专利名称：表达猪捷申病毒8型vp1蛋白的重组腺病毒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种含有猪捷申病毒8型VPl基因序列的重组腺病毒以及该重组腺病毒在预防或治疗猪捷申病中的应用，属于猪捷申病的防治领域。
背景技术：
猪捷申病(teschen diseaes)最初发现于捷克的捷申地区，是一种急性的致死性猪传染性疾病，能引起严重的中枢神经系统紊乱，又命名为猪捷申病毒脑脊髓炎(teschovirus encephalomyelitis),该病是由Teschen毒株感染引起，属于猪捷申病毒(Porcine teschovirus, PTV) I型。1956年英国威尔士出现了另一种形式的脑脊髓灰质炎疾病，引起猪的神经症状较轻，属于温和型脑脊髓灰质炎，命名为塔尔凡病(talfandisease)，该病是由Talfan毒株感染引起，也属于PTV-1。随后在北美洲、澳大利亚、非洲以及亚洲等地区相继分离到了 PTV的其他血清型毒株，而且引起的症状呈现多样性神经系 统紊乱、繁殖障碍、肺炎、鼻炎、腹泻、心包炎和心肌炎以及皮肤损伤等。目前在我国主要和猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)和猪圆环病毒II型(PCV2)混合感染较多，主要引起高热病、流产、仔猪死亡以及腹泻、肠炎等。PTV基因组为单股线状正链RNA，只含有一个大的开放阅读框，编码翻译合成一个大的多聚蛋白，最终形成4种结构蛋白和7种非结构蛋白。PTV的衣壳蛋白由VPl、VP2、VP3、VP44种蛋白粒子构成，它们可以保护病毒RNA不被环境中的RNA酶降解；识别宿主细胞编码的位于细胞膜上的病毒受体；决定病毒宿主范围；决定感染的组织特异性。这4种结构蛋白分别由262、279、242、74个氨基酸组成。其中VP4蛋白最小，埋于病毒粒子内部，与病毒基因组RNA相连。VPl、VP2、VP3蛋白位于病毒粒子的表面，连同VP4蛋白首先形成衣壳蛋白亚单位，进而形成五聚体，最后由12个五聚体形成完整的病毒衣壳。这些结构蛋白的性质决定了病毒粒子的物理性状及抗原性等。VPl蛋白空间结构中含有8个β片层结构和2个α螺旋结构，位于壳粒表面的环形结构与β片层相连，羧基端位于壳粒的外侧，氨基端位于内侧，这些末端与其他蛋白末端结合，使病毒衣壳更加稳定。PTV-8jilin/2003株的VPl蛋白由792个核苷酸编码264个氨基酸组成，VPl蛋白含有病毒主要的抗原位点和中和位点，主要决定病毒的抗原性。2007年Kaku等通过单克隆抗体预测了 PTV衣壳蛋白结构，其中VPl蛋白的C末端突起结构、G-H环以及VP2突起结构决定了 PTV抗原性，是主要的抗原表位，能够刺激机体产生中和抗体，同时还参与了细胞表面受体的识别和结合。目前针对本病没有有效的治疗药物，只能以预防为主，同时采取综合性措施，防止易感猪群被PTV感染。在该病暴发初期，主要是采取患病猪或人工感染猪的组织脏器制成悬液，以氢氧化铝为佐剂制成的组织灭活苗。该疫苗在东欧地区应用后大大降低了该病的病死率，证明其具有良好的保护力，在该病的防治中发挥了重要作用，目前国内还没有针对PTV的疫苗。猪捷申病毒脑脊髓炎已很少发生，而且有些国家早已扑灭了该病，对PTV的研究已处于停滞状态，但不能排除在猪群中呈隐性感染的PTV毒株在长期的自然选择和变异的过程中出现毒力增强，重新暴发大流行的可能性，所以必须提高警惕，做好猪捷申病的防治工作。由于弱毒苗存在安全性问题，灭活苗诱导免疫反应慢，近年来基因工程活载体疫苗开始得到广泛研究和应用。其中腺病毒作为活载体已广泛被用于疫苗研制，腺病毒作为载体有以下优点基因组稳定，易于用重组DNA技术操作；安全性较好，腺病毒无需整合进宿主细胞基因组中；插入大片段外源性基因的潜力大；宿主范围广，可感染分裂细胞和非分裂细胞；容易将外源基因直接导入靶细胞，并有效表达活性蛋白；外源基因表达水平较高。王先炜等构建了含PCV2 Cap基因的重组腺病毒，免疫小鼠后经中和试验、间接ELISA和Western blot鉴定，能产生针对PCV2的抗体，可以作为预防PCV2感染的候选疫苗。孙元等将猪瘟病毒E2蛋白基因插入到腺病毒载体中，成功包装出能高效表达E2蛋白的重组腺病毒，通过在兔子和猪体上进行免疫和攻毒试验，结果表明免疫重组腺病毒后能抵抗猪瘟强毒的攻击。因此，以腺病毒为载体的基因工程活载体疫苗能诱导有效的免疫反应。
