夹，用于静脉给药时夹紧血管，防止血液上行溢出；线结主要用于PE软管植入血管后，打结捆绑固定PE软管和血管。上述经颈静脉持续给药系统的工作原理为体内结扎一侧颈静脉远心端后，在近心端插入PE软管并结扎牢固，建立颈静脉插管模型；体外在大鼠头顶埋植肝素帽给药端·口，端口与之前的PE软管插管接合(PE软管穿过皮下)，从而实现从体外至颈静脉的长期多次给药。相应地，本发明还提供了一种利用上述持续给药装置的动物给药方法，它包括如下步骤(I)麻醉用适当药物麻醉实验动物，取其仰卧位固定，手术暴露实验动物的颈静脉；(2)颈静脉插管模型制作显微止血夹夹住右颈静脉近心端，待血管充盈时，远心端结扎，显微镊提着颈静脉远心端，显微剪在颈静脉上方斜朝向心端开口，充满肝素的插管插入颈静脉至Epon处，在Epon的两端分别结扎后互相结扎固定颈静脉插管；(3)系统测试及给药实验动物颈部固定安装经静脉持续给药系统，缓慢推动与给药端连接的注射器，判断插管是否通畅，若通畅，进行颈部与头部的缝合后即可给予待测药物。本发明的第二个方面是提供一种清醒状态下脑脊液的持续抽取装置及其方法，该脑脊液持续抽取装置使用玻璃电极作为针头，刺破实验动物的寰枕筋膜，可实现实验动物清醒状态下于小脑延髓池持续抽取脑脊液。本发明所建立的脑脊液持续抽取装置由图钉式插管、连接部分和固定部分三个组成部分；其中图钉式插管由细玻璃针头、PE软管、医用透明敷料及502胶组成；PE软管前端插入细玻璃针头内，并用502胶水固定；医用透明敷料位于图钉式插管的前端，其与图钉式插管的相对位置可以控制图钉式插管进入寰枕筋膜的深度；插管和医用透明敷料之间也用502粘好，稳固而富有弹性，可沿寰枕筋膜贴稳。其中连接部分主要有PE软管和单向瓣膜组成。PE软管主要起连接作用，PE软管的前端与细玻璃针头相连，后端延续，其后端延续部分可以外接微量进样器，微量进样器拉伸可形成真空抽取脑脊液。单向瓣膜主要是起到单向开关作用，微量进样器针头插入时开启，拔出时关闭，防止脑脊液抽取时脑脊液的回流。单向瓣膜的存在可以实现随时抽取脑脊液，又可避免脑脊液漏出。其中固定部分包括粘结块和基板组成，其中粘结块为组织胶遇组织液形成的凝固块，可以固定PE软管并使复合体直立于基板上面。上述持续抽取脑脊液装置中，所用材料均可根据实验需要选用，当抽取大鼠脑脊液时，所用的耗材及规格优选为所述细玻璃管优选为细玻璃电极尖端，极细、斜坡状，故其在寰枕筋膜上的开口极小且极少漏液。细玻璃针头长度为4-5mm ；PE软管优选为由单体乙烯聚合形成PE树脂组成，其管外径优选为O. 85mm、内径优选为O. 42mm ;所述医用透气敷料的孔间间隙;所述粘结块为聚乙烯材质,底面直径O. 85cm,高I. 15cm ;所述基板的材质同粘结块，O. 95cm*2. 15cm ;所述单向瓣的材质同粘结块，由单体乙烯聚合而成，管外径
