专利名称：一种慢性肾间质纤维化模型的建立方法
技术领域：
本发明涉及一种模型建立方法的技术领域，具体地说，是关于一种慢性肾间质纤维化模型的建立方法。
背景技术：
人类疾病动物模型是生物医学科学研究中建立的具有人类疾病模拟性表现的动物实验对象和材料，可为研究人类疾病的预防、治疗(包括新药物试用)提供理论依据。动物疾病模型的复制，在医学科学研究中占有十分重要的地位。近年来，临床上由于存在不按中医辨证论治理论规范使用中草药和民间“中草药无毒”的错误观念，以及国外对“中草药肾病”含义的泛化，遏制了中草药的临床应用和中医 药的国际发展。因此，中草药肾毒性的问题引起了国内外学者的广泛关注，防治肾小管间质纤维化成为了肾病研究领域热点。经了解，目前较多实验研究中，常采用单侧输尿管梗阻导致肾间质纤维化模型进行研究，但该方法对实验动物损伤较大，动物死亡率高，实验成本较高，且未能证实药物毒性可导致肾小管间质纤维化。另有郑氏采用了马兜铃酸A标准品腹腔注射致大鼠慢性肾间质纤维化模型也较为经典，该方法虽证实了药物毒性，但马兜铃酸A标准品价格昂贵，不易得到，也阻碍了该模型的使用。中药寻骨风又名清骨风、猫耳朵(《南京民间药草》)，穿地节、毛香、白毛藤、地丁香、黄木香(《江苏植药志》)，白面风、兔子耳(《江西民间草药》)，为马兜铃科草本植物绵毛马贺治Ar i s to I och i a mol lissima Hance的地上部份,性味辛、苦,平,归肝经。具有祛风通络，抗炎，止痛的功效，临床主要用于风湿痹痛，胃痛，睾丸肿痛，跌打伤痛等症。有文献报道了寻骨风水煎剂不同剂量对实验大鼠肾功能和肾小管-间质组织形态造成损害，但未阐明机制。亦有学者对香港服用了寻骨风69例患者的肾损害进行了初步评估，服用量最少每天IOg,最大每天30g,最短时间3天,最长为300天,每周服药量< 5d,结果均未出现明显的肾损害。中国专利文献CN =1959408公开了一种含马兜铃酸及其内酰胺类成分的体内样品的测定方法。中国专利文献CN 101884641A公开了中药治疗慢性肾脏损伤动物模型的建立方法。但是关于用寻骨风建立慢性肾间质纤维化模型方法目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种慢性肾间质纤维化模型的建立方法。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是
一种慢性肾间质纤维化模型的建立方法，所述的该方法选用雌性Wister大鼠为动物模型，将寻骨风制成水煎液，寻骨风水煎液灌胃大鼠，所用寻骨风生药剂量为2. 7g. kg—1. Cf1或 13. 5g. kg \ d 1 或 27g. kg d 1O
所述的剂量为27g. kg'Cf1。所述的雌性Wister大鼠体重120 150g。本发明优点在于
本发明明确了寻骨风所含马兜铃酸对肾小管间质造成的影响，并观察了其对大鼠肾小管-间质影响的可能机制，旨在为肾小管间质纤维化模型建立提供一种较新的可靠方法，为规范临床合理使用中草药提供参考。本方法的结果证实了超常规剂量服用寻骨风能导致肾小管-间质的损害，高剂量寻骨风灌胃后能在90天内造成了大鼠肾间质的纤维化，大鼠肾功能衰竭，严重时可致死亡，而且肾小管和间质损伤程度与寻骨风用药的剂量大小和时间长短相关。实验中寻骨风高剂量组较马兜铃酸A组所引起的肾小管-间质损害程度重，肾间质纤维化较为严重。低 剂量寻骨风灌胃90天后肾小管和间质均未出现明显异常。这为临床合理使用寻骨风药材提供了依据和参考。本方法在操作时，采用灌胃的给药方式给药，减少了对实验动物的创伤，降低了死亡率。此外，本方法造模所用的中药材寻骨风市场零售价为25元/公斤，价格便宜，进一步降低了实验成本。
附图I是光镜观察大鼠45天后，肾小管上皮变化图。附图2是光镜观察大鼠90天后，肾小管上皮变化图。
具体实施例方式下面对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。(I)材料
①寻骨风饮片为市售产品。经反相高效液相色谱法测定实验用寻骨风中含有马兜铃酸A的含量为0. 07%。②寻骨风制剂水煎液取实验用寻骨风饮片lOOOg，加水12000ml，浸泡I小时，力口热至沸腾后15min淋出。药渣再加水8000ml，加热至沸腾后15min淋出。二煎药汁相合用旋转蒸发仪减压浓缩至700ml (相当于每毫升含生药I. 43g,含马览铃酸Al. 00mg),4°C下冰箱保存备用。③药物配制寻骨风溶液用蒸馏水将寻骨风制剂原液配制成相当于每毫升含寻骨风生药I. 62g (相当于含马兜铃酸Al. 134mg)浓度的溶液备用。(2)方法
