专利名称：Klotho腺相关病毒在制备治疗SHR大鼠高血压心脏病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，具体的说，涉及一种Klotho腺相关病毒的新用途。
背景技术：
研究表明高血压病及其相关的心血管疾病已成为危及人群健康的常见病；而老年人因罹患心血管病而致的死亡明显高于年轻人。因此，高血压病以及相关心血管并发症与衰老密切相关，也是影响其预后的重要因素。已有研究证实自发性高血压(spontaneoushypertensive rat, SHR)大鼠具有许多人类自发性高血压的特征,是一种很好的高血压模型动物，其血压水平有随年龄增长而增高的特点，常伴发心、肾及血管等靶器官损伤，其中高血压心脏病以心肌肥大、心肌纤维化、心室重塑等损害更为重要。 Klotho基因作为一种于1997年被KuiX)等人发现的新型衰老相关基因，其研究发现在Klotho基因敲除小鼠模型上Klotho可以抑制多种类似人类衰老相关表型，如动脉硬化、骨质疏松、生殖功能减退、肺气肿、寿命缩短等。而Klotho的过表达可以延长寿命。研究发现Klotho基因可以抑制胰岛素IGF-I信号通路，增加NO活性，调节离子通道活性。Klotho还可以对抗内皮功能障碍。肖明能等研究报道40岁以后血浆Klotho蛋白水平随年龄增加而有下降趋势。Wang等报道Klotho在体内的基因转导可以阻止高血压的进程和保护肾脏功能。但就Klotho在心脏靶器官损伤中是否也发挥了作用，以及是否对高血压心脏病有治疗作用，目前尚未见报道。
发明内容
为解决以上技术问题，本发明的目的在于提供一种Klotho腺相关病毒作为制备治疗SHR大鼠高血压心脏病药物的新用途。本发明目的是这样实现的=Klotho腺相关病毒在制备治疗SHR大鼠高血压心脏病药物中的应用。动物实验I.材料I. I实验动物10周龄雄性SHR大鼠购自北京维通利华实验动物公司，10周龄雄性SD大鼠购自重庆医科大学实验动物中心。I. 2 试剂多克隆兔来源IGF-I、IGF-1R、p-Akt (Ser473)、t-Akt—抗购自北京博奥森生物公司；IGF-U Rat Insulin ELISA kit为R&D公司分装产品；RIPA蛋白裂解液(浆)、PMSF、SDS-PAGE配胶试剂盒、转膜液、电泳液、蛋白Maker、PVDF膜均为碧云天产品。2.方法2. I动物实验方案
实验研究分4组，实验组A、B、C 3组均为SHR大鼠，对照组(D组)为年龄、性别一致的SD大鼠，每组5只。所有大鼠均在重庆医科大学附属第一医院中心实验室动物房SPF级饲养，标准大鼠饲料喂养，饮水中加复合维生素B。自由取食饮水。采用无创尾动脉袖带法测量大鼠静息收缩压。无创尾动脉袖带法是一种常用的血压检测方法[6，7]。所有大鼠在实验前检测血压、体重。实验组即A、B、C组SHR大鼠分别行尾静脉注射PBS(0. 5ml/只)、rAAV. mKL (3 X IO8Vg/ 只，O. 5ml)和 rAAV. EGFP (3 X IO8Vg/ 只，O. 5ml);对照组 SD 大鼠尾静脉注射PBS 0.5ml作为对照研究。随后每两周测体重、血压一次，连续观察12周。实验结束时处死全部大鼠。处死前用水合氯醛腹腔注射麻醉，采血分离血浆。分离心脏，去除血液、大血管称重。取部分左心室用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片做HE、MaSSon染色；部分OCT包埋，做冰冻切片，荧光显微镜观察荧光。2. 2免疫组化检测心脏klotho蛋白表达使用博奥森SP免疫组化染色试剂盒，步骤如下大鼠心脏组织切片脱蜡至水，1%胰酶37°C 25min抗原修复，3 %过氧化氢孵育lOmin，封闭液37°C封闭25min，4°C孵育一抗 (Anti-Klotho,l 50)过夜，I 100 二抗37°C孵育30min，HRP标记链霉卵白素工作液孵育30min，DAB显色l-5min。复染、脱水、透明、封片、晾干。Leica正置显微镜观察、采图，Image-Pro Plus 6. O 软件分析阳性异染颗粒 IOD (Integrated Optical Density)值。2. 3 心脏 HE 及 Masson 染色各组大鼠心脏组织切片，常规HEQiematoxylin)染色观察心肌细胞，同时进行Masson三色法胶原纤维染色，Leica正置显微镜观察并采图。2. 4RT-PCR法检测心脏小鼠Klotho mRNA表达用RNAiso Plus按说明书提取心脏总RNA，Nanodrop2000微量分光光度计检测总RNA浓度计A260/A280比值。