专利名称：微型核糖核酸作为癌症进展的预测因子及其治疗癌症的应用的制作方法
技术领域：
本发明是关于微型核糖核酸(HiiciX)RNA)作为癌症进展的预测因子及其治疗癌症的应用。
背景技术：
多形性神经胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme,GBM)、第IV级神经胶质瘤为恶性度最高的主要脑部肿瘤，且具有相当不良的预后；尽管结合多种疗法，其平均存活年数仍约为 12 个月(Dehdashti, A. R.，Hegi, Μ. E.，Regli, L.，Pica, A.，and Stupp, R. 2006.Neurosurg Focus 20，E6. ；Stupp, R.，Hegi, Μ. E.，Gilbert，M. R.，and Chakravarti,A. 2007. J Clin Oncol 25，4127-4136.)。为了提高病患的存活，故需要了解GBM的肿瘤形成机制。部分研究指出癌干细胞(cancer stem cell, CSC)的亚细胞群是使癌细胞具抗放 射线性的一个主要因素，并且也与肿瘤发展，以及经传统疗法后的癌症周期性复发有关系。然而，迄今仍无适当的指标(marker)可用以分离癌细胞的该等重要的亚细胞群，根据CSC的肿瘤形成假说，该等亚细胞群在活体内(in vivo)具有重新形成新肿瘤的能力，且与肿瘤复发为恶性神经胶质瘤有关系。微型核糖核酸(miRNAs)为高度保守的小型RNA分子，其可调控基因表达-可做为癌症的标记、致癌基因或肿瘤抑制剂。miRNAs可能可标靶致癌基因、细胞周期调控子及转录因子，并且可调控脑部肿瘤的发展。在脑部肿瘤中，多种miRNAs，包括miR7、miR21、miR26a、miR124、miR137、miR184、及 miRNA 221/222 与 GBM 致病机理有关连。多种 miRNAs可能可作为预后的指标，像是miRlOb及miR26a可为高度的神经胶质瘤作为预后的指标。miRNAs涉及脑部肿瘤发展的许多方面，包括神经胶质瘤恶性化发展。miR125b、miR326、及miR324-5p可于小脑神经性前驱物及肿瘤中作为标记型miRNAs,其有助于预测预后及病患症状。再者，过量表达miR34可降低脑部肿瘤及胰脏癌干细胞(CSCs)的自我更新能力。近来，miR145被发现可调控胚胎干细胞的分化；该单一的miRNA同时地可调控多种干细胞性基因，包括 KLF4、0ct4、及 Sox2(Xu, N. , Papagiannakopoulos, T. , Pan, G. , Thomson, J. A.,and Kosik，K. S. 2009. Celll37，647-658.)。然而，目前对于GBM的复发，以及藉由调控干细胞性(sternness)以调控二次的GBM复发、肿瘤诱发能力、或间充质转化，miRNAs是否在其中扮演该等角色皆尚未明了。miR142是首个被报告具有可用于调控造血作用及T细胞发育的功能的基因(Chen, C. Z. , Li, L. , Lodish, H. F. , and Bartel, D. P. 2004. Science 303,83-86·)。miR142-3p的表达是藉由LM02结合至miR142基因的推测的启动子区域而调控(Yuan，ff. , Sun, ff. , Yang, S. , Du, J. , Zhai, C. L. , Wang, Z. Q. , Zhang, J. , and Zhu, T. H. 2008.Leukemia 22，1067-1071.)。该miR142基因位于t (8 ;17)易位交界处，可能与惰性淋巴瘤发展为急性的B细胞淋巴瘤有关，这可能归因于c-Myc高度地向上调控。Qian等人(2008)发现于老鼠肺脏的支气管肺泡干细胞(bronchioalveolar stem cell, BASCs)的miR142-3p及miR142_5p是向上调控的；异常的miR142表达可能与将BASCs转变为肺癌干细胞有关。近来，Sun 等人(Sun, ff.，Shen.，ff.，Yang, S.，Hu, F.，Li, H.，and Zhu,T. Η. 2010. Cell Res 20,1158-1169.)指出miR-142可用于弱化造血细胞的增生作用，是藉由miR-223-CEBP- β -LM02轴调控。分离自神经胶质瘤或GBM之CSCs具有提高表达的干细胞性基因，该基因像是 Sox2 (Gangemi, R. M. , Griffero, F. , Marubbi, D. , Perera, Μ. , Capra,Μ. C. , Malatesta, P. , Ravetti, G. L. , Zona, G. L. , Daga, A. , and Corte, G. 2009. Stem Cells27,40-48.)。Sox2为高移动性群组的DNA结合蛋白，为神经干细胞的重要指标，并且对维持该神经干细胞处于未分化状态十分重要。相同地，推测Sox2的表达可作为神经胶质瘤及神经管胚细胞瘤，以及维持CSC 干细胞性的指标。重要的是，神经胶质母细胞瘤干细胞具有高度的Sox2表达,且将Sox-2剔弱(knockdown)可进一步抑制致肿瘤性及神经胶质瘤CSCs 的干细胞性(Decarvalho, A. C.，Nelson, K.，Lemke, N.，Lehman, N. L.，Arbab, A. S.，Kalkanis, S. , and Mikkelsen, T. Stem Cells 28,181-190.)。
