专利名称：一种抗皮肤鳞状细胞癌药物antagomir-365-2的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种抗皮肤鳞状细胞癌药物antagomir-365-2。
背景技术：
皮肤癌作为白色人种中常见的恶性肿瘤之一，其发病率在白人中超过其他所有恶性肿瘤的总和，而近年来其发病率在我国出现了逐年上升的趋势并且呈现年轻化。根据最初的关于限制消耗臭氧物质的国际协议预测，到2100年，欧洲的西北地区和美国皮肤癌发 病率可能会增加一倍，2060年将导致一个10%的增长高峰。目前，对皮肤癌的临床治疗仍以手术、放疗、激光等综合治疗为主，在已经对后基因组计划进行研究的今天，皮肤癌的致病基因已经较成功的在分子水平上得到了确认，但是如何找到肿瘤的靶向治疗基因，并对其进行基因治疗仍是一大难题。近年来，在小分子RNA中新发现了一类与调节基因表达密切相关的小分子非编码单链RNA即微小RNA (microRNAs, miRNAs)。随着研究的深入，越来越多的miRNA被发现，它不仅参与细胞分化成熟障碍、增殖失控，而且与细胞永生化为本质的肿瘤疾病密切相关，人类肿瘤细胞和肿瘤组织内miRNA的表达水平和类型都与正常细胞和组织明显不同，并且已经发现的人类miRNA大部分(52%)都位于已知的肿瘤相关基因组区域内或已知的基因脆性位点。最近的证据表明，miRNA突变或者异位表达与多种人类癌症相关，miRNAs可以起到肿瘤抑制基因或者癌基因的功能。在人类基因组序列中，我们发现miR-365是UVB敏感的miRNA，是引起皮肤癌的一个重要的环境因素。miR-365为一种成熟的miRNA,它由两种前体pre-miR-365-l和pre-miR-365-2剪切而来。但是经RT-qPCR在皮肤癌细胞中检测发现成熟miR-365来自前体pre-miR-365-2。antagomir是经过特殊化学修饰的miRNA拮抗剂,通过与体内的成熟miRNA强竞争性结合，阻止miRNA与其靶基因mRNA的互补配对，抑制miRNA发挥作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗皮肤鳞状细胞癌药物antagomir-365-2。本发明所采取的技术方案为
一种抗皮肤鳞状细胞癌药物antagomir-365-2,所述antagomir-365-2是一种经化学修饰的反义寡核苷酸，其核苷酸序列为5’-AUUACGGGGAUUUUUAGGAAUA-3’ (SEQ ID N0:1),序列的5’末端连续2个碱基以及3’末端连续4个碱基经硫代磷酸修饰，3’末端经胆固醇标记，全部碱基经甲基化修饰。优选的，所述antagomir-365-2 分子量为 8828. 2。上述的antagomir-365-2在制备治疗皮肤鳞状细胞癌药物中的应用。本发明设计合成的antagomir-365-2可以有效抑制体内成熟体miR-365功能。本发明设计合成的antagomir-365-2经过特殊的化学修饰连接，能直接进入细胞内，故在细胞实验中不需要转染试剂，从而避免了转染试剂包装过程的复杂步骤及其对实验的影响。本发明的antagomir-365-2可直接涂覆于患处，其可克服细胞膜、组织等障碍富集于靶细胞，故在动物实验中可局部直接给药，作用效果持续时间可长达6周，稳定性效果好。本发明的有益效果是
本发明的抗皮肤鳞状细胞癌药物antagomir-365-2可以克服细胞膜、组织等障碍富集于靶细胞，直接进入体外培养以及体内成瘤的细胞内，进行体外和体内治疗皮肤鳞状细胞癌，在体外能有效地抑制肿瘤细胞的侵袭和转移，在体内能有效抑制肿瘤的生长和消除瘤块。本发明的antagomir-365-2对抗皮肤鳞状细胞癌效果显著，有望成为皮肤癌基因治疗的药物。
