专利名称：一种用于皮肤缺损的修复剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种组织填充剂及其制备方法，更具体地说，涉及一种用于皮肤缺损的修复剂及其制备方法。
背景技术：
人体软组织填充是作为修复软组织在损伤后的主要治疗方法。十九世纪就已经开始使用石蜡、硅氧烷进行填充。上个世纪八十年代之后又出现了明胶粉末材料，但其均有疗效不确定，毒副作用大等问题。1997年之后，Isolagen采用自体成纤维细胞作为组织填充材料，有了一定的疗效，但存在显效慢，疗效不显著等问题。中国专利03155833. X中公开了一种除皱祛疤的注射剂，应用了自体皮肤，经体外分离、培养和扩增，制成于葡萄糖液中的一种注射剂，治疗疤痕和祛除皱纹。由于该技术使用的生物材料取自患者自体，无排斥反应，效果持久，但该技术的不足之处是，注射剂中能立即发挥人体软组织的填充和修复功能的胶原蛋白含量较低，导致注射到疤痕和皱纹处后见效较慢，一般要4-6个月；另外，使用动物血清作为培养液的成分也可能存在安全性方面的问题。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种起效快、疗效持久、受术者满意度高的用于皮肤缺损的修复剂。本发明的第二个目的是提供一种用于皮肤缺损的修复剂的制备方法。本发明的第三个目的是提供一种用于皮肤缺损的修复剂的用途。本发明的技术方案概述如下一种用于皮肤缺损的修复剂，所述修复剂是每毫升液体中含1000-5000万个细胞；所述细胞是用新生儿切除的包皮皮肤经体外低血清原代培养和传代扩增后收集到真皮成纤维干细胞、成纤维前体细胞和成纤维细胞，所述液体是将体积比为I : O. 5-2的氨基酸注射液和5%的葡萄糖注射液混合制成。一种用于皮肤缺损的修复剂的制备方法，包括以下步骤(I)采用新生儿切除的包皮皮肤(包括表皮和真皮，例如，1-30平方毫米的皮肤) 在含有生长因子、活性材料和质量浓度为O. 5% 5%的胎牛血清的基础培养液中采用组织块培养法进行原代培养；(而传统培养基通常加入约10%的新生牛血清)，上述培养基对于细胞生长、增殖、形态、活性和功能的影响有所改善；(2)在含有生长因子和活性材料的基础培养液中进行传代扩增；(3)将收集到的真皮成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞中加入体积比为I : 0.5-2的氨基酸注射液和质量浓度为5%的葡萄糖注射液，制成每毫升液体中含 1000-5000万个细胞的用于皮肤缺损的修复剂。
所述生长因子为上皮生长因子和成纤维生长因子；所述上皮生长因子在基础培养液中的含量为1-5纳克/毫升；所述成纤维生长因子在基础培养液中的含量为2-20纳克/晕升。优选的是所述上皮生长因子在基础培养液中的含量为3纳克/毫升；所述成纤维生长因子在基础培养液中的含量为10纳克/晕升。所述活性材料为氢化可的松和肝素；所述氢化可的松在基础培养液中的含量为
O.2-2微克/晕升；所述肝素在基础培养液中的含量为2-20微克/晕升。优选的是所述氢化可的松在基础培养液中的含量为I微克/毫升；所述肝素在基础培养液中的含量为10微克/晕升。上述用于皮肤缺损的修复剂在治疗皮肤缺损中的应用。与现有技术相比，本发明的用于皮肤缺损的修复剂更具有细胞活性、扩增性，在外用部位与自体皮肤组织产生共同作用且不排异，能产生快速填充和修复皮肤缺损的效果； 随后，用于皮肤缺损的修复剂中含有的细胞成分能不断地分泌出胶原蛋白，保持填充和修复的效果，可广泛用于凹陷性疤痕的修复。外用后一周可出现明显的填充和修复效果，且疗效持久，治疗程序简便。