I.OOmm.内径 O. 60mm。相应的，本发明还提供了一种利用上述持续抽取脑脊液装置抽取动物脑脊液的方法，其特征在于包括如下步骤 (I)麻醉用适当药物麻醉实验动物，取其仰卧位固定，确定好小脑延髓池大致位置，暴露寰枕筋膜后，用蒸馏水冲洗创面，无菌棉球擦净；(2)固定及测试将图钉式插管按压在硬脑膜上，组织胶涂抹固定，用微量进样器抽取少量脑脊液以检测插管是否成功；(3)定期用微量进样枪缓慢抽取脑脊液。上述脑脊液持续抽取装置抽取实验动物脑脊液的方法中，实验操作在显微直视下操作，成功率较高。本发明所述持续抽取脑脊液装置，与现有技术相比具有以下意想不到的技术优势a)本发明所述持续抽取脑脊液装置在大鼠清醒状态下抽去脑脊液，且抽去的量较微透析多，亦不局限于局部细胞间液的小分子物质，可反映整个大脑内的状况。b)本发明持续抽取脑脊液装置结构简单、成本低廉、制作简单、封闭性良好，可普及使用。且利用本发明持续抽取脑脊液装置可在清醒状态下随时随量抽去动物脑脊液分析，更大程度地保证药物通过血脑屏障结果的真实性和准确性c)本发明持续抽取脑脊液装置所用的组织胶是一种组织粘合剂，由单体η-丁基-2-丙烯酸氰构成，该物质粘合强度高，在接触组织液后会迅速发生聚合反应。实验过程中无需缝拆线，无需使用局麻药物；对实验动物的局部损伤少，从而可以有效防止细菌感染，粘合层防水、防污染；无毒。另外PE软管及开关为硅橡胶材质。上述材料均能够最大限度的减少感染，并保证最终结果测定的准确性。d)与现有技术相比，本发明的优点还在于本发明持续抽取脑脊液装置可在大鼠清醒状态下取脑脊液。抽取装置结构简单，生产制造方便，材料易得，制造成本较低，便于推广使用，符合国际上遵循的“ 3R”原则。本发明的第三个方面是针对上述的技术现状而提供一种HPLC脑脊液检测系统，主要对持续抽取实验动物的脑脊液进行HPLC分析，即利用已经熟练掌握的抽取脑脊液方法多次抽取非血性脑脊液并运用高效液相色谱法以检测脑脊液中是否含有带筛选的药物及其含量浓度，以评价该药物透过血脑屏障的的具体情况。一种利用HPLC脑脊液检测系统检测脑脊液中药物含量的方法，其包括以下步骤a)脑脊液取样每隔一段时间利用所述持续抽取脑脊液装置系统抽取一定体积动物脑脊液。进一步地，本发明人发现，一般每隔5分钟抽取一次脑脊液可以满足反映药物在脑脊液中的含量情况。b)脑脊液处理脑脊液中含有大量其他物质如大分子蛋白，会影响高效液相对药物检测的准度。因此在脑脊液处理过程中，将抽取得到的脑脊液用高速冷冻离心机离心除去大分子蛋白。c)高效液相检测利用高效液相常规手段检测药物在脑脊液中的浓度，并结合给药情况对检测结果分析，得出结论。本发明还提供了一种利用上述所述动物清醒状态下血脑屏障药物动力学检测系统测定药物通过血脑屏障的方法，其主要包括如下步骤a)将实验动物用合适药物麻醉后，安装经颈静脉持续给药持续给药装置，给予待测药物；b)安装经颈静脉持续给药装置后，能实现在有效时间跨度内多次经颈静脉给予待测药物；·c)给药一定时间后，在实验动物上安装脑脊液持续抽取装置，在清醒状态下按一定频次于实验动物小脑延髓池抽取脑脊液；d)将脑脊液冷冻离心除去大蛋白，利用高效液相色谱检测脑脊液中药物浓度。上述测定药物通过血脑屏障的方法，可以适用于常见的实验动物，如大鼠、小鼠、猫、犬、兔、鸭、猪、猴等，优选适用于以大鼠为造模动物测定药物通过血脑屏障的情形。上述所述动物清醒状态下血脑屏障药物动力学检测系统测定药物通过血脑屏障的方法，其最佳的实施方式如下所述a)实验动物麻醉用适当药物麻醉实验动物,取其仰卧位固定；b)颈静脉插管模型制作手术暴露实验动物的颈静脉，显微止血夹夹住右颈静脉近心端，待血管充盈时，远心端结扎，显微镊提着颈静脉远心端，显微剪在颈静脉上方斜朝向心端开口，充满肝素的插管插入颈静脉至Epon处，在Epon的两端分别结扎后互相结扎固定颈静脉插管；c)经静脉持续给药系统固定、测试及给药实验动物颈部固定系统，缓慢推动与给药端连接的注射器，判断插管是否通畅，若通畅，进行颈部与头部的缝合后即可给予待测药物。