发明内容
本发明是基于发现miR142-3p的新颖功能,其新颖功能在于miR142_3p可调控Sox2、腺苷酸环化酶9 (adenylyl cyclase 9, AC9)、及CD133的表达，以及进而调控复发性的GBM细胞及CSCs细胞之整体干细胞性，且在复发性GBM细胞中，该miR142_3p可调节其肿瘤诱发特性。本发明进一步提供一种以微型核糖核酸(miRNA)为主的新颖疗法，可用以治疗脑瘤。因此，在一方面，本发明提供一种利用有效量的miR142_3p制备抑制细胞中目标基因表达的医药制剂的应用，其中该目标基因为⑶133、S0X2、或AC9。在一具体实施例中，该miR142-3p直接与目标基因的mRNA的3’端非转译区(3，UTR)连结。在另一具体实施例中，该细胞为复发性多形性神经胶质母细胞瘤(GBM)细胞。在另一方面，本发明提供一种检测个体在治疗后是否具有或具有发展为复发性多形性神经胶质母细胞瘤的风险的套组，其包含miR142-3p反义寡核苷酸及可检测样本中miR142-3p表达量的试剂。在某些具体实施例中，该可检测一样本中miR142_3p表达量的试剂为聚合酶链锁反应(PCR)、突光原位杂交反应、或薄膜上的Northern blot中所使用的反应缓冲液及酵素。在另一具体实施例中，该套组可用于检测下列组织样本的miR142-3p的表达水平(a)患有原发性GBM的个体的对照组样本；及(b)经治疗后，该相同个体的试验组样本，其中(b)试验组样本中miR142-3p的水平低于(a)对照组样本中miR142_3p的水平，代表经治疗后，该个体具有或具有发展为复发性多形性神经胶质母细胞瘤的风险。在一具体实施例中，该个体接受之治疗为外科手术治疗、化学治疗、放射性治疗、或其组合。在另一具体实施例中，该个体为患有第I、II、III、或IV级神经胶质瘤的病患。在另一方面中，本发明提供一种利用医药上有效量的miR142_3p制备治疗多形性神经胶质母细胞瘤的医药制剂的应用。该医药制剂可藉由立体定位装置以投放至肿瘤所在位置。该多形性神经胶质母细胞瘤可为复发性多形性神经胶质母细胞瘤。该miR142-3p可为具有经LNA-及硫代磷酸酯-修饰骨架修饰的微型核糖核酸(microRNA)，其中该修饰的微型核糖核酸可被包埋于微脂体中。在一具体实施例中，本文所用之miR142_3p由核酸所编码。该核酸是位于载体上，其中该载体是选自由质体、黏质体、噬菌质体、及病毒所组成之群组。在另一方面中，本发明提供一种用以产生多形性神经胶质母细胞瘤模式动物的方法，包含(a)准备原发性神经胶质瘤细胞；(b)将miR142-3p反义寡核苷酸导入该原发性神经胶质瘤细胞，以得到miR142_3p缺失的细胞；(c)将该miR142-3p缺失的细胞植入动物中，以得到患有多形性神经胶质母细胞 瘤的动物。在另一方面中，本发明提供一种利用miR142_3p制备用以增加多形性神经胶质母细胞瘤细胞对于放射性疗法敏感性的医药制剂的应用。
为了阐述本发明的目的，将具体实施例以优选方式呈现于图中。但是，本发明并非局限于所展示的优选具体实施例。在图中图I显示miR142_3p作为复发性GBM指标之一反向的预测因子。图2显示低量miR142_3p以及高量Sox2及AC9表达水平的情况，其为复发性GBM及低总存活率的预测指标。图3 显示 miR-142-3p 直接标靶 GBM 细胞中的 Sox2、ADCY9、及 CD1333' UTRs 区域。图4显示miR142_3p弱化GBM细胞的自我新生能力及致肿瘤性。图5显示miR142-3p SPONGE恢复原发性GBM细胞的干细胞性及肿瘤诱发能力。图6显示miR142_3p及Sox2/AC9表达可调控GBM的间充质转化以及原神经(proneuronal)转变。图7显示miR142-3p、SoX2及AC9调控GBM细胞的肿瘤诱发能力及放射线敏感性。图8显示miR142_3p调控复发性GBM细胞的致肿瘤性及放射线的敏感性。图9A和图9B显示对于原发性(N=70)及复发性(N=30)GBM病患的22个miRNAs表达量的定量 RT-PCR 分析，包括在复发性 GBM 中 miR223、miR451、miR181a、miR9、miR142-3p、miR195、miR145、miR181c、miR132、及 miR497 的下降的表达量，其中以 miR142_3p 的 p 值(P=O. 0016)，于原发性(第一次发生)及复发性(第二次发生)GBM之间，最为显著(此处数据显示三次独立试验的平均值土SD的结果)。图10 显示将 Sox2 (A)、AC9 (B)、及 CD 133 (C)的野生型(wild-type, WT)或突变的(mutated，mut) 3’ UTR报信子，与(或不与)对miR142_3p反义的miRNA及SPONGE —起共同转染，其中测量每一个报信子质体的荧光酵素(Iuciferase)活性，其显示无论是突变的3’ UTR、反义的 miR142-3p、或 SP0NGE-miR142-3p 皆可消除 miR142_3p 对于 Sox2、AC9、及CD1333’ UTR 的抑制作用(*p < O. 05)。图11显示Sox2及AC9在GBM细胞的致肿瘤性的探讨。