图I是实施例5培养成功的传代真皮成纤维干细胞在100倍光学显微镜下形态学照片；图2是本发明实施例5的一个患者具体治疗凹陷性疤痕前后的对比照片。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明，此说明只是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明进行任何限制。本发明所采用的基础培养液是本领域常用的基础培养液，可以参见《细胞实验指南》(2001年，科学出版社出版，主编D. L.斯佩克特，黄培唐翻译)。实施例I一种用于皮肤缺损的修复剂，所述修复剂是每毫升液体中含3000万个细胞；所述细胞是用新生儿切除的包皮皮肤经体外低血清原代培养和传代扩增后收集到的真皮成纤维干细胞、成纤维前体细胞和成纤维细胞，所述液体是将体积比为I : I的氨基酸注射液和 5%的葡萄糖注射液混合制成。实施例2—种用于皮肤缺损的修复剂，所述修复剂是每毫升液体中含2000万个细胞；所述细胞是用新生儿切除的包皮皮肤经体外低血清原代培养和传代扩增后收集到的真皮成纤维干细胞和成纤维前体细胞，所述液体是将体积比为I : O. 5的氨基酸注射液和5 %的葡萄糖注射液混合制成。实施例3一种用于皮肤缺损的修复剂，所述修复剂是每毫升液体中含1000万个细胞；所述细胞是用新生儿切除的包皮皮肤经体外低血清原代培养和传代扩增后收集到的真皮成纤维干细胞和成纤维细胞，所述液体是将体积比为I : 2的氨基酸注射液和5 %的葡萄糖注射液混合制成。实施例4一种用于皮肤缺损的修复剂，所述修复剂是每毫升液体中含5000万个细胞；所述细胞是用新生儿切除的包皮皮肤经体外低血清原代培养和传代扩增后收集到的成纤维前体细胞，所述液体是将体积比为1:1.5的氨基酸注射液和质量浓度为5%的葡萄糖注射液混合制成。实施例5一种用于皮肤缺损的修复剂的制备方法，包括以下步骤(I)皮肤取材用酒精消毒新生儿切除的包皮；用手术剪刀将表皮和真皮组织取下，放入组织保存液中；(2)皮肤组织培养前处理将皮肤组织块放置于培养皿中清洗，去除皮下组织和脂肪，取20平方毫米的包括表皮和真皮的包皮皮肤剪碎为O. 1-0. 5平方毫米的碎片，平铺于培养皿的底面；(3)在已平铺皮肤碎片的培养皿中加入含有生长因子、活性材料和质量浓度为 3%的胎牛血清的基础培养液中采用组织块培养法进行原代培养，使细胞扩增到80%的培养皿底面；(4)在含有生长因子和活性材料的基础培养液中进行传代扩增，培养4周；(5)将培养的细胞用胰蛋白酶进行消化处理，使其脱离培养皿底面，再使用无外源性蛋白的DMEM清洗3次，去除外源性生长因子和活性物质，再将收集到的真皮成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞，加入体积比为I : I的氨基酸注射液和5%的葡萄糖注射液，制成每毫升液体中含3000万个细胞的用于皮肤缺损的修复剂。在步骤(3)和(4)生长因子为上皮生长因子和成纤维生长因子，上皮生长因子在培养液中的含量为3纳克/晕升；成纤维生长因子在培养液中的含量为10纳克/晕升；活性材料为氢化可的松和肝素；氢化可的松在基础培养液中的含量为I微克/毫升；肝素在基础培养液中的含量为10微克/晕升。实施例6一种用于皮肤缺损的修复剂的制备方法，包括以下步骤(I)皮肤取材用酒精消毒新生儿切除的包皮；用手术剪刀将表皮和真皮组织取下，放入组织保存液中；(2)皮肤组织培养前处理将皮肤组织块放置于培养皿中清洗，去除皮下组织和脂肪，取10平方毫米的包括表皮和真皮的包皮皮肤剪碎为O. 1-0. 5平方毫米的碎片，平铺于培养皿的底面；(3)在已平铺皮肤碎片的培养皿中加入含有生长因子、活性材料和质量浓度为 3%的胎牛血清的基础培养液中采用组织块培养法进行原代培养，使细胞扩增到80%的培养皿底面；(4)在含有生长因子和活性材料的基础培养液中进行传代扩增，培养4周；(5)将培养的细胞用胰蛋白酶进行消化处理，使其脱离培养皿底面，再使用无外源性蛋白的DMEM清洗3次，去除外源性生长因子和活性物质，再将收集到的真皮成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞中加入体积比为I : 0.5的氨基酸注射液和5%的葡萄糖注射液，制成每毫升液体中含2000万个细胞的用于皮肤缺损的修复剂。在步骤(3)和(4)生长因子为上皮生长因子和成纤维生长因子；上皮生长因子在基础培养液中的含量为I纳克/晕升；成纤维生长因子在培养液中的含量为20纳克/晕升;活性材料为氢化可的松和肝素；氢化可的松在基础培养液中的含量为O. 