d)持续脑脊液抽取系统固定及测试确定好小脑延髓池大致位置，暴露寰枕筋膜后，将图钉式插管按压在硬脑膜上，组织胶涂抹固定，用微量进样器抽取少量脑脊液以检测插管是否成功。e)脑脊液抽取及处理定期用微量进样枪缓慢抽取脑脊液，高速冷冻离心机离心除去大分子蛋白后待测。f)脑脊液中药物检测利用高效液相色谱法确定脑脊液中待测药物的有无及含量。本发明所述的动物清醒状态下血脑屏障药物动力学检测系统与现有技术相比，至少取得了如下突出预想不到的技术效果I.实验动物特别是大鼠或小鼠的静脉注射难度大，且持续给药给实验动物带来诸多痛苦，本发明通过采用颈静脉插管技术解决了实验动物的持续给药的难题，且操作简单；
2.本发明对常规静脉插管技术的改进，解决了由于实验动物自身活动时易导致插管脱落的问题；3.手术技术的改进，使得实验动物颈静脉插管模型存活率大大提高；4.本发明使用玻璃电极作为针头抽取脑脊液，并用医用敷料控制针头进入深度，有效的解决了因进针过深导致实验动物死亡的问题；5.本发明使用玻璃电极因其针头细，解决了因重复抽取导致寰枕筋膜破裂的问题；6.本发明检测系统使用时均在显微镜下操作，解决了抽取的脑脊液带血的问题，从而提高了药物通过血脑屏障检测结果的准确性和可靠性。


图I为经颈静脉持续给药系统示意图；图2持续抽取脑脊液装置结构示意图；图3持续抽取脑脊液装置固定部分的结构示意图；图4持续抽取脑脊液装置插管结构示意图；图5持续抽取脑脊液装置开关结构示意图；图6大鼠插入寰枕筋膜仿真图。
具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明作更进一步详细描述。本领域技术人员应该理解，实施例并不以任何方式限制本发明，任何在本发明基础上所做的等同替代均在本发明要求保护的范围之内。实施例I本发明所示血脑屏障动力学检测系统图I到6示出了本发明清醒状态下血脑屏障动力学检测系统的一种最佳的优选方式。如图I所示，本发明所建立的一种实验动物清醒状态下血脑屏障药动学持续给药系统，包括给药部分、连接部分和固定部分。其中给药部分包括肝素帽I、螺丝2、硬性导管
3、注射内管5、螺帽6。肝素帽1，连接于硬性导管竖直部末端，能够防止漏液和气栓。螺丝2，上端可与肝素帽I旋紧，下端可与螺帽6旋紧，从而固定注射内管和硬导管连接。硬性导管3，呈L形弯折状，分竖直部和水平部，竖直部上部外套有螺丝2，可与肝素帽I和螺帽6锁紧，硬性导管3的外径优选为O. 56mm±0. IOmm ;注射内管5，后接PE软管，前端插入硬性导管内，用于注射药物；螺帽6，用于锁紧注射内管和硬性导管；连接部分由PE软管7组成，PE软管7的一端与前述硬性导管3的水平部连接，另一端为自由端；在给药时，自由端可以插入到动物的血管中。上述PE软管7的规格可以根据具体血管管腔的内径进行调整，优选为外径O. 85mm,内径O. 42mm的PE软管；PE软管的长度也可根据具体情况进行确定，优选为3cm-10cm。上述经颈静脉持续给药系统的还可以包括垫片4、粘结块、Epon 8、止血夹9和线结10，其中垫片4位于硬性导管转弯处垂直于硬性导管的竖直部放置，可以起到固定和防止静脉给药时药液溢出的作用；所述粘结块由AB胶制成，位于硬性导管和垫片之间，作用是将前述的硬性导管粘结于垫片的端面上，而前述的竖直部则垂直垫片设置；所述Epon8 (环氧树脂)是由AB胶水绕软管自由端做成的球状物，便于固定；止血夹9，用于静脉给药时夹紧血管，防止血液上行溢出；线结10主要用于PE软管植入血管后，打结捆绑固定PE软