(A、B、C、D)建立pGBM/pLV、pGMB/Sox2、pGBM/AC9、rGBM/shScr、rGBM/shSox2、及 rGBM/shAC9 细胞株，并将之进行软琼脂细胞聚落形成试验(A、B)及聚球形成试验(C、D) ；(E)过量表达的Sox2或AC9可增加pGBM的非贴附性及自我更新的能力，而Sox2或AC9的剔弱则会减少该rGBM的两种能力；该 rGBM/miR142-3p 细胞进一步被用以生成 rGBM/miR142_3p/shSox2+shAC9 及 rGBM/miR142-3p/Sox2+AC9细胞株；并藉由Western blot法分析Sox2及AC9的蛋白量；(F)测量异种移植的肿瘤大小，其中该异种移植肿瘤是源自植入所指细胞的老鼠。Sox2/AC9共同过量表达会增加rGBM/miR142-3p肿瘤的大小(*p < O. 05)。图12显示CD133于GBM细胞中的致肿瘤性的研究(A)pGBM/⑶133细胞株是自病患GBMl及GBM2的细胞衍生而得；并藉由Western blot法评估于每个细胞株之⑶133蛋白表达量；(B、C、D)将pGBM/⑶133、rGBM/sh⑶133及其对照组细胞进行软琼脂聚落形成试验(B)、聚球试验(C)及细胞侵袭 / 转移试验(TransWell invat ion/migration) (D) ;Q)133的存在与否对于两种pGBM细胞株的非贴附性、自我更新以及侵袭/转移能力仅有轻微的影 响；(E)评估经异种移植rGBM/shScr及rGBM/sh⑶133的NOD-SCID小鼠的脑纹状体中肿瘤生长及体积。经观察无显著差异；以及(F)经植入所指细胞的NOD-SCID小鼠的肿瘤体积，于移植后28天测量；其中在rGBM/shScr与rGBM/shCD133肿瘤之间，以及在pGBM/pLV与pGBM/tD133肿瘤之间，皆无显著差异。图13显示自7个GBM病患分离之癌类干细胞的miR142_3p表达情形⑷左图两个个别的GBM细胞株(GBM1及GBM2)的球形体的显微镜影像，其中右图显示7个病患的球形体形成GBMs中的miR142-3p表达量是降低的；(B)左图miR142_3p的内源性表达，是藉由 FISH(突光原位杂交(fluorescent in situ hybridization);箭头代表 miR142_3p有表达；GBM1)测量。右图在7个病患组中，相较于⑶133-GBM细胞，结果显示⑶133阳性(⑶133+)GBM细胞的miR142-3p表达为向下调控的；(C)左图将GBM细胞的侧群细胞(Sidepopulations)分离，并藉由细胞分类器(GBMl)分离。右图7个病患中侧群细胞(SP)为阳性的GBM细胞的降低的miR-142-3p表达。*p < 0. 05。图14显示胚胎干细胞(embryonic stem cell, ESCs)及GBMs中转录体图谱的生物信息分析结果该多维度分析说明了于ESCs、rGBM、具有miR142-3p的rGBM、pGBM、及具有miR142_3p SPONGE 的 pGBM 之间的平均谱是转录体距离(average lineage transcriptomedistance)。图15显示分离自5个病患之pGBM细胞经具有SPONGE的miR142_3p剔弱方法处理后的肿瘤诱发能力的评估；以及分别将50、100、1000、及10000的细胞数量同位(orthotopically)注射入所指的SCID小鼠的脑纹状体中；miR142_3p SPONGE的肿瘤诱发能力，于PGBM细胞中藉由Sox2/AC9双重基因静默被进一步弱化。图16显示Sox2及AC9涉及miR142_3p所调控的间充质转化⑷将、pzGBM/Spg、pGBM/Spg/shSox2+shAC9、rGBM/pLV、rGBM/miR142_3p、及 rGBM/miR142_3p/Sox2+AC9细胞进行qRT-PCR,分析间充质倾向的标记(YKL40、波形蛋白(vementin)、纤维粘连蛋白(fibronectin))的表达情形；(B)伤口愈合移动试验是以所指细胞进行；(C)计算不同组的移动活性，并以相对值呈现于表中;* p < 0. 05, PLV v. s. pLV-miR142/Vector ；# p< O. 05, pLV-miR142/Vector v. s. pLV_miR142/Sox2+AC9。
具体实施例方式为了使本发明目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合各种具体实施例及申请专利范围的详细说明及图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，以使属于本发明领域的具有通常知识者，可基于本文的叙述，并且不需进一步阐述，即可实施本发明，并将其应用至最宽广的范围，而非用以限制本发明。神经胶质母细胞瘤(GBM)为最常见的主要的脑部肿瘤，且其预后通常不佳。此外，在多数病患中，经放射化疗后会在数月内复发。在本发明中，在复发性GBM的miR142-3p表达量较原发性GBM低，且具有同时表达(co-expression)的Sox2和AC9以及被抑制的miR142-3p之GBM病患会导致较差的预后及存活率。藉由标靶Sox2及AC9，MiR142_3p可调控复发性GBM的肿瘤诱发能力及间充质转化。