图I 是 antagomir-365-2 的结构图；图2是antagomir-365-2的质谱 图3是antagomir-365-2的体外抑制肿瘤增殖结果；
图4是antagomir-365-2的体外抑制肿瘤侵袭结果；
图5是antagomir-365-2的体外抑制肿瘤迁移结果；
图6是antagomir-365-2体内抑制肿瘤生长和消除肿块结果 图7是antagomir-365-2促进肿瘤凋亡的TUNEL荧光图。
具体实施例方式—种抗皮肤鳞状细胞癌药物antagomir-365-2的设计及克隆 antagomir-365-2的核苷酸序列(SEQ ID NO: I)可以人工合成也可以克隆得到。其中，
克隆方法以miR-365单链相反序列为模板，PCR扩增得到该片段。克隆中所用的技术方法皆为分子生物学通用的分子克隆技术方法。antagomir-365-2的核苷酸序列的修饰及鉴定核苷酸序列(SEQ ID NO: I)的全部碱基甲基化修饰，5’末端连续2个碱基以及3’末端连续4个碱基硫代磷酸修饰，以及3’末端胆固醇连接。antagomir-365-2的组成见图I所示，由图也可知，antagomir-365-2的核苷酸序列全链经2’ -甲氧基修饰，3’ -末端的AAUA4个碱基和5’ -末端AU2个碱基硫代磷酸修饰，3’末端胆固醇连接。采用人工合成的核苷酸序列进行以上修饰，得到的antagomir-365-2采用液相质谱(LC-MS)鉴定，得到的质谱图见图2，由图2可知antagomir-365-2分子量为8828. 2。下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限如此。实施例中所述培养基均为DMEM培养基，所述完全培养基均为含10%新生牛血清和双抗的DMHM。实施例I
本实施例涉及本发明的基因片段抑制皮肤鳞状细胞癌细胞增殖、侵袭和迁移实验。以下各实验分组(I)阴性对照组；(2) antagomir-365-2干预组；二组实验均使用皮肤鳞状细胞癌细胞系A431，干预后分别检测肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移实验。采用平板克隆形成实验检测皮肤鳞状细胞癌增殖能力收集对数生长且状态良好的A431细胞，用D-Hanks液洗3次，O. 25% (w/v)胰酶消化，细胞悬液反复吹打，使细胞充分分散，将细胞浓度调整为(I 2) X106/mL，接种到12孔培养板中，每孔加入IOOPL细胞悬液，轻轻晃动培养板，使细胞分散均匀，37°C、5%C02培养箱中培养2周。当细胞长到30 50%密度时，吸去完全培养基，antagomir-365-2干预组每孔加入125 μ L浓度为20 ηΜ的antagomir-365-2 (其溶剂为去除核酸酶的去离子水)，并加入无双抗的完全培养基混合至ImL,同时阴性对照组仅加入ImL的无双抗的完全培养基。出现肉眼可见的细胞克隆时，终止培养，弃去培养液，D-Hanks液洗2次后，空气干燥，苏木素染色15min，流水缓慢洗去染液，空气干燥后显微镜下计数形成的克隆数(> 50个细胞为一个克隆)。平板克隆形成率=形成克隆数/接种细胞数X 100%。实验重复三次。实验结果采用平板克隆形成实验法对直接在培养基中加入antagomir-365-2后对皮肤鳞状细胞癌细胞系A431体外增殖能力的改变进行检测，结果见图3，由图可知，阴性对照组、antagomir-365-2干预组的体外增殖能力具有显著性差异(F=30. 077，Ρ〈0· 001)，双侧t检验之后发现，与阴性对照(Ρ=0· 000)相比，加入antagomir-365-2的皮肤鳞状细胞癌细胞系的增殖速度显著减慢。该实验结果表明antagomir-365-2显著抑制了皮肤鳞状细胞癌细胞的体外增殖。Boyden小室皮肤鳞状细胞癌侵袭实验