管和血管。上述给药系统的工作原理为给药前将PE软管最前端拉长，在约2_3mm处用AB胶做好Epon。用止血夹9在体内结扎一侧颈静脉远心端后,在近心端插入PE管7的自由端，并通过线结10结扎牢固。体外在大鼠头顶埋植肝素帽给药端口，其中体内端一紧接体内部分的PE管(即7，穿过皮下)，从而实验按照一定的注射速率在体外给药至颈静脉。附图2到附图5示出了动物清醒状态下血脑屏障药物动力学检测系统脑脊液持续抽取装置部分，其中如图2所示，所述的脑脊液持续抽取装置由图钉式插管、连接部分和固定部分三个组成部分；其中，如图4持续抽取脑脊液装置插管结构示意图所示，图钉式插管由细玻璃针·头5、PE软管8、医用透明敷料6及502胶4组成；PE软管8前端插入细玻璃针头内，并用502胶水固定；医用透明敷料位于图钉式插管的前端，其与图钉式插管的相对位置可以控制图钉式插管进入寰枕筋膜的深度；插管和医用透明敷料之间也用502粘好，稳固而富有弹性，可沿寰枕筋膜贴稳。组织胶遇组织液立即凝固，且粘性好进一步加强了插管的稳固性。为进一步保证末端牵拉时插管不移动，我们用敷料和组织液将软管沿着枕骨一直往上贴。其中连接部分主要有PE软管I和单向瓣膜3组成。PE软管主要起连接作用，PE软管的前端与细玻璃针头相连，后端延续，其后端延续部分可以外接微量进样器，微量进样器拉伸可形成真空抽取脑脊液。单向瓣膜主要是起到单向开关作用，微量进样器针头插入时开启，拔出时关闭，防止脑脊液抽取时脑脊液的回流。单向瓣膜的存在可以实现随时抽取脑脊液，又可避免脑脊液漏出。其中固定部分包括粘结块9和基板7组成，其中粘结块为组织胶遇组织液形成的凝固块，可以固定PE软管并使复合体直立于基板7上面。本发明图3示出了持续抽取脑脊液装置固定部分的结构示意图，其中单向瓣膜3位于PE软管2中，主要是起到单向开关作用，微量进样器针头插入时开启，拔出时关闭，防止脑脊液抽取时脑脊液的回流，PE软管2的外侧由502胶包裹形成复合体，该复合体与基板附图I中基板7相连，便于抽取装置的固定。本发明附图6所示为大鼠插入寰枕筋膜仿真图，该仿真图示出了脑脊液持续抽取装置的固定部位，其中图钉式插管的细玻璃针头I穿破筋膜，医用透明敷料2粘在筋膜上固定，其与图钉式插管的相对位置可以控制图钉式插管的进入深度。将PE软管4沿着枕骨贴好，用组织胶水3将图钉式插管进一步固定好。本发明所建立的HPLC脑脊液检测系统为本领域的常用手段，在此不做赘述。一种利用上述实验动物清醒状态下血脑屏障药动学测定系统测定药物通过血脑屏障的方法，其包含以下步骤a)实验动物麻醉用适当药物麻醉实验动物,取其仰卧位固定；b)颈静脉插管模型制作手术暴露实验动物的颈静脉，显微止血夹夹住右颈静脉近心端，待血管充盈时，远心端结扎，显微镊提着颈静脉远心端，显微剪在颈静脉上方斜朝向心端开口，充满肝素的插管插入颈静脉至Epon处，在Epon的两端分别结扎后互相结扎固定颈静脉插管；c)经静脉持续给药系统固定、测试及给药实验动物颈部固定系统，缓慢推动与给药端连接的注射器，判断插管是否通畅，若通畅，进行颈部与头部的缝合后即可给予待测药物。