在复发性GBM中增加的miR142-3p可降低 致肿瘤性、间充质转化及抗放射线性；当在原发性GBM中miR142-3p为向下调控时，则会促进肿瘤诱发、抗放射线性及间充质转化，此点可能可用于GBM病患之病症发展及复发的指标。因此，miR142-3p可能涉及CSC重新程序设计改造(reprogramming)的转录网络，以及涉及于脑部肿瘤中调控间充质转化。更重要地，LNA-修饰的miR142-3p寡核苷酸可有效地阻断复发性GBM所衍生的原位异种移植物的肿瘤的生长以及间充质转化特性，以及可协同增强放射疗法的功效。本发明为第一个发现及证明miR142-3p可作为癌症类干细胞特性(cancer stem-1 ikeproperty)及GBM复发的一重要调控因子，并且该miR142_3p可能为一具潜力的临床预后指标，以及一种新颖的以miRNA为基础的GBM疗法。对于miRNAs用于致肿瘤性的应用日趋被重视，越来越多的证据指出miRNAs涉及类CSC特性。例如，异位表达let-7、miR200c、及miR30可抑制乳房的CSCs的致肿瘤性(Shimono, Y. ，Zabala, M. ，Cho, R. ff. ，Lobo, N. ，Dalerba, P. ，Qian, D. ，Diehn, M. ，Liu,H. , Panula, S. P. , Chiao, E. , et al. 2009. Cell 138, 592-603. ；Yu, F. , Deng, H. , Yao,H. , Liu, Q. , Su, F. , and Song, E. 2010. Oncogene 29,4194-4204.)。近来，Iliopoulos 及其同僚报告miR200b可透过直接标靶Suzl2以调控CSC特性，该Suzl2为一多齿梳抑制子复合物(polycomb repressor complex)的次单位(Iliopoulos, D. , Lindahl-Alien,Μ. , Polytarchou, C. , Hirsch, H. A. , Tsichlis, P. N. , and Struhl, K. 2010. Mol Cell 39，761-772.) ο在本发明中，miR142-3p可直接标靶Sox2、AC9、及CD1333' UTRs，以及藉由抑制复发性GBM细胞的Sox2及AC9表达来压抑其干细胞性及致肿瘤性。更重要地，将miR142-3p表达剔弱，可明显地活化GBM-CSC自我更新能力，以及抑制多能性基因的表达。再者，本人证实SP0NGE-miR142-3p可在活体内(in vivo)增加原发性GBM的肿瘤诱发能力约10至10000倍(图5H及图15)。此证据支持了于GBM中向下调控miR142_3p表达时，会导致类干细胞特性，此即给予GBM细胞诱发及重新生成新肿瘤的能力。再者，已知Sox2于调控神经胶质瘤干细胞的肿瘤诱发能力上扮演一重要角色。过量表达Sox2会促进神经管胚细胞瘤肿瘤诱发细胞生成，以及与神经管胚细胞瘤病患存活率呈现负相关性(Sutter，R.，Shakhova, 0. , Bhagat, H. ,Behesti, H. , Sutter,C. ,Penkar, S. ,Santuccione, A. ,Bernays,R.，Heppner, F. L.，Schuller, U.，et al. 2010. Oncogene 29,1845-1856.)。数据进一步证实同时剔弱(co-knockdowm)Sox2及AC9，而没有剔弱⑶133，会抑制GBM细胞的肿瘤诱发能力及抗放射线性，此点可藉由miR142-3p之向下调控诱发(图4、图7及图15)。11^1 142-3 可负调控干细胞性基因之表达，而降低miR142-3p表达会促进CSC相关的自我更新及抗放射线性。进一步探讨miR142_3p所调控的GBM或GBM-CSC的去分化作用(de-differentiation)或重新程序设计改造，将可更深入了解miR142-3p在GBM发展上所扮演的角色。癌干细胞(CSCs)已于尤文氏肉瘤(Ewing sarcoma)家族性肿瘤中被发现,其仍保有间充质干细胞(MSC)的可塑性；EWS-FLI-1及miRNA-145是以相互抑制的回馈循环方式互动、辨识其共同标靶基因Sox2，并接着诱发MSC重新程序设计改造以转变成尤文氏肉瘤CSCs (Riggi, N. , Suva, M. L. , De Vito, C. , Provero, P. , Stehle, J. C. , Baumer, Κ. , Cironi,L. , Janiszewska, Μ. , Petricevic, T. , Suva, D. , et al. Genes Dev 24,916-932.)。在自我新生之人类胚胎干细胞中miR145表达为低的，且内源性miR145会抑制多能性因子0ot4、Sox2、及 Klf4 之 3' UTRs (Xu, N. , Papagiannakopoulos, T. , P·an, G. , Thomson, J. A. , andKosik，K. S. 2009. Cell 137，647-658.)。近来，完整的基因体分析显示异常的基因表达会决定GBM之典型、间充质型及原神经的类型，且进一步发现神经胶质瘤特异性的调控网络，其中涉及一转录模块，其可活化恶性神经胶质瘤的间充质基因表达。