实验用的Boyden小室购自美国chemicon公司，该小室是利用ECMatrixTM,即利用EHS (Engel breth Holm-Swarm)肿瘤组织成分重新构建的人工基底膜,评价肿瘤细胞的侵袭能力，小室孔径为8. O Mm0实验前将Boyden小室从冰箱中取出，置于培养箱中，使之温度恢复到37°C。在内室中加300 μ L无血清培养基，置于培养箱中孵育I 2h，使ECMatrix层亲水。胰酶消化后制成单细胞悬液，无血清培养基洗涤细胞2次后，细胞计数，调整细胞浓度为(O. 5 I. O) X 106/mL。小心吸出内室中培养基后，加300 μ L细胞悬液于内室，其中antagomir-365-2干预组中加入了 25μ1浓度为20ηΜ的antagomir-365-2,阴性对照组不加任何药物，然后各组分别加500 μ L完全培养基于下室，37°C培养18h。取出小室，用棉签轻轻擦掉未穿过膜的细胞，然后将小室浸入结晶紫染液中染色20min，用蒸馏水轻轻地冲洗数次，空气中风干。显微镜下随机选取5个高倍视野计数穿过ECMatrix膜的细胞数。实验重复二次。实验结果采用Boyden小室方法分析,在培养基中加入antagomir-365-2药物干预后对皮肤鳞状细胞癌细胞系A431体外侵袭能力的变化，结果见图4，可见在肿瘤细胞侵袭18h后，二组细胞均穿透基底膜向下侵袭。统计学分析结果显示，二组细胞侵袭能力的差异具有显著性(F=Ill. 709，P〈 O. 001)，双侧t检验比较之后发现，实验组和阴性对照(P=O. 000)相比，直接在培养基中加入antagomir-365-2的皮肤鳞状细胞癌细胞系A431穿过基底膜的细胞数显著减少，说明其显著抑制了皮肤癌鳞状细胞系体外侵袭。Transwell小室皮肤鳞状细胞癌运动迁移实验
实验用Transwell小室购自美国Corning公司，小室内的膜材料为聚碳酸酯(polycarbonate, PC),小室孔径为8. OMm。生长状态良好的培养细胞,胰酶消化后制成单细胞悬液，无血清培养基洗涤细胞2次后，细胞计数，调整细胞浓度为(I 2) X 106/mL。加100 μ L Α431细胞悬液于内室，其中antagomir-365-2干预组加入10μ1浓度为20ηΜ的antagomir-365-2,阴性对照组不加任何药物,然后各组分别加500 μ L完全培养基于下室，37°C培养18h。取出小室，用棉签轻轻擦掉未穿过膜的细胞，然后苏木素复染15min，用蒸馏水轻轻地冲洗数次，空气中风干显微镜下随机选取5个高倍视野计数穿过膜的细胞数。实
验重复三次。采用Transwell小室的方法检测加入antagomir-365-2药物干预后对皮肤鳞状细胞癌细胞系A431体外迁移运动能力的变化，结果见图5，由图可知，二组细胞运动能力的差异具有显著性(F=41. 732，P〈0. 001)。双侧t检验比较之后发现，实验组与阴性对照(P=O. 000)相比，在培养基中加入antagomir-365-2的皮肤鳞状细胞癌细胞系穿过膜的细胞数显著减少，说明其显著抑制了皮肤癌鳞状细胞系运动迁移。实施例2
本实施例涉及瘤体内直接注射antagomir-365-2抑制肿瘤的生长和消除瘤块实验。皮肤鳞状细胞癌动物模型的建立收集皮肤鳞状细胞癌细胞系A431细胞(2X108个)，注射BALB/c裸鼠右背部皮下；4 5天长出瘤块，并计算其瘤块大小。(瘤块大小(mm3)=DXd2X π /6 (D为瘤块最长的直径长，d为瘤块最短的直径长)。实验分组(I)阴性对照组；(2) antagomir-365-2干预组。实验动物建模<57814果鼠右背部皮下注射八431细胞，每只裸鼠注射2\108细胞，约5天后成瘤。实验干预组antagomir-365-2干预措施当裸鼠瘤块长到150 mm3,在瘤体内多位点注射antagomir-365-2，每次注射剂量O. 2mg/kg小鼠体重，每周注射3次。每次注射时用100 μ LPBS溶解。阴性对照组注射等量PBS溶液。观察瘤块大小变化。肿瘤细胞的凋亡检测
