基于雌马酚激活BK_Ca通道的应用的制作方法

专利名称：基于雌马酚激活BK_Ca通道的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于K+通道刺激技术领域，涉及基于雌马酚激活BKca通道的应用。
背景技术：
K+通道在维持动脉平滑肌细胞膜电位中起重要作用，并调节着血管张力。根据门控特性的不同，血管平滑肌的K+通道至少可分为4种，即电压门控性K+通道(voltage-gated K+ channel, Kv 通道)、内向整流 K+通道(inward rectifier K+ channel,Kir通道)、ATP敏感性K+通道(ATP-sensitive K+ channel, Katp通道)和钙激活的K+通道(Ca2+-activated K+ channel, Kca 通道)。根据单通道电导大小和药理学特性的差异，Kca通道又可分为三个亚类大电导钙·激活的 K+通道(big conductance Ca2+_activated K+ channels, BKca 通道)、中电导I丐激活的 K+通道(intermediate conductance Ca2+-activated K+channels, IKca 通道)及小电导隹丐激活的 K+通道(small conductance Ca2+_activated K+ channels, SKca 通道)。收缩表型的血管平滑肌主要表达BKca通道，该通道由四个孔形成亚单位a和调节亚单位P I共同组成跨膜蛋白复合体。P I亚单位影响通道的Ca2+/电压敏感性、对药理学调节剂的反应以及通道向质膜的运输。血管BKca通道激活引起平滑肌细胞膜电位超极化，关闭电压依赖性Ca2+通道，导致血管扩张，从而对抗压力和血管收缩剂引起的血管收缩。更为重要的是，BKea通道呈现组织和功能异质性。在脑动脉平滑肌细胞，BKea通道电流密度、对雌激素(作用于P I亚单位)的敏感性、^ I亚单位在mRNA和蛋白水平的表达以及P I与a亚单位蛋白的比值均明显高于骨骼肌等外周小动脉平滑肌细胞。提示P I亚单位可能在脑血管BKca通道的调节中意义更为重要。因此，BKca通道的开放剂，尤其是选择性激活BKca通道3 I亚单位的药物对脑血管具有更强的选择性扩张作用。Iberiotoxin (IbTX)能特异性地阻断BKea通道,而Paxilline (PAX)也是较特异的BKea通道阻断剂。大豆黄素(daidzin)是存在于大豆中的异黄酮类化合物，用于防治心脑血管疾病、骨质疏松症及更年期综合征等。近年发现，大豆黄素的代谢产物雌马酚(equol)具有更高的生物活性，大豆黄素的生物学作用在一定程度上可能归因于其代谢产物雌马酚。然而，人群中能代谢大豆黄素为雌马酚者约为309^50%。因此，人体能否将大豆黄素代谢为雌马酚是决定大豆黄素能否更有效地发挥其药理作用的关键。雌马酚具有抗氧化、抑制心肌钙超载、影响血管反应性、抗肿瘤、防治更年期综合症和骨质疏松等作用。现代药理学研究活性成分的药理作用通常采用三类模型，一类是整体动物模型，另一类是离体器官模型，还有一类是细胞模型。前者主要用于药效学观察，后两者主要用于探索药物作用机制。整体动物模型是现代生物医学研究中极其重要的实验方法和手段，主要用于实验生理学、实验病理学和实验治疗学，尤其是新药筛选研究。通过整体动物模型的研究，可以有意识地改变那些自然条件下不可能或不容易排除的因素，以便更加准确地观察模型的实验结果，并将研究结果推及于人类疾病，从而有助于更方便、更有效地认识人类疾病的发生、发展规律和研究防治措施。线栓法制备的大鼠大脑中动脉阻塞(middle cerebralartery occlusion, MCAO)再灌注模型因很好的模拟了临床大脑中动脉阻塞溶栓治疗的状况，是目前最常用的研究抗脑缺血再灌注损伤药物的动物模型。血压测量是医学动物实验中掌握实验对象生命活动的常用手段之一。最准确、可靠的测量方法是大动脉插管直接测量，但该方法需要实施麻醉，创伤大，对实验技术和条件均要求较高。无创血压测量法可以测量清醒动物，能够获取正常状态下的血压值，在基础实验研究中，常采用尾套测压法测量清醒大鼠的血压，该方法操作简便、无创、可重复。整体动物模型的微循环观察是研究微循环血流动力学最基本、最重要的方法，可以定量检测组织血流量、血流速度等动态功能指标。