①实验动物雌性Wister大鼠，体重120 150g。大鼠适应性喂养3天。②给药剂量及处理按人用寻骨风生药最高用量30g/d，根据实验大鼠与人体表面积比等效剂量换算比例0. 018计算为2. lg. kg' Cf1的10倍量计算为27g. kg' Cf1给予灌胃(用时按lml/100g大鼠灌胃)。持续给药时间90天。大鼠在45天、90天时分别称体重、留尿、大鼠腹股沟取血，处死后测肾重，留取肾组织，剥除肾脏外包膜放入福尔马林固定。所有大鼠分组分笼饲养，实验期间全部动物自由进食、饮水。所有大鼠分组分笼饲养，实验期间全部动物自由进食、饮水。(3)检测指标及方法
①尿液检查潜血\肾功能早期损伤三项指标MA/Cr、TF/Cr及NAG/Cr；
②血清肌酐、尿酸、尿素氮检测；
③肾组织病理学检查和PAS染色方法
④病理检查
(4)结果分析
尿常规检查未发现尿潜血阳性，大鼠在45天时检测NAG/Cr、MA/Cr、TF/Cr均明显 升闻,90天后，二组尿液检测指标进一步升闻。用药90天后，大鼠Scr和BUN均出现升闻，
肾功能遭到了损害。具体数据见表I__
项目_0天_45天_90天_
NAG/Cr (U/g) 0. 10±0. 06&5±0. 37 2. 11±2. 6i~
MA/Cr (mg/mmol) 0. 13±0. 09±0. 55 2.29±1.7§~
TF/C(mg/mmol) 0. 05±0. 09H7±0. 20 0. 43±0. ~
Scr(timol/L) 18. 63 ±2. 56 丑700 ±13. 86 58.00±6.元_
BUN(mmol/L) |5. 73±0. 32|4. 46±0. 45 |6. 84±1.05
光镜观察大鼠45天后，出现肾小管上皮细胞肿胀、空泡变性、部分脱落，管壁增厚，间
质水肿增宽、炎症细胞浸润，见图1(图I中的左边图为(HEX200)，右边图为(PASX200))。
90天后大鼠肾小管上皮细结构紊乱，可见明显肾小管萎缩，管腔缩小、管壁增厚，部分闭塞，
间质区增宽，肾小管-间质少量炎性细胞浸润，伴纤维化形成见图2 (图2中的左边图为
(HE X 200 )，右边图为(PAS X 200 ))，与用马兜铃酸A标准品腹腔注射致大鼠慢性肾间质纤
维化的模型比较无显著差异。此结果还证明超常规剂量服用寻骨风能导致肾小管-间质的损害，且肾小管和间质损伤程度与寻骨风用药的剂量大小和时间长短相关。实验操作中，仅有I只大鼠因为灌胃死亡，其余均能完成实验。本发明采用寻骨风水煎剂给实验大鼠灌胃的方法，诱导其发生肾小管间质纤维化。该方法制作模型实验动物创伤少，操作简便，死亡率低，实现了实验研究成本降低，便于研究者使用，促进临床合理使用中草药。寻骨风为马兜铃科植物棉毛马兜铃的根茎或全草，有研究报道了寻骨风水煎剂引起了大鼠肾小管-间质损害，但未阐明其机制。课题组先前通过反相高效液相色谱法测定了实验用寻骨风中所含马兜铃酸A的含量为0. 07%,随后经过寻骨风急性毒性试验和亚急性毒性试验，证实了寻骨风中药材的毒性，确定了高(27g. kg-1. Cf1)、中(13. 5g. kg-1, cf1)、低(2. 7g. kg' cf1)三种剂量进行试验。课题组将这三种剂量的寻骨风水煎液给各组别的雌性Wister大鼠连续灌胃90天，同郑氏采用马兜铃酸A标准品腹腔注射所致大鼠慢性肾间质纤维化模型(马兜铃酸A组)相比较，结果显示高剂量组(27g. kg-1, cf1)大鼠病理变化与国内外相关研究的报道相同，与经典方法比较无显著差异，说明成功建立了肾小管间质纤维化模型。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种慢性肾间质纤维化模型的建立方法，其特征在于所述的该方法选用雌性Wister大鼠为动物模型，将寻骨风制成水煎液，寻骨风水煎液灌胃大鼠，所用寻骨风生药剂量为 2. 7g. kg—1, d—1 或 13. 5g. kg—1, d—1 或 27g. kg—1, d—1。
2.根据权利要求I所述的慢性肾间质纤维化模型的建立方法，其特征在于所述的剂量为 27g. kg'cf1。
3.根据权利要求I所述的慢性肾间质纤维化模型的建立方法，其特征在于所述的雌性Wister大鼠体重120 150g。
全文摘要
本发明涉及一种慢性肾间质纤维化模型的建立方法，所述的该方法选用雌性Wister大鼠为动物模型，将寻骨风制成水煎液，寻骨风水煎液灌胃大鼠，所用寻骨风生药剂量为2.7g.kg-1.d-1或 13.5g.kg-1.d-1或27g.kg-1.d-1。本发明为肾小管间质纤维化模型建立提供一种较新的可靠方法，为规范临床合理使用中草药提供参考。本方法在操作时，采用灌胃的给药方式给药，减少了对实验动物的创伤，降低了死亡率。
文档编号A61K36/264GK102772464SQ20121026047
公开日2012年11月14日 申请日期2012年7月26日 优先权日2012年7月26日
发明者周雯静, 彭文, 金周慧 申请人:上海市普陀区利群医院