取肿瘤组织石蜡包埋，TUNEL荧光检测凋亡二甲苯脱蜡2次，每次10分钟；依次经100%，95%，85%，75%，50% (体积)乙醇和纯水各I次，每次5分钟；4%浓度甲醛溶液室温固定 15分钟；PBS洗涤2次，每次5分钟；20 μ g/ml Proteinase K室温孵育15分钟；PBS洗涤5分钟；4%浓度甲醛溶液室温固定5分钟；PBS溶液室温洗涤2次，每次5分钟；加100 μ IEquilibration Buffer室温平衡10分钟；加入50 μ I TdT工作液37°C湿盒避光孵育60分钟；2 X SSC溶液洗涤15分钟；PBS溶液室温洗涤3次，每次5分钟；DAPI染液室温湿盒避光孵育10分钟；去离子水室温洗涤3次，每次5分钟；荧光抗淬灭剂封片(避光，4°C保存)；荧光显微镜镜检。TdT工作液(荧光标记)配制Equilibration buffer 45 μ I ；Nucleotidemix 5 μ I ；rTdT Enzyme I μ I。实验结果所有裸鼠在A431细胞诱导后，肿瘤大小在第10天后达到150mm3以上，然后在瘤体内多点注射antagomir-365-2药物。干预21天后，肿瘤生长情况显示实验组裸鼠皮下肿块大小显著性低于对照组瘤块大小约500_3，有的裸鼠皮下瘤块甚至完全消除(P < O. 001)。具体可见图6中，左图为阴性对照组与注射antagomir-365-2组21天后的肿瘤大小比较，右图为21天后两组裸鼠典型照片。肿瘤细胞凋亡检测结果见图7，凋亡细胞呈现核发出绿色荧光，由图可知，注射antagomir-365-2药物治疗的小鼠凋亡状况明显高于阴性对照组。以上结果表明在瘤体内直接注射antagomir-365-2能够促进肿瘤细胞凋亡，具有良好的抗皮肤鳞状细胞癌的作用。
权利要求
1.一种抗皮肤鳞状细胞癌药物antagomir-365-2,所述antagomir-365-2是一种经化学修饰的反义寡核苷酸，其核苷酸序列为5’ -AUUACGGGGAUUUUUAGGAAUA-3’ (SEQ IDN0:1)，序列的5’末端连续2个碱基以及3’末端连续4个碱基经硫代磷酸修饰，3’末端经胆固醇标记，全部碱基经甲基化修饰。
2.根据权利要求I所述的一种抗皮肤鳞状细胞癌药物antagomir-365-2,其特征在于所述 antagomir-365-2 分子量为 8828. 2。
3.权利要求I所述的antagomir-365-2在制备治疗皮肤鳞状细胞癌药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种抗皮肤鳞状细胞癌药物antagomir-365-2，所述antagomir-365-2是一种经化学修饰的反义寡核苷酸，其核苷酸序列见SEQIDNO:1，序列的5'端连续2个碱基以及3'端连续4个碱基经硫代磷酸修饰，3'末端经胆固醇标记，全部碱基经甲基化修饰。本发明的抗皮肤鳞状细胞癌药物antagomir-365-2可以克服细胞膜、组织等障碍富集于靶细胞，能直接进入体外培养的细胞以及体内成瘤的组织中，是进行体外和体内治疗皮肤鳞状细胞癌实验的理想药物，在体外能有效地抑制肿瘤细胞的侵袭和转移，在体内能有效抑制肿瘤的生长和消除瘤块。本发明的antagomir-365-2对抗皮肤鳞状细胞癌效果显著，是皮肤癌治疗的靶基因药物。
文档编号A61K31/7115GK102755651SQ20121021995
公开日2012年10月31日 申请日期2012年6月28日 优先权日2012年6月28日
发明者丁振华, 周美娟, 柳维林, 欧程山, 郑莉 申请人:南方医科大学