发明内容
本发明目的之一是提供猪捷申病毒8型VPl (PTV-8VP1)蛋白的氨基酸序列及编 码其的核苷酸序列；本发明的目的之二在于提供一种含有PTV-8VP1基因序列的表达载体；本发明目的之三是提供一种含有上述表达载体的宿主细胞；本发明目的之四是提供一种含有PTV-8VP1基因序列的重组腺病毒；本发明目的之五是提供所述的猪捷申病毒8型VPl (PTV-8VP1)蛋白及其表达载体在在制备诊断、预防或治疗猪捷申病药物中的用途。本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的本发明首先根据PTV-8 jilin/2003株VPl基因序列设计一对引物，RT-PCR扩增出含有792个核苷酸的全长VPl基因，核苷酸序列见序列表SEQ ID NO. I所示。由其编码猪捷申病毒8型VPl蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。由于密码子的简并性，本发明所述的核苷酸序列也包括任何能够编码SEQ IDNO. 2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。含有SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列或能够编码SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的核苷酸序列的表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞也包括在本发明的保护范围之中；其中，所述的表达载体可以是穿梭载体或者是腺病毒表达载体等；本发明还提供了所述的猪捷申病毒8型VPl蛋白在制备诊断、预防或治疗猪捷申病药物中的用途。进一步的，本发明还提供了一种制备表达猪捷申病毒8型VPl蛋白的重组腺病毒的方法，包括将SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列克隆到pShuttIe-CMV中，获得pS-VPl ；pS-VPl经线性化后电转化至携带有腺病毒骨架质粒的大肠杆菌中，并在细菌内同源重组获得含有VPl基因的重组腺病毒表达载体pAdv-VPl。将pAdv-VPl线性化后，转染293细胞，即可获得表达VPl蛋白的重组腺病毒。更进一步的，本发明还提供了一种表达猪捷申病毒8型VPl蛋白的重组腺病毒，其特征在于含有上述SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列，所述的重组腺病毒命名为rAdv-VPl，分类命名为表达猪捷申病毒8型VPl蛋白的重组腺病毒，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为=CGMCC NO. 6340，保藏日期为2012年7月6日。本发明得到的重组腺病毒rAdv-VPl经IFA和Western blot证明rAdv-VPl成功表达了 VPl蛋白，所表达蛋白的氨基酸序列为序列表SEQ ID NO. 2所示。将rAdv-VPl在293细胞上连续传代，获得高滴度的表达VPl基因的重组腺病毒。将本发明rAdv-VPl以肌肉注射途径免疫3周龄仔猪，可诱导猪体产生特异的体液免疫和细胞免疫应答，表明本发明的rAdv-VPl可应用于制备诊断、预防或治疗猪捷申病药物。本发明的详细描述目的基因的获得根据PTV_8jili/2003株VPl基因序列，利用01igo6和Primerf. O引物分析软件，设计一对引物，用于特异性的扩增VPl基因。提取病毒RNA，反转录为cDNA，PCR反应扩增VPl基因，经胶回收获得VPl基因。rAdv-VPl的构建及应用将VPl基因片段(SEQ ID NO. I)定向克隆到·pShuttIe-CMV中，获得pS-VPl ;pS_VPl经Pme I线性化后转化至携带有腺病毒骨架质粒pAdEasy-Ι的大肠杆菌中，并在细菌内发生同源重组获得pAdv_VPl。