总RNA浓度在3-5 μ g/μ L，Α260/Α280比值在I. 8-2. O之间，无明显降解及蛋白污染，满足逆转录需要。取I μ g总RNA,用PrimeScriptRT reagent Kit按说明书20 μ L体系逆转录，逆转录所得cDNA-20°C保存。根据NCBI GenBank收录mRNA蛋白编码区序列设计引物。小鼠Klotho (NCBI Reference Sequence NM_013823. 2):上游5，-GGG TCA CTG GGTCAA TCT-3，;下游 5’ -GCA AAG TAG CCA CAA AGG-3，，PCR 产物长度为 710bp。取 2μ L逆转录所得 cDNA，用 Premix Taq Version 2. OPCR 扩增小鼠 Klotho 基因。小鼠Klotho PCR产物通过2%琼脂糖凝胶电泳观察分析。β-actin PCR产物长度为157bp。2.5GFP蛋白检测新鲜心脏组织用OCT包埋，冰冻切片(20 μ m)。用Leica DM6000荧光正置显微镜观察绿色荧光表达情况，并采图。2. OTestern blot 检测 Klotho 蛋白表达取新鲜心脏组织约lOOmg，尽量剪碎，加400 μ L RIPA蛋白裂解液(含4 μ L ImMPMSF)冰上充分裂解30min，14，000g 4°C离心5min。收集上清，取IyL BCA法测蛋白浓度。另取20(^1^加同体积蛋白上样缓冲液，沸水煮511^11，-201保存备用。配制8% SDS-PAGE分离胶，每孔加总蛋白40 μ g，蛋白电泳分离，根据蛋白Maker切胶，转至PVDF膜。在含5 % BSA的TBST中37°C封闭lh。I : 750稀释的Klotho—抗4°C孵育过夜。GAPDH—抗I : 1000稀释后孵育。次日HRP标记二抗(I 3000) 37°C孵育Ihour。加ECL后X胶片曝光、显影、定影。Quantity One软件测定蛋白条带灰度值。Klotho蛋白条带灰度值与GAPDH条带灰度值的比值为Klotho蛋白相对表达量。2. 7心脏体重指数大鼠处死前称体重，处死后分离心脏，去除血液、大血管后称重。心脏左心室体重指数=大鼠心脏左心室重量(g) XlOOO+大鼠体重(g)。2. 8数据分析所有数据应用PASW 18软件分析。体重、血压数据应用one-way ANOV A分析，其余数据应用two-ways ANOVA分析,其显著性检验设置为95%可信区间，P < O. 05即为显著性。3.结果3. IKlotho基因转导对SHR大鼠血压的影响在rAAV转导前，17周龄的SHR大鼠基础血压明显高于17周龄的SD大鼠(图I)。12周实验结束时，SHR-mKL组SHR大鼠其血压与干预前相比并无明显升高，而SHR-PBS组和SHR-EGFP组血压则继续升高，在实验12周结束时血压高达204. 2±10. 6mmHg。本研究证实单剂量的rAAV. mKL (3 X IO8Vg)能阻止SHR大鼠高血压的进展至少12周。如图I所示.rAAV. mKL转导对SHR大鼠血压的影响。SHR和SD大鼠在17周龄时，尾静脉注射rAAV. mKL、rAAV. EGFP及PBS。数据为均值土标准差，* :与SHR-PBS组相比P< O. 05。N = 5 只 / 组。3. 2检测大鼠心脏GFP及mKL mRNA表达情况在rAAV. mKL和rAAV. EGFP转导12周后，在SHR-mKL组和SHR-EGFP组大鼠心脏中仍观察到绿色荧光EGFP表达。而SHR-PBS组和SD-PBS组大鼠心脏中未观察到绿色荧光。此结果提示rAAV介导的基因转导可以在心脏中较长时间表达，并维持到12周实验结束之时。rAAV. mKL转导SHR大鼠12周后，心脏中检测到小鼠Klotho mRNA表达，提示rAAV成功地将小鼠Klotho基因转导至心脏。而其他三组中未检测到小鼠mKLmRNA表达。GFP和小鼠Klotho mRNA在心脏中的表达。在荧光显微镜下，可见rAAV. mKL和rAAV. EGFP转导的大鼠心脏有GFP表达，PBS注射大鼠心脏未见绿色荧光(如图2)。用小鼠Klotho特异性引物RT-PCR检测小鼠心脏Klotho mRNA表达(如图3)，发现除rAAV. mKL转导SHR大鼠外，其余三组均未见小鼠mKL mRNA表达3. 3Klotho基因转导对SHR大鼠心肌肥大、心肌纤维化及心脏左心室重量指数的影响。rAAV. mKL对心肌肥大、心肌纤维化及Klotho蛋白表达的影响。如图4所示，rAAV.mKL对心肌肥大的影响(HE染色)。如图5所示,rAAV. mKL对心脏胶原纤维(Masson染色)表达的影响。