d)持续脑脊液抽取系统固定及测试确定好小脑延髓池大致位置，暴露寰枕筋膜后，将图钉式插管按压在硬脑膜上，组织胶涂抹固定，用微量进样器抽取少量脑脊液以检测插管是否成功。e)脑脊液抽取及处理定期用微量进样枪缓慢抽取脑脊液，高速冷冻离心机离心除去大分子蛋白后待测。f)脑脊液中药物检测利用高效液相色谱法确定脑脊液中待测药物的有无及含
量。·实施例二利用本发明所示检测系统研究肝素通过大鼠血脑屏障情况I、利用经静脉持续给药系统给药①10%水合氯醒O. 3ml/100g乌拉坦(I. 2g/kg)麻醉大鼠,取仰卧位固定；用金霉素眼药膏封眼，在门牙一右腋窝与右耳前一左腋窝连线的交点区域划定第一手术区域并进行第一次备皮，在第一手术区域消毒，铺设带孔的手术巾，在第一手术区域切成纵向皮肤切口，约1-1. 5cm，切割皮下深浅筋膜，进行及时止血处理，沿肌间隙顺纤维方向钝性分离皮下组织及肌肉组织，显露并游离右颈静脉，在其下方穿线结扎备用；②显微止血夹夹住右颈静脉近心端，待血管充盈时，远心端结扎，显微镊提着颈静脉远心端，显微剪在颈静脉上方斜朝向心端开口，充满肝素的插管插入颈静脉至Epon处，在Epon的两端分别结扎后互相结扎固定颈静脉插管,插管总长度约为3. 5-4. 5cm ；③在大鼠两耳朵连线前约Icm的头骨平台上开约O. 8-1. 5cm的开口，显微止血钳夹持插管的另一端，从颈部皮下开始绕过耳后到达头部开口处，将其与已充满肝素的头部部件相连，将头部部件埋于头皮下，缓慢推动与给药端连接的注射器，判断插管是否通畅，若通畅，进行颈部与头部的缝合，在缝合处涂抹金霉素眼药膏。将预先配置好的肝素溶液(肝素浓度为20%，IOOmg肝素溶于O. 9%生理盐水400mL中)经上述经颈静脉给药系统给药，给药完毕后20min开始抽取脑脊液。2、利用本发明持续抽取脑脊液装置抽取大鼠脑脊液①腹腔注射O. 3ml/100g的10%水合氯醛麻醉大鼠。用手确定好小脑延髓池大致位置，外科剪剪去表面毛发。利用脑立体定位耳杆、门齿杆固定大鼠头部。沿后正中线小脑延髓池体表投影切一纵行切口(约I. 5-2. 5cm)，在显微操作下用止血钳和镊子钝性分离后颈部肌肉、组织。最深层附着在枕骨L的肌肉用手术刀背刮开，以避免出血，暴露寰枕筋膜后，用蒸馏水冲洗创面，无菌棉球擦净。②将图钉式插管通过软管与单向开关连接，外科胶涂抹图钉四周，显微镜直视下，将图钉按压在硬脑膜上，组织胶涂抹固定插管。用微量进样器抽取少量脑脊液以检测插管是否成功。将软管沿枕骨贴紧固定，缝合肌肉和开口，开关半埋与皮下。给大鼠注射青霉素。③定期用微量进样枪缓慢抽取脑脊液20ul。时间梯度优选为每5分钟抽取一次脑脊液，共抽取5次或更多次数。
3、高效液相色谱检测脑脊液中药物浓度3. I脑脊液前处理用微量进样枪通过本发明中的持续抽取脑脊液装置取脑脊液20微升，加O. 4mol/L过氯酸$04)180微升，混匀，371，120001'1^11离心lOmin。取上清液20微升稀释至500微升。3. 2高效液相色谱检测脑脊液中药物浓度实验步骤I)适合于物质A的HPLC流动相体系采用ODS柱，以乙腈/水为流动相系统。通过调节磷酸盐/乙腈洗脱体系的PH值，使目标寡肽与脑脊液以及血浆中的干扰性组分分离，观察目标峰是否出现。 