pAdv-VPl经Pac I线性化后，转染 293 细胞，成功包装出 rAdv-VPl。rAdv-VPl 经 RT-PCR、IFA 和 Western blot证明该rAdv-VPl成功表达了 VPl蛋白。rAdv-VPl以肌肉注射途径免疫3周龄仔猪，首免后第2周可检测到抗体，第3周加强免疫，抗体水平增长明显。淋巴细胞增殖试验表明，该rAdv-VPl进入免疫动物体内后能有效诱导致敏淋巴细胞增殖，淋巴细胞受到刺激物的刺激后，大量增殖，免疫后刺激指数值不断上升。本发明采用非复制型腺病毒为载体，构建了表达PTV-8VP1基因的非复制型重组腺病毒。将VPl基因片段定向克隆到腺病毒穿梭载体PShuttle-CMV中，获得重组穿梭载体；重组穿梭载体经Pme I线性化后电转化至携带有腺病毒骨架质粒pAdEasy-Ι的大肠杆菌中，并在细菌内发生同源重组获得重组腺病毒载体。重组腺病毒载体经Pac I线性化后，转染293细胞，成功包装出重组腺病毒。经过RT-PCR、IFA和Western blot证明VPl基因在293细胞中获得成功表达。为了研究重组腺病毒的免疫效果，构建的重组腺病毒以肌肉注射途径免疫3周龄仔猪。动物实验结果表明本发明重组腺病毒能够刺激猪体产生体液免疫反应和细胞免疫反应。本发明采用非复制型腺病毒AdEasy表达系统，它是通过缺失腺病毒基因组的El和E3区基因片段构建而成的。与复制型腺病毒相比，非复制型腺病毒更安全，表达抗原持续时间长，能诱导长期的免疫反应。重组腺病毒载体基因组稳定，易于用重组DNA技术操作；安全性较好，腺病毒无需整合进宿主细胞基因组中；插入大片段外源性基因的潜力大；宿主范围广，可感染分裂细胞和非分裂细胞；容易将外源基因直接导入靶细胞，并有效表达活性蛋白；对动物无致癌性，对人类致病性极低。目前以腺病毒为载体已广泛应用于基因治疗和疫苗研究等领域，所以本发明构建的重组腺病具有较好的应用前景。
图I为PTV-8VP1基因扩增结果；M DNA Marker DL2000 ;1，2 :PTV_8PCR 扩增产物；3 :阴性对照；图2为pS-VPlPCR鉴定结果；
M DNA Marker DL2000 ;1，2 :PCR 扩增产物；3 :阴性对照；图3为pS-VPl双酶切鉴定结果；M DNA Marker DL15000 ；1 :pS_VPlKpn I /Xho I 双酶切；图4 为 pAdv-VPl PCR 鉴定结果；M DNA Marker DL2000 ；1 :PCR 扩增产物；2 :阴性对照；图5为pAdv-VPl酶切鉴定结果；M:DNA Marker DL15000 ；1 :重组腺病毒质粒 pAdv-VPl 酶切；图6为VPl基因在rAdv-VPl感染的293细胞中的转录结果； M DNA Marker DL2000 ；1 rAdv-VPl 感染 293 细胞；2 wtAdv 感染 293 细胞；图7为IFA检测VPl蛋白在rAdv-VPl感染的293细胞中的表达结果(X200)；A rAdv-VPl 感染 293 细胞；B wtAdv 感染 293 细胞；图8为Western blot检测VPl蛋白在rAdv-VPl感染的293细胞中的表达结果；M :蛋白 Marker ； I wtAdv 感染 293 细胞；2 rAdv-VPl 感染 293 细胞；图9为rAdv-VPl的PCR稳定性鉴定结果；M DNA Marker DL2000 ;1_4 :第 2、4、8、15 代 rAdv-VPl ；5 :阴性对照；图10为rAdv-VPl和wtAdv的一步生长曲线；图11为中和试验测定猪血清中和抗体结果(丨表示免疫时间)；图12为间接ELISA检测抗体效价结果(丨表示免疫时间)；图13为淋巴细胞增殖试验结果(丨表示免疫时间)；图14为对照非免疫猪群攻毒后猪肠绒毛脱落病理切片。