因此，miRNAs可能调控脑肿瘤及GBM-CSCs的自我新生及间充质特性。此资料证实，miR142-3p表达与GBM的发展为负相关性，且将原神经型GBM细胞的内源性miR142-3p静默可诱导该等细胞重新程序设计改造以转变为间充质型态或GBM的CSCs。再者，同时表达Sox2及AC9亦可调控GBM之间充质特性。于复发性M型GBM细胞中，同时消除Sox2及AC9则会促进间充质性特征性改变为原神经性的外表型，而当Sox2及AC9同时过量表达于原发性GBM细胞时，将重新程序设计改造原神经性的外表型转变为间充质的特征性。因此，miR142-3p可能为Sox2及AC9之上游调控因子，以调控间充质及原神经性的转变。此外，高度GBM的分子指标包括葡萄糖作为主要神经元细胞能量的来源，以及IDHl基因之突变(Zhao，S.，Lin, Y.，Xu, ff.，Jiang, ff.，Zha, Z. , Wang, P. , Yu, ff. , Li, Z. , Gong, L. , Peng, Y. , et al. 2009. Science 324, 261-265.)。既然cAMP可调控丙酮酸盐脱氢酵素(Pyruvate dehydrogenase), cAMP可能可调控糖解路径以及改变脑部之葡萄糖依赖性。cAMP的生成以及糖解代谢路径的改变是否与IDHl所调控的TCA循环阻断相互作用仍属未知。然而，cAMP及IDHl皆涉及糖解路径，且cAMP为二级讯息传递者。因此，若能发现GBM的AC9受器，将可有助于找到新颖的GBM疗法。⑶133，一 5-穿膜糖蛋白，为造血干细胞及内皮前驱物的指标，且可能涉及血管新生作用。⑶133表达已被推测可作为神经胶质瘤的肿瘤再生长、恶性发展、及肿瘤状况的予页后指标(Zeppernick, F. , Ahmadi, R. , Campos, B. , Dictus, C. , HeImke, B. Μ. , Becker,N. , Lichter, P. , Unterberg, A. , Radlwimmer, B. , and Herold-Mende, C. C. 2008. ClinCancer Res 14，123-129.)。近来由Pallini等人所提出的存活率报告(Pal I ini, R.,Ricci-Vitiani, L. , Montano, N. , Mollinari, C. , Biffoni, Μ. , Cenci, Τ. , Pierconti, F.,Martini, Μ.，De Maria, R.，and Larocca, L. Μ. 2010. Cancer.)，提出相较于原发性 GBM 的⑶133阳性细胞百分比，复发性GBM的⑶133阳性细胞百分比增加4. 6倍，而增加⑶133的表达与肿瘤复发后之较长的存活率有明显的相关性。于本研究中，免疫组织化学分析显示，相较于原发性GBM，复发性GBM的CD133阳性细胞的百分比明显的增加。然而存活率分析显示，CD133表达量与GBM的存活率并无明显相关性(图2)。值得注意的是，于原神经型GBM的⑶133cDNA过量表达或于间充质型GBM以siRNA静默的⑶133，于活体外(in vitro)及活体内(in vivo)并不会影响间充质的外表型表达或致肿瘤能力。值得注意的是，相较于⑶133+GBM细胞，⑶133—细胞被发现于神经球诱发效率及细胞聚落生成性上具有相似的CSC特性，以及部分PTEN缺乏的GBM肿瘤被发现可产生自我新生的肿瘤诱发⑶133+及⑶133_细胞型态(Chen, R. , Nishimura, M. C. , Bumbaca, S. Μ. , Kharbanda, S. , Forrest, ff. F. , Kasman,I. Μ. , Greve, J. Μ. , Soriano, R. H. , Gilmour, L. L. , Rivers, C. S. , et al. 2010. Cancer Cell17，362-375.)。因此，进一步亟需探讨以判定⑶133表面抗原或⑶133相关的路径是否参与类干细胞特性的调控，以及CD133是否可做为预测GBM病患存活率的指标或神经胶质瘤CSCs的治疗目标。总结，miR142-3p可调控GBM的肿瘤诱发特性及间充质转化能力。升高的miR142-3p表达会降低癌症类干细胞特性及干细胞性；抑制miR142_3p会增加GBM的致肿瘤特性。因此,miR142-3p可能为治疗脑部肿瘤的一种新颖的治疗实施例。
试验方法细胞培养、自GBM组织中分离初代细胞以及试剂所有取得组织的程序皆依照赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki),并且经台北荣民总医院科学研究与伦理审查委员会评估后才进行。简言之，将GBM组织手术摘除后，以含有HBSS之葡萄糖冲洗该组织三次，接着将样本以300mm厚度进行切片，并将切好的组织浸泡于含有葡萄糖及HBSS的0. I % (w/w)的胶原蛋白酶中，于37°C作用15分钟，并用摇晃震荡机以125rpm速度进行震荡培养。将GBM初代培养及GBM细胞株培养于含有10%胎牛血清的MEM(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)中，且向MEM中添加ImM丙酮酸钠、非必需胺基酸、2mM L-谷胺酸、lOOunits/mL青霉素、及100 μ g/mL链霉素，并于标准培养环境下进行培养(37°C、95%潮湿空气、5% C02)。