2)A物质在组织液中的稳定性根据物质A出峰时间以及pH体系，取5个不同时间样本I号、2号、3号、4号、5号,按设定的时间间隔取10微升样品溶液注入HPLC分析讨论自给药后20min起，每隔5min取一次脑脊液样品，脑脊液样品处理后进入高效液相色谱测定，检测结果显示，给药20min-45min中内脑脊液中未发现肝素的存在，提示肝素在20min-45min不能通过血脑屏障。实施例三利用本发明所示检测系统研究玉米低聚肽、小麦低聚肽通过大鼠血脑屏障情况实验操作步骤及模型制作同实施例一，不同的是给药为玉米低聚肽、小麦低聚肽，配成O. Olmg/ml溶液,每只鼠注射O. 5ml,结果显示,给药20min后,脑脊液中显示有玉米低聚肽、小麦低聚肽存在，且在20min-45min内，玉米低聚肽、小麦低聚肽在40min时脑脊液中药物浓度最高，提示该药物易通过血脑屏障。
权利要求
1.一种动物清醒状态下血脑屏障药物动力学检测系统，其特征在于，它包括经颈静脉持续给药系统、实验动物清醒状态下脑脊液持续抽取系统和HPLC脑脊液检测系统。
2.如权利要求I所述的动物清醒状态下血脑屏障药物动力学检测系统，其特征在于，所述的经颈静脉持续给药系统包括给药部分、连接部分； 其中给药部分包括肝素帽、螺丝、硬性导管、注射内管、螺帽；肝素帽，连接于硬性导管竖直部末端，防止漏液和气栓；螺丝，上端可与肝素帽旋紧，防止漏液；下端可与螺帽旋紧，从而固定注射内管和硬导管连接；硬性导管，呈L形弯折状，分竖直部和水平部，竖直部上部外面套有螺丝，可与导管帽和螺帽锁紧，硬性导管的外径优选为0. 56mm±0. IOmm ;注射内管，后连接PE软管，前端插入硬性导管内，用于注射药物；螺帽位于螺丝外侧，用于锁紧注射内管和硬性导管； 其中连接部分由PE软管组成，PE软管的一端与前述的硬性导管的水平部连接，另一端为自由端。
3.如权利要求2所述的动物清醒状态下血脑屏障药物动力学检测系统，其特征在于，所述的经颈静脉持续给药系统还可以包括垫片、粘结块、Epon、止血夹和线结；其中垫片位于硬性导管转弯处垂直于硬性导管的竖直部放置；所述粘结块由AB胶制成，位于硬性导管和垫片之间，而前述的竖直部则垂直垫片设置；所述Epon(环氧树脂)是由AB胶水绕软管自由端做成的球状物，便于固定；止血夹，用于静脉给药时夹紧血管；线结主要用于PE软管植入血管后，打结捆绑固定PE软管和血管。
4.一种利用权利要求2所述的持续给药装置的给药方法，其特征在于，它包括如下步骤 (1)麻醉用适当药物麻醉实验动物，取其仰卧位固定，手术暴露实验动物的颈静脉； (2)颈静脉插管模型制作显微止血夹夹住右颈静脉近心端，待血管充盈时，远心端结扎，显微镊提着颈静脉远心端，显微剪在颈静脉上方斜朝向心端开口，充满肝素的插管插入颈静脉至Epon处，在Epon的两端分别结扎后互相结扎固定颈静脉插管； (3)系统测试及给药实验动物颈部固定经静脉持续给药系统，缓慢推动与给药端连接的注射器，判断插管是否通畅，若通畅，进行颈部与头部的缝合后即可给予待测药物。