其中激光多普勒血流仪(LaserDoppler Flowmetry, LDF)以其适应范围广、操作简便、无创得到了广泛应用。离体器官模型为药理研究中重要而简便的方法。通过观察活性成分对特定离体组 织器官的作用，可以分析活性成分的药理作用和可能的作用原理。其中，离体血管环实验是筛选血管活性物质和研究其作用机制的常用模型，而选择不同部位的血管还可以直接观察化合物的组织选择性。研究结果明确，并且可以进行定量分析。将人不同离子通道功能亚单位(a亚单位)或辅助亚单位(如^亚单位等)分别或共转染于J1EK293细胞，经克隆筛选可建立稳定表达某种离子通道的细胞系。应用膜片钳结合分子生物学技术可在体外研究该通道的特性、调节因素，并可用于筛选选择性作用于通道不同亚单位的化合物及确定药物对通道作用的结合位点。这是目前进行高通量药物筛选和研究药物作用机制的常用细胞模型。

发明内容
本发明解决的问题在于提供基于雌马酚激活BKca通道P I亚单位的应用，通过多种方法验证了雌马酚通过激活BKea通道3 I亚单位，可扩张血管、增加脑血流量、保护缺血再灌注脑组织，有益于缺血性脑卒中的防治，可用于相关药物的制备。本发明是通过以下技术方案来实现雌马酚在制备保护脑缺血再灌注损伤的药物的应用。雌马酚在制备增加脑血流量的药物的应用。所述的增加脑血流量的药物为不影响血压的药物。雌马酚在制备舒张血管的药物的应用。所述的药物为舒张脑血管的药物。雌马酚在制备激活BKea通道的药物的应用。所述的药物为激活BKea通道的P I亚单位的药物。雌马酚在制备防治缺血性脑卒中的药物的应用。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果本发明提供的基于雌马酚激活BKea通道的应用，是在采用大鼠局灶性脑缺血再灌注模型、尾套法测量大鼠血压、激光多普勒血流仪观测脑实质和软脑膜血流量及离体血管肌张力描记和膜片钳技术的基础上对雌马酚药用活性的检测，结果表明，雌马酚具有以下作用
I、雌马酚对脑缺血再灌注损伤具有保护作用；2、雌马酚在治疗剂量对血压无影响，不会因降低血压而减少脑血流量；3、雌马酚可明显增加脑血流量；4、雌马酚有明显的舒张血管作用，且对脑血管选择性更强，血管舒张作用与激活血管平滑肌BKea通道有关；5、雌马酚对BKea通道的激活依赖于@ I亚单位的存在；这表明雌马酚通过激活血管平滑肌BKca通道3 I亚单位，舒张脑血管、增加脑血流、保护缺血再灌注脑组织，有益于缺血性脑卒中的防治，可用于相关药物的制备。


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图1-1为雌马酚对脑缺血再灌注大鼠脑梗死容积的影响；图1-2为雌马酚对脑缺血再灌注大鼠神经症状评分的影响；图1-3为雌马酚对脑缺血再灌注大鼠死亡率的影响；图1-4为雌马酚对脑缺血再灌注大鼠血清LDH活力的影响；图1-5为雌马酚对脑缺血再灌注大鼠血清MDA含量的影响；图2-1为雌马酚对大鼠血压的影响；图3-1为雌马酚对大鼠脑血流量的影响；图4-1为雌马酚对5-HT诱导的大鼠去内血管的舒张作用；图4-2为Paxilline对雌马酚血管舒张作用的影响；图4-3为Iberiotoxin对雌马酌■血管舒张作用的影响；图5-1为雌马酚浓度依赖性激活重组人BKca通道(Slo a / P )电流；图5-2为雌马酚对重组人BKca通道a亚单位(Slo)电流无激活作用。
具体实施例方式本发明分别采用大鼠局灶性脑缺血再灌注模型、尾套法测量大鼠血压、激光多普勒血流仪观测脑实质和软脑膜血流量及离体血管肌张力描记和膜片钳技术，对雌马酚的抗脑缺血作用进行验证说明，结果表明雌马酚通过激活BKca通道P I亚单位，扩张血管、增加脑血流量、保护缺血再灌注脑组织，可应用相关药物的制备。下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。一、雌马酚对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用I.材料I. I仪器GPS型双极电凝器(上海医用激光仪器厂)，电热三用水箱(SHHW21. 420，天津泰斯特仪器有限公司)，YP3001电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)，TDZ4-WS低速台式离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)，4-0单丝尼龙线(美国ETHIC0N公司)。I. 2药品雌马酚(南京莱茵医药科技有限公司)；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(上海化学试剂公司)。乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)I. 3动物健康雄性SD大鼠，体重220_250g，由西安交通大学实验动物中心提供。2.方法