富集癌症类干细胞及分离⑶133阳性细胞所有取得组织之程序皆依照赫尔辛基宣言，且经台北荣民总医院科学研究与伦理审查委员会评估后始进行。简言之，将头颈部之癌组织以手术摘除，并以含有HBSS之葡萄糖冲洗该组织三次，接着将样本以300mm之厚度进行切片，并将切好的组织浸泡于含有葡萄糖及HBSS之0. I % (w/w)之胶原蛋白酶中，于37°C作用15分钟，并用摇晃震荡机以125rpm速度进行震荡培养。接着将经胶原蛋白酶消化后之细胞，以IOOxg之速度进行离心10分钟，并将该等细胞重新悬浮于癌症干细胞富集培养基中以培养GBM细胞，其中该富集培养基为添加有无血清DMEM/F12 (GIBCO)培养基、N2补充物(R&D)、10ng/mL人类重组的bFGF (R&D)及 10ng/ml EGF 之 DMEM/F12 培养基。为了分离CD133阳性细胞，其分离步骤如下所示将自GBM病患的肿瘤样本所分离的细胞以ImL⑶133/1的微磁珠/106细胞进行标记，其是使用⑶133细胞分离套组(MACS，Miltenyi Biotec)。将CD133+细胞培养于添加有N2补充物(R&D)、10ng/mL人类重组的bFGF (R&D)及 10ng/ml EGF 的无血清 DMEM/F12 (GIBCO)培养基。供细胞存活分析的放射线疗法以 Theratronic cobalt unit T-1000 (Theratronic International, Inc.,渥太华，加拿大)传送伽玛放射线(游离辐射；IR)，剂量为I. lGy/min(SSD = 57. 5cm)。将对照组之细胞及IR组的细胞暴露在不同剂量下(0、2、4、6、8、及10Gy)。经10天培养后，将细胞聚落(每个细胞聚落超过50个细胞)固定，并以结晶紫及甲醇溶液进行染色20分钟。以细胞聚落形成试验分析细胞存活率。培养效率(Plating efficiency, PE)及存活部分是以下式计算=PE =(细胞聚落数目/接种细胞数目)X100%;SF =计算而得的细胞聚落数目/ (接种细胞数目X (PE/100))。肿瘤球形成分析分离肿瘤细胞，并于2 X IO6活细胞/75cm2角瓶中，培养于添加有N2补充物(R&D)、10ng/mL表皮生长因子(EGF, Invitrogen)、10ng/mL碱性纤维母细胞生长因子(bFGF,Invitrogen)、及青霉素/链霉素的改良的DMEM/F-12,使成为肿瘤球。经14天后,计算肿瘤球数目。定量RT-PCR根据制造商的操作手册(Invitrogen),自细胞或组织中以Trizol试剂制备全部的RNA。用于qRT-PCRs的mRNAs以Superscript III第一股合成是统进行反转录后，以进行 RT-PCR(Invitrogen)。将所得之 cDNAs 于 ABI 7900HT (Applied Biosystems)进行 qRT-PCR反应。所用到之引物序列分列于表I中(SEQ ID N0S. 1-24)。表I用于定量RT-PCR的引物序列
基因引物序列产物大小 Tm
(登录号)_(5，至 3,)_(bp) (0C)
ADCY9F:GCTTCTTTCTGTTTACCTTCACCAA(SEQ ID NO. I)223 55
(NM_001116) R:ATAGAGCAAAAAGAGCACTTCGATG (SEQ ID NO. 2)
CD133F: CGTGATTTTTTACTACCTGGGCTTA(SEQ ID NO. 3)7755
(NM_006017) R: AGCCTCGGGTGGTCGG (SEQ ID NO. 4)
CHI3L1 (YKL40) F: CTCTGCATACAAACTGGTCTGCTAC (SEQ ID NO. 5)111 55
(NM_001276) R: TAGATGATGTGGGTACAGAGGAAGC (SEQ ID NO. 6)
纤维$占连蛋 0 F: ACCTGAGTCCCGGCCTGGAGTA(SEQ ID NO. 7)151 55
(NM_212482) R CTCAGGCCGATGCTTGAATCGGT (SEQ ID NO. 8)
GFAPF: ATCGCCACCTACAGGAAGCT (SEQ ID NO. 9)160 55
(NM_002055) R: GCATCTCCACGGTCTTCACC. (SEQ ID NO. 10)
KLF-4F: CCGCTCCATTACCAAGAGCT (SEQ ID NO. 11)7660
(NM_004235) R: ATCGTCTTCCCCTCTTTGGC (SEQ ID NO. 12)
MAP2F: GTCAGGGTCCCACAGCGTGC (SEQ ID NO. 13)114 55
(NM—002374) R: GCCTGGGCTTCAGCTGCCTC (SEQ ID NO. 14)
NanogF: ATTCAGGACAGCCCTGATTCTTC (SEQ ID NO. 15)7660
(NM_024865) R TTTTTGCGACACTCTTCTCTGC (SEQ ID NO. 16)
神经巢蛋白 F: AGGAGGAGTTGGGTTCTG(SEQIDNO. 17)112 55