5.如权利要求I所述的动物清醒状态下血脑屏障药物动力学检测系统，其特征在于，所述实验动物清醒状态下脑脊液的持续抽取装置由图钉式插管、连接部分和固定部分组成； 其中图钉式插管由细玻璃针头、PE软管、医用透明敷料及502胶组成；PE软管前端插入细玻璃针头内，并用502胶水固定；医用透明敷料位于图钉式插管的前端，其于图钉式插管的相对位置可以控制图钉式插管；前端可插入并固定于寰枕筋膜上，其可通过医用透明敷料控制； 其中连接部分主要有PE软管和单向瓣膜组成；PE软管主要起连接作用，单向瓣膜主要是起到单向开关作用，微量进样器针头插入时开启，拔出时关闭，防止脑脊液抽取时脑脊液的回流；单向瓣膜的存在可以实现随时抽取脑脊液，又可避免脑脊液漏出； 其中固定部分包括粘结块和基板组成，其中粘结块为组织胶遇组织液形成的凝固块，主要起到固定PE软管并使复合体直立于基板上面。
6.一种利用权利要求5所述的持续抽取脑脊液装置抽取动物脑脊液的方法，其特征在于，包括如下步骤 (1)麻醉用适当药物麻醉实验动物，取其仰卧位固定，确定好小脑延髓池大致位置，暴露寰枕筋膜后，用蒸馏水冲洗创面，无菌棉球擦净； (2)固定及测试将图钉式插管按压在硬脑膜上，组织胶涂抹固定，用微量进样器抽取少量脑脊液以检测插管是否成功； (3)定期用微量进样枪缓慢抽取脑脊液。
7.一种利用权利要求1、2或4所述的检测系统测定药物通过血脑屏障的方法，其特征在于，它主要包括如下步骤 (1)将实验动物用合适药物麻醉后，安装经颈静脉持续给药持续给药装置，给予待测药物； (2)安装经颈静脉持续给药装置后，能实现在有效时间跨度内多次经颈静脉给予待测药物； (3)给药一定时间后，在实验动物上安装脑脊液持续抽取装置，在清醒状态下按一定频次于实验动物小脑延髓池抽取脑脊液； (4)将脑脊液冷冻离心除去大蛋白，利用高效液相色谱检测脑脊液中药物浓度。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，它包括如下步骤 (1)实验动物麻醉用适当药物麻醉实验动物，取其仰卧位固定； (2)颈静脉插管模型制作手术暴露实验动物的颈静脉，显微止血夹夹住右颈静脉近心端，待血管充盈时，远心端结扎，显微镊提着颈静脉远心端，显微剪在颈静脉上方斜朝向心端开口，充满肝素的插管插入颈静脉至Epon处，在Epon的两端分别结扎后互相结扎固定颈静脉插管； (3)经静脉持续给药系统固定、测试及给药实验动物颈部固定系统，缓慢推动与给药端连接的注射器，判断插管是否通畅，若通畅，进行颈部与头部的缝合后即可给予待测药物； (4)持续脑脊液抽取系统固定及测试确定好小脑延髓池大致位置，暴露寰枕筋膜后，将图钉式插管按压在硬脑膜上，组织胶涂抹固定，用微量进样器抽取少量脑脊液以检测插管是否成功； (5)脑脊液抽取及处理定期用微量进样枪缓慢抽取脑脊液，高速冷冻离心机离心除去大分子蛋白后待测； (6)脑脊液中药物检测利用高效液相色谱法确定脑脊液中待测药物的有无及含量。
全文摘要
本发明公开了一种一套实时检测药物透过血脑屏障的检测系统，具体公开了一套在实验动物清醒状态下的持续给药装置和持续抽取脑脊液进行HPLC分析以实时检测血脑屏障的药物动力学系统，该检测系统克服了现有监测手段的不足，且操作简单，灵敏度高，有广阔的医学应用前景。
文档编号A61B10/00GK102784012SQ20121007212
公开日2012年11月21日 申请日期2012年3月16日 优先权日2012年3月16日
发明者余照亮, 徐晔, 邓盛文, 邱佳和, 邱帅, 陈佛平, 顾怀宇 申请人:中山大学