2. I动物分组与给药将体重220_250g的健康雄性SD大鼠随机分为6组，分别为假手术组(Sham)、模型组(Vehicle)和雌马酹 5. 0mg/kg、2. 5mg/kg>I. 25mg/kg、0. 625mg/kg 组。各给药组连续灌胃给药3天，I次/日，第4日手术前30min再灌胃给药I次。模型组和假手术组大鼠灌胃给予等容积的赋形剂。2. 2大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型的建立按照Longa等人的线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。大鼠用10%水合三氯乙醛经腹腔注射(4ml/kg)麻醉后，仰位固定于鼠板上，酒精消毒颈部皮肤，沿颈部正中做切口，暴露左侧颈总动脉(commom carotid artery, CCA)和迷走神经。小心分离颈总动脉和迷走神经，然后钝性分离颈内动脉(internal carotid artery, ICA)和颈外动脉(externalcarotid artery, ECA)。在ECA下穿两根线备用,用双极电凝器将ICA、ECA小分支电凝,结扎ECA远心端备用，在CCA和ICA上用无损伤动脉夹阻断血流。在ECA近心端剪一小口，将一端为杵状的4-0单丝尼龙线插入小口，缓缓送入，取下ICA上的动脉夹，线栓自ECA经CCA·分叉处插入ICA，将尼龙线缓缓推入大脑中动脉，稍遇阻力即止，自颈内、外动脉分叉处算起线栓插入约17mm 22_。此时左侧大脑中动脉的血供来源被完全阻断,记录下时间为脑缺血开始时间。取下CCA上的动脉夹，消毒，缝合伤口。在缺血2h后拔出线栓行再灌注。假手术组仅将尼龙线栓放入ECA，不进入ICA，模拟脑缺血再灌，手术过程应无出血，呼吸节律正常，手术时间控制在30min内。术后记录各组大鼠死亡情况，计算死亡率。2. 3神经行为症状评分大鼠左侧MCAO 2h再灌注4h后进行神经行为症状评分，采用10分法进行行为缺陷评分，评分标准如下①提鼠尾观察前肢屈曲情况，双前肢对称伸向地面0分，手术对侧(右)前肢轻度屈曲I分，前肢中度或严重屈曲2分；②提鼠尾观察躯干扭曲情况，无扭曲0分，轻度扭曲I分，中度或严重扭曲2分将大鼠置于平地上，分别推双肩向对侧移动检查阻力，如双侧阻力对等且有力0分，如向手术对侧推动时阻力轻度下降者I分，重度下降2分；④将大鼠双前肢置于一金属网上，观察双前肢张力，对等有力0分，对侧前肢张力下降I分将大鼠置于水平地面，观察其运动情况，运动正常0分，自发运动减少I分，给予刺激才运动2分，对刺激无反应3分。满分10分，分数越高，行为障碍越严重。2. 4脑梗死范围测定及血清LDH活力和MDA含量测定大鼠脑缺血24h后，用水合三氯乙醛经腹腔注射麻醉，仰位固定于鼠板上，打开腹腔，暴露腹主动脉，用无菌注射器从腹主动脉采血，转移至一次性试管静置，待血液凝固后800rpm离心lOmin，收集析出的血清，保存至_80°C低温冰箱，随后检测血清中LDH活力及MDA的含量。取血后迅速断头取出大脑，将其置于_20°C的冰箱内约lOmin，之后取出连续冠状切片，每片脑片厚约2mm，共6片，置于2%TTC溶液中37°C水浴箱中孵育30min，然后取出用PBS冲洗3次，再用4%多聚甲醛溶液固定6h。梗死的脑组织染色后呈白色，正常脑组织染色后呈红色。脑片用数码照相机拍照，用图像处理软件Adobe photoshop分析，计算连续冠状切片的脑组织的梗死容积百分比。2. 5数据处理统计分析用SPSS 13. 0软件,数据以mean土SE表示,用SigmaplotlO. 0软件做统计图。脑组织梗死容积百分比的组间比较采用非参数检验，神经行为症状评分、血清LDH活力和MDA含量组间比较采用one-way ANOVA检验，死亡率组间比较采用X2检验。P〈0. 05和P〈0. 