(NM_006617) R GG A GT GG A GT CT GG A A GG (SEQ TD NO. 18)
Oct-4F: GTGGAGAGCAACTCCGATG (SEQ ID NO. 19)8660
(NM—002701) R TGCTCCAGCTTCTCCTTCTC (SEQ ID NO. 20)
Sox2F: CGAGTGGAAACTTTTGTC.GGA(SEQ ID NO. 21)7455
(NM_003106) R: TGTGCAGCGCTCGCAG (SEQ ID NO. 22)
波形 蛋白 F: GCAATCTTTCAGACAGGATGTTGAC (SEQ ID NO. 23)118 55
(NM_003380) R GATTTCCTCTTCGTGGAGTTTCTTC (SEQ ID NO. 24)对于miRNAs，使用TaqMan miRNA试验及特异性引物对进行qRT-PCR。所有试剂及试验方法皆来自Applied Biosystems，且以7900HT快速实时PCR是统进行侦测。所使用的引物对皆列于表2 (SEQ ID N0S. 1-24)
质体构建所有的质体皆被评估验证及定序过。S0X2、ADCY9、及CD133 UTRs是以PCR扩增，并将之构建于pMIR-REPORT载体(AppliedBiosystems)上。并藉由Sox2(SEQ IDNOS. 25-29)、ADCY9 (SEQ ID NOS. 30-35)、及 CD133 3' UTRs 之引物组(SEQ ID NOS. 36-41)生成各种序列缺失的构建体(表3)。藉由PCR及具有校正功能的Taq以扩增各种不同的S0X2、ADCY9、及CD133 3' UTR区域。藉由引物对将额外的限制酶切位(Mlul/Hindlll或Spel/Pmel)引入；再以MluI/HindIII或Spel/Pmel将扩增区域酶切后，将之再构建于pMIR-荧光酵素报信子质体上。至于miR142-3p sponge的寡核苷酸，miR142_3p反义及不规则的(scramble)构建已列于表3 (SEQ IDN0S. 42-52)。如同Gangemi et al.，2009所述方式，将寡核苷酸黏合后将之接合至BL0CK-iT Pol II miR RNAi表达表达载体上。标靶人类S0X2序列之寡核苷酸序列皆已设计于Invitrogen网站上。选定其中一个寡核苷酸,将之如同Gangemi et al.,2009所述的方式构建入BL0CK-iT Pol II miRRNAi表达载体。构建用引物对(SEQ ID N0S. 42-52)皆列于表3。该pcDNA 6. 2-Gff/EmGFP-miR-neg对照组质体含有一插入子，其可形成发夹结 构，可修饰成成熟的miRNA，但其被设计为不会标靶任何已知脊椎动物基因。无5’突出端(overhang)的负对照组序列列于表3。所有构建方法皆按照制造商的操作手册执行。流式细胞仪根据制造商的操作方式进行细胞标记，以含有藻红蛋白(MiltenyiBiotech.,Auburn, CA, USA)的抗 CD133 抗体将细胞染色。以 FACSCalibur (Becton Dickinson)及CellQuest软件测量受蓝色(488nm)激发光照射的10，000的细胞的红色(> 650nm)荧光发射光。于细胞分选试验中，将细胞标记并以FACSAria(BD Biosciences)进行分选。miR142-3p Angomir及微脂体媒介的运输方式以如同miR142-3p的序列合成带有修饰的miR142-3p RNA寡核苷酸。将硫代磷酸酯骨架修饰为磷酸二酯骨架，且将核糖以锁核酸(lock-nucleic-acid，LNA)核糖取代之。miR142-3p angomir的运送是的藉由微脂体为主的核酸运输方法所调控。简言之，将miR142-3p溶解于D5W(5%葡萄糖水)中，并以特定的脂质成分包埋入微脂体中。将包好的微脂体(miR142-3p angomir之最终浓度为IOng/ μ L)送入颉内异种移植的肿瘤诱发细胞的相同位置。miRNA北方墨点法以miVana miRNA 分离套组(Ambion)或 Trizol (Invitrogen)将 microRNAs 萃取出来。将50ng之分离的小型RNAs，置入每一个孔中进行电泳，其中该电泳是于含有7M尿素之15%聚丙烯酰胺凝胶的O. 5X TBE中进行。经电泳后，藉由半干式转移机将小型RNAs转移至Hybond-N+膜上，并藉由UV交联机进行交联。以miVana探针及标记套组合成RNA标记(decade marker),并藉由相同套组将对于miR142_3p特异性的LNA-RNA寡核苷酸(SEQ ID NO. 52)(表3)进行标记，以引入5’端的放射性标记。将膜片先进行前杂交(prehybridized)，再以杂交缓冲液进行杂交处理24小时，再以冲洗缓冲液进行冲洗三次。杂交讯号曝露于X光片48小时。荧光原位杂交(FISH)将细胞于室温下固定于含4%三聚甲醛之PBS中15分钟，接着以含有O. 1%NP-40及O. 1% X-IOOTriton的PBS将细胞进行通透化。经以10%驴血清，于室温封闭(blocking) 2小时后，将LNA修饰的，及FITC共轭结合的miR142-3p反义寡核苷酸(SEQ IDNO. 52)置入杂交缓冲液中，于42°C作用整夜，接着以5X SSPE及2X SSPE清洗。染色影像是以 Olympus 影像是统(Silahtaroglu, A. N.，Nolting, D.，Dyrskjot, L，Berezikov, E.，Moller, M.，Tommerup，N.，and Kauppinen，S. 2007. Nat Protoc 2，2520-2528.)拍摄。寡核苷酸序列(SEQ ID NO. 52)列于表2。表2