具体实施例方式下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。实施例1PTV-8VP1基因重组腺病毒的构建及表达I材料和方法I. I毒株、质粒、细胞、菌株及血清PTV_8Jilin/2003、亲本腺病毒(WtAdv)由本实验室保存；pShuttle_CMV、含腺病毒骨架质粒(pAdEasy-Ι)的大肠杆菌BJ5183感受态细胞均购自Stratagene公司；ST细胞、293细胞、大肠杆菌DH5 α感受态细胞、PTV-8 jilin/2003阳性血清和阴性血清由本实验室提供；3周龄仔猪购自哈尔滨道里区新立养殖场。I. 2主要试剂DMEM培养基、RPMI 1640培养基、胎牛血清购自Gibico公司；青霉素、链霉素购自哈药集团制药总厂；限制性内切酶Kpn I、Xho I、Pme I、Pac I、Ex-Taq DNA聚合酶、dNTP、10XEx-Taq buffer>6XLoading buffer> DNA Marker DL2000、DNA MarkerDL15000、反转录试剂盒购自宝生物工程公司(大连)；RNA提取试剂盒、组织/细胞总DNA提取试剂盒、DAB显色液购自天根生化科技有限公司；质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒、卡那霉素(Kanamycin)购自上海华舜生物工程有限公司；琼脂糖购自Biowest公司；Lipofectamine2000购自Invitrogen公司；FITC标记的鼠抗猪IgG抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG抗体均购自Sigma公司；伊文氏兰、固定液(丙酮甲醇=1 I)为本实验室配制并保存；蛋白Marker购自Fermentas公司；SDS_PAGE凝胶配制试剂盒购自碧云天生物技术研究所；WeStern及IP细胞裂解液试剂盒购自凯基生物公司；96孔非放射性细胞增殖检测试剂盒购自Promega公司；3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)购自Amresco公司；猪淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物公司。I. 3PTV-8VP1基因引物设计与PCR扩增根据PTV-8jili/2003株VPl基因序列，利用01igo6和Primer5. O引物分析软件，设计一对引物，特异性的扩增VPl基因，下划线处分别是限制性内切酶KpnI和Xho I的酶切位点，引物由大连宝生物公司合成，无菌水稀释成100 μ mol/L，-20 V储存备用，使用浓度是ΙΟμπιοΙ/L。引物的核苷酸序列为
PTV-R:5' -GGGGAGCTCAATTTGCAGTGACATAGTTGTCAAGG-3'培养ST细胞，待长成单层，弃培养液，PBS洗3次，按5%接种剂量，接种PTV-8 jilin/2003病毒液，37 °C 5%C02培养箱中孵育lh，然后加入含2%胎牛血清的DMEM培养基，37°C 5%C02培养箱中继续培养并观察细胞生长状况，待有80%左右细胞发生病变，收集细胞悬液，反复冻融三次，继续在ST细胞上繁殖两代以上，收集病毒液，按照天根生化科技有限公司总RNA提取试剂盒说明书进行病毒RNA提取，按照宝生物工程公司(大连)Reverse Transcriptase M-MLV试剂盒说明书进行cDNA的合成，以cDNA为模板进行PCR反应，25μL反应体系10XEx Taq buffer5. O μ L, dNTP2. O μ L，Ex TaqO. 5 μ L，上下游引物(PTV-F/PTV-R)各 I. O μ L，cDNA2 μ L, ddH2013. 5 μ L。PCR 反应条件94°C 5min，94°C 30s,56°C 45s, 72°C lmin，共进行30个循环，72°C 7min，4°C终止反应。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，胶回收目的片段。I. 4构建含VPl基因的pS-VPl上述回收产物用Kpn I和Xho I双酶切与同样酶切的pShuttIe-CMV连接后，转化到DH5 α大肠杆菌感受态细胞中。利用Kan抗性筛选重组质粒，并经PCR和Kpn I /Xho I双酶切鉴定，获得的PS-VPl送上海生工测序并分析目的序列。