01为差异具有显著性，分别以和“**”表示。3.结果3. I雌马酚对脑缺血再灌注大鼠脑梗死容积的影响由图1-1 可见(n=8，*P < 0. 05，**P < 0. 01 vs. Vehicle)，与 Vehicle 组比较，当给予大鼠0. 625mg/kg 2. 5mg/kg的雌马酹时,脑缺血再灌注大鼠脑梗死容积随剂量增加而减小(P〈0. 05或P〈0. 01)，而剂量增至5mg/kg时，作用反而 减弱。表明雌马酚在一定剂量范围对脑缺血再灌注损伤有保护作用。3. 2雌马酚对脑缺血再灌注大鼠神经症状评分的影响大鼠左侧MCA02h再灌注4h时，雌马酚对脑缺血再灌注大鼠神经症状评分的影响的检测结果如图1-2 (n=10,**P < 0.01 vs. Vehicle)所示，Vehicle组神经症状严重，应用不同剂量雌马酚后，可明显减轻脑局部缺血再灌注损伤引起的神经症状(P〈0. 01)，说明雌马酚能改善脑缺血再灌注引起的神经功能障碍。3. 3雌马酚对脑缺血再灌注大鼠死亡率的影响如图1-3所示(*P < 0. 05 vs. Vehicle，图中数字为动物数)，与Vehicle组比较，给予不同剂量的雌马酚均有降低脑缺血再灌注动物死亡率的趋势，其中2. 5mg/kg剂量组的作用有显著性差异(P〈0. 05)。3. 4雌马酚对脑缺血再灌注大鼠血清LDH活力的影响由图1-4 可见(n=10, mP < 0. Olvs. Sham, **P < 0. 01 vs. Vehicle),与 Sham 组相比，Vehicle组和各给药组动物血清中LDH的活力均升高(P〈0. 01 )，提示缺血再灌注引起神经细胞膜等损伤，细胞内LDH释放入血。与Vehicle组比较，给予不同剂量的雌马酚均能降低脑缺血再灌注动物血清中LDH的活力，以2. 5mg/kg和I. 25mg/kg剂量组的血清LDH活力降低较明显(P〈0. 01 )，这进一步从血液生化角度表明了雌马酚抗脑缺血再灌注损伤的效果。3. 5雌马酚对脑缺血再灌注大鼠血清MDA含量的影响如图1-5 所示(n=8，##P < 0. Olvs. Sham *P < 0. 05, **P < 0. 01 vs. Vehicle)，与Sham组相比，Vehicle组和各给药组动物血清中MDA的含量均升高(P〈0. 01 )，这符合脑缺血再灌注损伤以脂质过氧化为标志的特征。给予不同剂量的雌马酚均能降低脑缺血再灌注动物血清中的MDA含量，以2. 5mg/kg和I. 25mg/kg剂量组的血清MDA含量降低较明显(P〈0. 01或P〈0. 05)，表明雌马酚能抑制脑组织脂质过氧化反应，保护脑缺血再灌注损伤。上述检测结果表明雌马酚对脑缺血再灌注损伤具有保护作用。二、雌马酚对大鼠血压的影响I.材料I. I仪器BP-6动物无创血压采集处理系统，TM_WAVE动物无创血压测试软件，BP-6动物无创血压测试箱，大鼠鼠笼均购自成都泰盟科技有限公司I. 2药品雌马酚购自南京莱茵医药科技有限公司。I. 3动物健康雄性SD大鼠，体重220_250g，由西安交通大学实验动物中心提供。2.方法2. I动物分组与给药
体重220_250g的健康雄性SD大鼠，依次测量血压后随机分为3组，分别为雌马酚给药2. 5mg/kg、l. 25mg/kg、0. 625mg/kg。连续灌胃给药4天，I次/日，于末次给药后30min再次测量血压。2. 2血压的测量将大鼠放入鼠笼中，露出鼠尾，将其穿过加压尾套并尽可能固定在鼠尾根部。随后将大鼠放入血压测试箱中(温度设定在37°C )。打开TM_WAVE软件，观察显示窗口的脉搏波形是否稳定。待动物安静并出现稳定的脉搏波形时，开始测量血压。先给尾套充气加压，脉搏波逐渐减小，当脉搏波消失时停止充气，开始放气。当尾套压力等于收缩压时脉搏波开始出现，此点的血压值即为鼠尾血压值。重复测量3次，取其平均值。2. 3数据处理数据测量采用TM_WAVE软件，统计分析用SPSS 13. 0软件，数据以mean±SE表示， 用Sigmaplot 10. 0软件做统计图。给药前后比较采用独立样本t检验，P〈0. 05和P〈0. 01为差异具有显著性，分别以和“**”表示。3.结果检测结果如图2-1所示(n=8)，雌马酚3个剂量组给药前后的血压无明显变化。说明雌马酹在0. 625mg/kg^2. 5mg/kg剂量范围对血压无影响。三、雌马酚对大鼠脑血流量的影响I.