权利要求
1.一种利用有效量的miR142-3p制备抑制细胞中目标基因表达的医药制剂的应用，其特征在于，该目标基因为CD133、S0X2、*AC9。
2.如权利要求I所述的应用，其特征在于，该miR142-3p直接与目标基因的mRNA的3’端非转译区(3，UTR)连结。
3.如权利要求I所述的应用，其特征在于，该细胞为复发性多形性神经胶质母细胞瘤(GBM)细胞。
4.一种检测个体于治疗后是否具有或具有发展为复发性多形性神经胶质母细胞瘤的风险的套组，其特征在于，包含miR142-3p反义寡核苷酸及可检测样本中miR142_3p表达量的试剂。
5.如权利要求4所述的套组，其特征在于，该可检测样本中miR142-3p表达量的试剂为聚合酶链锁反应(PCR)、突光原位杂交反应或薄膜上的南方墨点法所使用的反应缓冲液及酵素。
6.如权利要求4所述的套组，其特征在于，用于检测下列样本的miR142-3p的表达水平 (a)患有原发性GBM的个体的对照组样本；以及 (b)经治疗后,该相同个体的试验组样本， 其中(b)试验组样本中miR142-3p的水平低于(a)对照组样本中miR142_3p的水平，代表经治疗后，该个体具有或具有发展为复发性多形性神经胶质母细胞瘤的风险。
7.如权利要求4-6任一项权利要求所述的套组，其特征在于，该个体接受的治疗为外科手术治疗、化学治疗、放射性治疗、或其组合。
8.如权利要求4-6任一项权利要求所述的套组，其特征在于，miR142-3p水平的降低为预后不佳的指标。
9.如权利要求4-6任一项权利要求所述的套组，其特征在于，该个体为患有第I、II、III、或IV级神经胶质瘤的病患。
10.一种治疗患有多形性神经胶质母细胞瘤的个体的医药制剂的应用，其特征在于，该医药制剂是利用医药上有效量的miR142-3p制备。
11.如权利要求10项所述的应用，其特征在于，该医药制剂通过立体定位装置投与至肿瘤所在位置。
12.如权利要求10项所述的应用，其特征在于，该多形性神经胶质母细胞瘤为复发性多形性神经胶质母细胞瘤。
13.如权利要求10项所述的应用，其特征在于，该miR142-3p由核酸所编码。
14.如权利要求13项所述的应用，其特征在于，该核酸位于选自由质体、黏质体、噬菌质体、或病毒所组成的群组的载体上。
15.如权利要求10项所述的应用，其特征在于，该miR142-3p为具有经LNA-及硫代磷酸酯-修饰骨架修饰的微型核糖核酸(microRNA)。
16.如权利要求15项所述的应用，其特征在于，该修饰的微型核糖核酸被包埋于微脂体中。
17.一种用以生产多形性神经胶质母细胞瘤模式动物的方法，其特征在于，包含 (a)准备原发性神经胶质瘤细胞；(b)将miR142-3p反义寡核苷酸导入该原发性神经胶质瘤细胞，以得到miR142_3p缺失的细胞； (c)将该miR142-3p缺失的细胞植入动物中，以得到患有多形性神经胶质母细胞瘤的动物。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，该动物为老鼠。
19.如权利要求17所述的方法，其特征在于，植入动物的miR142-3p缺失的细胞数目为I 1000个。
20.如权利要求17所述的方法，其特征在于，植入动物的miR142-3p缺失的细胞数目为50个。
21.一种用以增加多形性神经胶质母细胞瘤细胞对于放射性疗法敏感性的医药制剂的应用，其特征在于，该医药制剂是利用miR142-3p制备。
22.如权利要求21所述的应用，其特征在于，该医药制剂通过立体定位装置投放至肿瘤所在位置。
23.如权利要求21所述的应用，其特征在于，该miR142-3p由核酸所编码。
24.如权利要求23所述的应用，其特征在于，该核酸位于载体上；其中该载体选自由质体、黏质体、噬菌质体及病毒所组成的群组。
25.如权利要求21所述的应用，其特征在于，该miR142-3p为具有经LNA-及硫代磷酸酯-修饰骨架修饰的微型核糖核酸(microRNA)。
26.如权利要求25所述的应用，其特征在于，该修饰的微型核糖核酸被包埋于微脂体中。
全文摘要
本发明涉及一种微型核糖核酸作为癌症进展的预测因子及其治疗癌症的应用。本发明基于所发现的miR142-3p的新颖功能，其新颖功能在于miR142-3p可调控Sox2、腺苷酸环化酶9(adenylyl cyclase 9，AC9)、及CD133的表达，以及进而调控复发性的GBM细胞及CSCs细胞的整体干细胞性(stemness)，并且在复发性GBM细胞中，该miR142-3p可调节其肿瘤诱发特性。本发明进一步提供一种以微型核糖核酸(miRNA)为主的新颖疗法，可用以治疗脑瘤。
文档编号A61P35/00GK102813940SQ20121008820
公开日2012年12月12日 申请日期2012年3月29日 优先权日2011年3月29日
发明者邱士华, 邱光裕 申请人:台北荣民总医院