L 5 构建含 VPl 基因的 pAdv-VPl提取阳性pS-VPl (测序结果显示含有核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示的片段的克隆。)，经限制性内切酶Pme I酶切，向酶切产物中加入无水乙醇，轻轻混匀，_20°C放置过夜，离心，在无菌条件下倒掉无水乙醇，静置使无水乙醇蒸发干净，无菌水重悬沉淀。经无水乙醇沉淀的线性化PS-VPl电转化至含有腺病毒骨架pAdEasy-Ι的BJ5183感受态细胞中，进行同源重组，挑取Kan平板上的菌落，在含Kan抗性的液体LB中扩大培养，提取质粒，用PCR和Pac I酶切鉴定。I. 6rAdv-VPI 的获得提取pAdv-VPl，经限制性内切酶Pac I线性化，无水乙醇沉淀，利用Lipofectamine2000转染试剂，将线性化的pAdv-VPl转染293细胞，待出现明显细胞病变后收集细胞，反复冻融裂解细胞后，收取上清即为病毒原液，病毒原液可感染细胞用于病毒传代。本发明获得的一株含有上述SEQ ID NO 1核苷酸序列的重组腺病毒，所述的重组腺病毒命名为rAdv-VPl，分类命名为表达猪捷申病毒8型VPl蛋白的重组腺病毒，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为=CGMCC NO. 6340，保藏日期为2012年7月6曰。I. 7rAdv-VPI 的鉴定I. 7. IVPl基因在293细胞中的转录rAdv-VPl和wtAdv分别接种293细胞，48h后收集细胞，离心，倒掉上清液，取细胞沉淀提取细胞总RNA，利用反转录试剂盒合成cDNA，以合成的cDNA为模板，PTV-F和PTV-FR为引物PCR扩增VPl基因，mRNA水平上鉴定VPl基因在293细胞中的转录。 I. 7. 2IFA检测VPl基因在293细胞中的表达24孔细胞培养板中培养293细胞，待铺满单层，接种rAdv-VPl和wtAdv，观察细胞病变，当约70%接毒细胞变圆(未脱落)时，弃去细胞培养液，PBS洗板2次，室温下晾干培养板，向每孔中加ImL固定液,室温静置15min,弃去固定液,PBS洗板3次,每次间隔5min,室温晾干，作为IFA抗原板,用PBS浸洗抗原板一次，向rAdv-VPl和wtAdv接毒孔中分别加入PTV-8 jilin/2003阳性血清(I 100稀释)，每孔加样量为100 μ L，置于湿盒中37°C孵育ASmin15PBS洗涤3次，每次间隔5min。加入100 μ L FITC标记的鼠抗猪IgG抗体(I 100稀释)，同时向二抗中加I μ L伊文氏兰(1:10000稀释)充分混匀，置于湿盒中37°C孵育45min，PBS洗涤3次，每次间隔5min。最后加少量碳酸甘油，倒置荧光显微镜下观察结果。I. 7. 3ffestern blot检测VPl蛋白在293细胞中的表达rAdv-VPl和wtAdv同时接293细胞，收集细胞，离心，预冷的PBS洗涤3次，最后取细胞沉淀，利用Western及IP细胞裂解液裂解细胞提取细胞蛋白，进行SDS-PAGE电泳分离，转PVDF膜。加入I : 100稀释的PTV-8阳性血清，室温摇床上孵育lh。加入辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG抗体(1:5000)，室温摇床上孵育lh，用DAB化学发光法显色。I. 7. 4VP1基因稳定性检测选择第2、4、8、15代细胞病毒培养液，提取细胞总的DNA。以提取的细胞总DNA为模板，利用PTV-F/PTV-R引物PCR扩增VPl基因，检测VPl基因的稳定性。I. 7. 5rAdv_VPl—步生长曲线的测定24孔细胞培养板中培养293细胞，待长至70%左右，每孔分别接rAdv-VPI和wtAdv, 370C 5%C02培养箱中培养，接毒后第12、24、36、48、60、72h收集细胞病毒培养悬液，反复冻融，按照Reed-Muench法测定病毒的TCID5tl,并绘制rAdv-VPl与wtAdv的一步生长曲线，测定rAdv-VPl增殖规律。2试验结果2. IVPl基因的扩增提取PTV-8 jilin/2003基因组RNA，反转录为cDNA，经过PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳，得到大小约为792bp的目的条带，与预期的VPl基因大小相符(见图1)，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。2. 2pS_VPlPCR 鉴定