材料I. I仪器大鼠立体定位仪(日本Narishige, SN-2N);激光多普勒血流测定仪(瑞典Perimed, PF5001 )、激光针式探头(瑞典 Perimed, probe-407)> PSff 软件(瑞典 Perimed)I. 2药品雌马酚购自南京莱茵医药科技有限公司。I. 3动物健康雄性SD大鼠，体重220_250g，由西安交通大学实验动物中心提供。2.方法2. I脑血流量测定大鼠腹腔注射10%水合三氯乙醒(4ml/kg)麻醉,将头部固定在大鼠立体定位仪上，剪开头部皮肤及皮下组织，暴露颅骨，在大脑顶叶顶端钻孔、开窗(大小以能放置针式探头即可)，并小心去除硬脑膜。使用激光多普勒血流测定仪观测脑血流约20min，若血流值一直较稳定，则开始腹腔注射给药。药物剂量分为2. 5mg/kg、I. 25mg/kg和0. 625mg/kg三组，给药后观察脑血流量的变化。观察时间约2-3h，以脑血流量稳定至给药前水平为止。2. 2数据处理统计分析用SPSS 13. 0软件,数据以mean土SE表示,用Sigmaplot 10. 0软件做统计图，给药前后比较采用one-way ANOVA检验。P〈0. 05和P〈0. 01为差异具有显著性，分别以和“**”表示。3.结果检测结果见图3-1 (n=6, **P < 0. 01 vs. Vehicle), 2. 5mg/kg、I. 25mg/kg 两个剂量组的脑血流量与给药前相比明显增加(P〈0. 01)，0. 625mg/kg组的脑血流量与给药前相比无明显改变。结果表明中、大剂量的雌马酚可显著增加脑血流量。四、雌马酚对大鼠脑基底动脉及肠系膜动脉的舒张作用I.材料
I. I仪器血管张力测定仪(丹麦DMTA/S公司，610M);SHB_3循环水多用真空泵(郑州杜普仪器厂)；解剖显微镜(日本Olympus公司，SZ1145) ;pH计(瑞士 MEITLER TOLEDO公司，DELTA 320);电子分析天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司，BSA124S);供氧装置；显微外科手术器械；可调微量加样器(美国Eppendoff公司)；小型注射器。I. 2药品5-轻色胺(5-HT)购自Sigma公司，溶于蒸懼水中；Paxilline (PAX)和Iberiotoxin (IbTX)购自Sigma公司，雌马酚购自南京莱茵医药科技有限公司，以上三药均溶于二甲亚砜中；所有药物分别配成适当浓度分装保存于_20°C，应用时稀释成所需浓度。I. 3动物健康雄性SD大鼠，体重220-250g，由西安交通大学实验动物中心提供。2.方法2. I营养液配制Krebs-Henseleit 液(KH 液)
权利要求
1.雌马酚在制备保护脑缺血再灌注损伤的药物的应用。
2.雌马酚在制备增加脑血流量的药物的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的药物是激活BKea通道的药物。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的药物为不影响血压的药物。
5.雌马酚在制备舒张血管的药物的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的药物是激活BKea通道的药物。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的药物为舒张脑血管的药物。
8.雌马酚在制备激活BKea通道的药物的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的药物为激活BKea通道的￠1亚单位的药物。
10.雌马酚在制备防治缺血性脑卒中的药物的应用。
全文摘要
本发明公开了基于雌马酚激活BKCa通道的应用，在采用大鼠局灶性脑缺血再灌注模型、尾套法测量大鼠血压、激光多普勒血流仪观测脑实质和软脑膜血流量及离体血管肌张力描记和膜片钳技术的基础上对雌马酚药用活性的检测，结果表明雌马酚通过激活BKCa通道β1亚单位，扩张血管、增加脑血流量、保护缺血再灌注脑组织，有益于缺血性脑卒中的防治，可用于相关药物的制备。
文档编号A61K31/353GK102784135SQ20121023164
公开日2012年11月21日 申请日期2012年7月5日 优先权日2012年7月5日
发明者于玮, 王燕, 邓秀玲 申请人:西安交通大学