2微克/ 晕升；肝素在基础培养液中的含量为20微克/晕升。实施例7一种用于皮肤缺损的修复剂的制备方法，包括以下步骤(I)皮肤取材用酒精消毒新生儿切除的包皮；用手术剪刀将表皮和真皮组织取下，放入组织保存液中；(2)皮肤组织培养前处理将皮肤组织块放置于培养皿中清洗，去除皮下组织和脂肪，取30平方毫米的包括表皮和真皮的包皮皮肤剪碎为O. 1-0. 5平方毫米的碎片，平铺于培养皿的底面；(3)在已平铺皮肤碎片的培养皿中加入含有上皮生长因子、活性材料和质量浓度为5%的胎牛血清的基础培养液中采用组织块培养法进行原代培养，使细胞扩增到75%的培养皿底面；(4)在含有上皮生长因子、活性材料的基础培养液中进行传代扩增，培养4周；(5)将培养的细胞用胰蛋白酶进行消化处理，使其脱离培养皿底面，再使用无外源性蛋白的DMEM清洗3次，去除外源性生长因子和活性物质，再将收集到的真皮成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞中加入体积比为I : 2的氨基酸注射液和5%的葡萄糖注射液，制成每毫升液体中含1000万个细胞的用于皮肤缺损的修复剂。在步骤(3)和(4)生长因子为上皮生长因子和成纤维生长因子；上皮生长因子在基础培养液中的含量为5纳克/晕升；成纤维生长因子在培养液中的含量为10纳克/晕升;活性材料为氢化可的松和肝素；氢化可的松在基础培养液中的含量为2微克/毫升；肝素在基础培养液中的含量为20微克/晕升。实施例8一种用于皮肤缺损的修复剂的制备方法，包括以下步骤(I)皮肤取材用酒精消毒新生儿切除的包皮；用手术剪刀将表皮和真皮组织取下，放入组织保存液中；(2)皮肤组织培养前处理将皮肤组织块放置于培养皿中清洗，去除皮下组织和脂肪，取10平方毫米的包括表皮和真皮的包皮皮肤剪碎为O. 1-0. 5平方毫米的碎片，平铺于培养皿的底面；(3)在已平铺皮肤碎片的培养皿中加入含有上皮生长因子、活性材料和质量浓度为O. 5%的胎牛血清的基础培养液中采用组织块培养法进行原代培养，使细胞扩增到80% 的培养皿底面；(4)在含有上皮生长因子、活性材料的基础培养液中进行传代扩增，培养4周；(5)将培养的细胞用胰蛋白酶进行消化处理，使其脱离培养皿底面，再使用无外源性蛋白的DMEM清洗3次，去除外源性生长因子和活性物质，再将收集到的真皮成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞中加入体积比为I : I. 5的氨基酸注射液和质量浓度为 5%的葡萄糖注射液，制成每毫升液体中含5000万个细胞的用于皮肤缺损的修复剂。在步骤(3)和(4)生长因子为上皮生长因子和成纤维生长因子；上皮生长因子在基础培养液中的含量为5纳克/晕升；成纤维生长因子在培养液中的含量为2纳克/晕升；活性材料为氢化可的松和肝素；氢化可的松在基础培养液中的含量为2微克/毫升；肝素在基础培养液中的含量为2微克/晕升。实施例9对各实施例1-8中的原料及培养细胞进行病毒检测包皮皮肤组织和培养4周后的细胞进行HIV和肝炎病毒的检验，确定为无病毒细胞。免疫反应测试将培养第4周的细胞制成O. Iml细胞注射液(溶剂体积比为 I I的氨基酸注射液和5%的葡萄糖注射液)对受术者进行皮试(同青霉素皮试方法)， 无免疫反应。成品检测I)外观细胞与血小板注射液为浅黄色混悬液。2)本品中细胞分类检定真皮成纤维干细胞采用Brdu抗体测定(黄晖，赖西南，王正国，王丽丽，“创伤愈合中物质对表皮干细胞迁移及受体表达的作用”；《中华创伤杂志》2004年；20(3) 142-145。 利用核标记物)，产品中有10%的成纤维干细胞。成纤维前体细胞采用细胞形态学方法观察(在100倍光学显微镜下做形态学观察,其标准形态为细小长索状)，产品中有70%的成纤维前体细胞。成纤维细胞采用细胞形态学方法观察(在100倍光学显微镜下做形态学观察，其标准形态为呈多触突的长索形细胞)，产品中有20%的成纤维细胞。3)无菌试验按《中国生物制品规程》(2000版)通则《生物制品无菌试验规程》 A/B项进行，结果符合无菌要求。