以pS-VPl为模板，PTV-F/PTV-R为引物，PCR进行重组质粒的鉴定，经琼脂糖凝胶电泳，扩增出792bp大小的目的条带，证明VPl基因成功插入到腺病毒穿梭质粒中(见图2)。2. 3pS-VPl 酶切鉴定pS-VPl经Kpn I /Xho I双酶切获得了大小为7500bp的穿梭载体和792bp的插入片段(见图3)。2. 4pAdv-VPlPCR 鉴定线性化的pS-VPl与腺病毒骨架在BJ5183细胞中同源重组，获得pAdv-VPl阳性克隆，并以PTV-F/PTV-R为引物，PCR扩增目的片段，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，扩增出了 792bp大小的目的条带，说明VPl基因成功插入到腺病毒载体中(见图4)。2. 5pAdv-VPl 酶切鉴定 获得的pAdv-VPl经Pac I酶切获得了约30Kb和4. 5Kb大小的两条片段(见图5)，说明重组腺病毒载体构建正确。2. 6RT-PCR检测VPl基因在293细胞中的转录rAdv-VPl和wtAdv分别接种293细胞，提取细胞总RNA，反转录合成cDNA，以cDNA为模板，以PTV-F/PTV-R为引物，PCR扩增目的基因，经琼脂糖凝胶电泳，可见rAdv-VPl接种的293细胞扩增出与VPl基因大小一致的目的条带，而对照组为扩增出目的片段，说明VPl基因在293细胞中获得转录(见图6)。2. 7IFA检测VPl蛋白在293细胞中的表达参照发表在《中国预防兽医学报》2011年01期，题为检测猪捷申病毒抗体的间接免疫荧光方法的建立与初步应用的文献的方法进行操作。rAdv-VPl和wtAdv分别接293细胞后，固定细胞，以PTV阳性血清为一抗，进行IFA,倒置荧光显微镜下观察可见接种rAdv-VPl的细胞出现明显的荧光，而接种wtAdv的细胞不出现荧光(见图7)。2. 8ffestern blot检测VPl蛋白在293细胞中的表达rAdv-VPl和wtAdv分别接293细胞后，待细胞80%变圆，收集细胞，离心收集细胞沉淀，裂解细胞，提取细胞蛋白，加上样缓冲液煮沸，进行Western blot检测，结果显示rAdv-VPl感染的细胞样品中出现大小约为29ku的目的蛋白条带，而wtAdv感染的细胞样品中未出现目的蛋白条带(见图8)，表达的VPl蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。2. 9rAdv-VPI的稳定性检测取第2、4、8、15代rAdv-VPl细胞培养物，分别提取细胞总DNA，以PTV-F/PTV-R为引物，通过PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，均能检测到目的基因，证明VPl基因在重组腺病毒中稳定存在(见图9)。2. IOrAdv-VPl 一步生长曲线的测定rAdv-VPl和wtAdv同时接种293细胞，接毒后12、24、36、48、60、72h分别收集细胞病毒培养液，通过测定病毒的TCID5tl,绘制rAdv-VPl和wtAdv的一步生长曲线，发现rAdv-VPl与wtAdv的增殖规律无明显差异(见图10)。实施例2重组腺病毒表达PTV-8VP1蛋白的免疫原性分析I、实验方法I. I猪体免疫试验
选取健康状况良好且经间接ELISA检测为PTV抗体阴性的3周龄仔猪15头，随机分为三组，每组5头，一组经颈部肌肉注射108TCID5QrAdV-VPl，一组按相同的途径和剂量注射wtAdv，一组颈部肌肉注射DMEM培养基作为空白对照。初次免疫后第3周加强免疫，免疫前和免疫后每周采血，分离血清，用中和试验、间接ELISA试验检测血清抗体水平。采集抗凝血，淋巴细胞增殖试验检测细胞免疫水平。I. 2中和抗体测定保存的PTV-8 jilin/2003病毒液接种长满单层的ST细胞，待细胞出现80%以上病变，收集病毒液，如此扩增3代。取扩增的病毒液按Reed-Muench法测定病毒TCID5tl,并进行病毒回归试验。采集免疫猪和对照猪血液，分离上清，56°C灭活30min，中和试验测定血清中和抗体滴度。 I. 3间接ELISA抗体测定利用本实验室已建立的间接ELISA方法检测血清抗体效价。取包被好的ELISA板，室温预热，将待检血清、阳性血清、阴性血清按1:100稀释后，每孔加入100 μ L，37°C作用lh。每孔加入按1:5000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG抗体100yL，37°C作用lh，DAB显色，IOmin, H2SO4终止显色，用酶标仪读取OD45tlnm值，评价血清抗体效价，OD450nnm彡O. 3判定为阳性。I. 4淋巴细胞增殖试验按照猪淋巴细胞分离液试剂盒操作说明书分离猪抗凝血中的淋巴细胞。96孔细胞培养板中，每孔加入100 μ L细胞浓度为2Χ105个/mL的淋巴细胞悬液，并在每孔加入20 μ g/mL的PTV抗原作为刺激物100 μ L，同时设未刺激组对照孔，试验孔和对照孔各作3个重复，37°C 5%C02培养箱中培养约72h，按照细胞增殖检测试剂盒说明书向96孔中加入MTS/PMS试剂，370C 5%C02培养箱培养4h后，用酶标仪在OD49tlnm处读取OD值，计算刺激指数
(SI)，公式如下SI=刺激孔OD值/未刺激孔OD值I. 5表达PTV - VPl蛋白的重组腺病毒作为疫苗免疫期试验筛选PTV抗体阴性猪40头，以表达PTV - VPl蛋白的重组腺病毒为抗原，制备成疫苗(疫苗为5ML108TCID5(lrAdv-VPl，加入1ML20%的蔗糖作为赋形剂，冻干成疫苗，每瓶可以免疫猪5-10头，稀释液为O. OlM的PBS。)，进行了动物实验。用不同剂量ImL (上述冻干疫苗用O. OlM的PBS稀释成10ML，免疫10头猪)、2mL(上述冻干疫苗用O. OlM的PBS稀释成10ML，免疫5头猪)肌肉接种试验猪，各个剂量接种4头，同时设对照4头。疫苗接种当天及接种后7、14、21、30、45、90、150、180天进行采血，检测抗体应答水平；同设同批的非免疫猪取同样大小的样本作为试验对照，采集血样。用IF方法检测猪群血清抗体的产生情况。I. 6病毒攻击试验上述免疫期的免疫猪，疫苗接种后30天，随机从ImL免疫猪抽取猪4头，并从同批的非免疫猪群取同样大小的样本作为试验对照，按7X 106 5TCID50/头进行PTV-8 Ji I in/2003分离株攻击，进行临床观察。2、实验结果2. I中和试验检测中和抗体
以血清抑制病毒细胞病变的最大稀释度为中和抗体滴度，计算结果以平均值表示。中和试验检测结果显示rAdv-VPl组初免后一周5头猪平均抗体滴度为I: I. 8。加免后中和抗体增长明显，第7周有一头猪的平均抗体滴度较明显，达到1:32，5头猪的平均抗体滴度达到I : 18。wtAdv免疫组和空白对照组未检测到中和抗体，中和抗体滴度均为O(见图11)。2. 2间接ELISA测抗体效价间接ELISA检测结果表明，初免后第一周检测5头猪血清抗体OD45tlnm值均小于O. 3，第二周5头猪平均抗体OD45tlnm值稍大于O. 3，其中I头猪达到O. 326，加免后OD45tol值持续上升，第6周rAdv-VPl组5头猪OD450nm平均值达到O. 679，第7周达到O. 697。wtAdv免疫组和空白对照组抗体检测OD45tol值均小于O. 3 (见图12)。