实施例10治疗用于凹陷性症痕；共32例,米用实施例5-8制备的一种用于皮肤缺损的修复剂进行治疗，每个实施例治疗8例。I.治疗者术前检查(其中男21例，女11例，年龄在16-25岁)，各项指标均正常，包括血尿便常规、心电图、肝肾功能、HIV、HbsAg。2.将耳后部位皮肤用70%的酒精消毒，局部注射1%的利多卡因麻醉，取3*7mm2 的全层皮肤组织，伤口做三针缝合。3.将自体皮肤组织剪碎后与本发明的一种用于皮肤缺损的修复剂混匀后备用。4.将皮肤缺损部位用微晶进行磨削，至出血为止，将步骤3获得的混合物敷在缺损表面，盖上敷料，用胶布固定。5.每天向敷料内注入一种用于皮肤缺损的修复剂lml，一周后去掉敷料，治疗过程完成。术后观察、调护I.观察局部及全身的情况一切正常。
2.每天二次口服维生素C (每次200mg，每天共400mg)，服用6个月。3.术后一个月内防曝晒及慎用刺激性化妆品。效果描述疤痕在敷料去除一个月后，32例病人凹陷性疤痕基本填平，效果良好。 注射前后的效果对比见图2 (实施例5)。
权利要求
1.一种用于皮肤缺损的修复剂，其特征是所述修复剂每毫升液体中含1000-5000万个细胞；所述细胞是用新生儿切除的包皮皮肤经体外低血清原代培养和传代扩增后收集到真皮成纤维干细胞、成纤维前体细胞和成纤维细胞，所述液体是将体积比为I : O. 5-2的氨基酸注射液和5%的葡萄糖注射液混合制成。
2.权利要求I的用于皮肤缺损的修复剂的制备方法，包括以下步骤(1)采用新生儿切除的包皮皮肤在含有生长因子、活性材料和质量浓度为O.5% 5% 的牛血清的基础培养液中采用组织块培养法进行原代培养；(2)在含有生长因子和活性材料的基础培养液中进行传代扩增；(3)将收集到的真皮成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞中的至少一种加入体积比为I : O. 5-2的氨基酸注射液和5%的葡萄糖注射液，制成每毫升液体中含1000-5000 万个细胞的用于皮肤缺损的修复剂。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述生长因子为上皮生长因子和成纤维生长因子；所述上皮生长因子在基础培养液中的含量为1-5纳克/毫升；所述成纤维生长因子在基础培养液中的含量为2-20纳克/晕升。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述上皮生长因子在基础培养液中的含量为3纳克/晕升；所述成纤维生长因子在基础培养液中的含量为10纳克/晕升。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述活性材料为氢化可的松和肝素； 所述氢化可的松在基础培养液中的含量为O. 2-2微克/毫升；所述肝素在基础培养液中的含量为2-20微克/晕升。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述氢化可的松在基础培养液中的含量为I微克/晕升；所述肝素在基础培养液中的含量为10微克/晕升。
7.权利要求I的用于皮肤缺损的修复剂在治疗皮肤缺损中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种用于皮肤缺损的修复剂及其制备方法，用于皮肤缺损的修复剂每毫升液体中含1000-5000万个细胞；所述细胞是用新生儿切除的包皮皮肤经体外低血清原代培养和传代扩增后收集到真皮成纤维干细胞、成纤维前体细胞和成纤维细胞，所述液体是将体积比为1∶0.5-2的氨基酸注射液和5％的葡萄糖注射液混合制成。本发明的优点是用于皮肤缺损的修复剂更具有细胞活性、扩增性，在外用部位与自体皮肤组织产生共同作用且不排异，外用后一周可出现明显的填充和修复效果，且疗效持久，治疗程序简便。
文档编号A61L27/60GK102580165SQ201210088228
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月29日 优先权日2012年3月29日
发明者王继明 申请人:王继明