2. 3淋巴细胞增殖试验淋巴细胞增殖试验检测结果显示，rAdv-VPl免疫组血液淋巴细胞经PTV刺激后出现特异的细胞活化增殖。初免后两周SI值增长缓慢，第二周时5头猪SI平均值仅为I. 18，加免后持续升高，第7周SI值平均值达到2. 78，而wtAdv免疫组和空白对照组没有出现明显的淋巴细胞增殖(见图13)。2. 4表达PTV - VPl蛋白的重组腺病毒疫苗免疫期试验检测猪捷申病毒抗体的间接免疫荧光方法按照刘芹防等在检测猪捷申病毒抗体的间接免疫荧光方法的建立与初步应用，《中国预防兽医学报》2011 (01) 一文中记载的方法进行。血清学监测结果表明，Iml及2mL免疫组在免疫后第14天被免动物开始出现抗体反应，效价达到I :100 200，21天全部阳转，免疫后第45天达到抗体高峰，效价达为I :800 1600,随后抗体效价逐渐消减,到150天抗体效价仍能达到I :200 400,180天抗体效价能达到I :200。2. 5病毒攻击试验疫苗接种后30天，随机从免疫猪抽取猪4头，并从同批的非免疫猪群取同样大小的样本作为试验对照，按7X 106 5TCID50/头进行PTV-8Ji I in/2003分离株(该病毒株记载于“检测猪捷申病毒抗体的间接免疫荧光方法的建立与初步应用”，刘芹防等，《中国预防兽医学报》2011 (01)，现由哈尔滨兽医研究所保存。)攻击，结果发现Iml免疫组猪群在免疫30天能够获得100%保护率；而对照猪有部分出现拉稀、发热、食欲不振等现象；剖检结果表明免疫IML以上的猪全部正常，对照猪出现肠道充血、出血变化，病理检测见肠绒毛脱落等变化(见图14)，部分猪肺脏等出现变化。RT-PCR检测结果表明免疫IML以上的猪脏器未分离到病毒，而对照猪可以部分分离到病毒。
权利要求
1.猪捷申病毒8型VPl蛋白，其特征在于所述的VPl蛋白的氨基酸序列如SEQID NO. 2所示。
2.编码权利要求I所述的猪捷申病毒8型VPl蛋白的核苷酸序列，优选的，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
3.—种重组表达载体，其特征在于含有权利要求2所述的核苷酸序列。
4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于所述的重组表达载体是重组腺病毒表达载体。
5.一种宿主细胞，其特征在于含有权利要求3或4所述的重组表达载体。
6.权利要求I所述的猪捷申病毒8型VPl蛋白在制备诊断、预防或治疗猪捷申病药物中的用途。
7.权利要求3或4所述的重组表达载体在制备诊断、预防或治疗猪捷申病药物中的用途。
8.一种制备表达猪捷申病毒8型VPl蛋白的重组腺病毒的方法，其特征在于包括将SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列克隆到pShuttle-CMV中，获得pS-VPl ;pS_VPl经线性化后电转化至携带有腺病毒骨架质粒的大肠杆菌中，并在细菌内同源重组获得含有VPl基因的重组腺病毒表达载体；将pAdv-VPl线性化后，转染293细胞，即可获得表达VPl蛋白的重组腺病毒。
9.一种表达猪捷申病毒8型VPl蛋白的重组腺病毒，其特征在于含有SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列，所述的重组腺病毒，命名为rAdv-VPl，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为=CGMCC NO. 6340。
10.权利要求9所述的重组腺病毒在制备诊断、预防或治疗猪捷申病药物中的用途。
全文摘要
本发明公开了表达猪捷申病毒8型VP1蛋白的重组腺病毒及其应用。本发明根据VP1基因序列设计一对引物扩增出VP1基因(SEQ ID NO.1所示)。将克隆获得的VP1基因插入腺病毒穿梭载体中，获得重组穿梭载体，经Pme Ⅰ线性化后电转化至携带有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌中，并在细菌内发生同源重组产生含有VP1基因的重组腺病毒载体，经Pac Ⅰ线性化，转染293细胞，成功包装出含VP1基因的重组腺病毒。将本发明的rAdv-VP1以肌肉注射途径免疫3周龄仔猪，可诱导猪体产生特异体液免疫和细胞免疫应答，并能抵抗现地分离株的攻击，表明本发明的重组腺病毒rAdv-VP1可应用于猪捷申病的防治。
文档编号A61K48/00GK102757483SQ20121025750
公开日2012年10月31日 申请日期2012年7月24日 优先权日2012年7月24日
发明者崔尚金 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所