如图6所示，rAAV.mKL对大鼠心脏体重指数的影响。数据=均数土标准差。* 与 SHR-PBS 组相比 P < O. 05 ;林 与 SHR-PBS 相比 P < O. 01，N = 5 只 / 组。3组SHR大鼠心脏切片HE染色后，均可见肥大心肌细胞，但是在SD大鼠心脏切片未见明显肥大心肌细胞(如图4)。上述各组相互比较后，发现转导rAAV.mKL大鼠心脏中肥大心肌细胞明显少于PBS和rAAV. EGFP处理大鼠。Masson三色染色后看到，SHR大鼠心脏比SD大鼠心脏胶原纤维明显增生(如图5)。但经rAAV. mKL处理后大鼠心脏胶原纤维表达明显少于rAAV. EGFP和PBS处理组，即提示Klotho基因明显抑制心脏胶原纤维表达。3组SHR大鼠心脏左心室体重指数明显高于SD大鼠(如图6)，其中SHR-mKL组心脏体重指数也明显低于SHR-EGFP组和SHR-PBS组(p < O. 05)。另外在SHR-EGFP组和SHR-PBS组之间心脏体重指数无明显差异，即提示rAAV载体本身不影响SHR大鼠心脏体重指数。3. 4Klotho基因转导对SHR心脏Klotho蛋白的影响SHR大鼠心脏Klotho蛋白表达较同龄SD大鼠少，其中SHR-mKL组Klotho蛋白表达较其他两组明显增加，Klotho蛋白表达在SHR-mKL组和SD-PBS组之间无显著差异(见图 7、8)。rAAV. mKL对大鼠心脏Klotho蛋白表达的影响。如图7所示,Klotho、GAPDHWesternblot条带；如图8所示，Klotho蛋白表达定量分析。 三·结论本研究采用的重组腺相关病毒载体与其他基因转导载体相比，有许多特有的优势首先，由于腺相关病毒可以将外源基因插入到宿主基因组，rAAV介导的基因转导可以稳定持续表达。本研究采用rAAV. mKL转导SHR大鼠12周后，其心肌中仍可检测到GFP表达及mKL mRNA表达，也证明了这一特点；而rAAV. mKL的长效作用主要归功于长效的AAV载体。其次，AAV载体在体内转导没发现明显免疫反应，在组织学检查中没发现免疫反应迹象，在后期数据分析中也没观察到AAV载体的毒性反应；而上述这些特征对于像高血压这种慢性疾病的治疗至关重要。因此，AAV介导的Klotho基因转导为高血压及相关心血管疾病的长期治疗提供了新的方向。本实验研究证实rAAV. mKL可以显著增加SHR大鼠心脏Klotho mRNA及蛋白的表达，同时Klotho基因转导可以阻止SHR大鼠血压的升高，与文献报道一致。通过对自发性高血压大鼠行Klotho基因转导实验，发现rAAV. mKL转导的SHR大鼠其心脏组织的心肌肥大和心肌纤维化较SHR对照组明显受到抑制、其心脏体重指数也较对照组降低，由此推测，Klotho基因表达上调在SHR大鼠心肌肥大和心肌纤维化进程中发挥了作用，降低了左心室质量指数，而这三方面也是高血压心脏病的重要病理过程和评价指标。同时研究也证实了心脏是Klotho作用的靶器官之一。众所周知，高血压病持续发展可导致心肌肥大、心肌纤维化、心脏增大，这正是其发生心肌重塑、心肌损害的重要表现。国内学者研究报道血浆Klotho蛋白水平随年龄增加而降低，同时研究证实高血压病发病随着年龄增加而增加。为此，研究Klotho基因在高血压以及心肌肥大、心肌纤维化进程中的作用及机制具有重要意义。本实验研究发现Klotho基因转导组SHR大鼠其肥大心肌细胞和心肌胶原纤维较对照组减少，心脏体重指数也较对照组降低。上述结果表明Klotho基因及蛋白不仅在心脏组织中的表达，而且对心脏靶器官损伤也有保护作用=Klotho可以抑制心肌肥大，减少肥大心肌细胞，进而减少心脏体重指数。此外，Klotho可以抑制心脏胶原纤维增生即抑制心肌纤维化。研究证实AAV介导的Klotho基因转导可以长时表达，为长期有效的心脏保护提供了一条新的干预途径。有益效果本实验研究结果显不,通过Klotho基因转导可以控制SHR大鼠血压进一步升高，减轻高血压心脏病心脏损害即可以保护SHR大鼠心脏，至少可以持续12周，Klotho腺相关病毒完全可以作为制备治疗SHR大鼠高血压心脏病药物对高血压及相关心血管疾病进行治疗。
图I为尾静脉收缩压与大鼠周龄坐标图；图2为4组大鼠心脏切片荧光显微镜图；图3为4组大鼠心脏组织的琼脂糖凝胶电泳图；图4为4组大鼠心脏常规HE染色显微镜图；图5为4组大鼠Masson三色染色显微镜图；图6为4组大鼠心脏体重坐标图；图7为4组大鼠心脏蛋白条带灰度值图；图8为4组大鼠心脏蛋白表达定量坐标图。
具体实施例方式实施例一、Klotho腺相关病毒制备I.材料I. I实验动物5周龄昆明小鼠购自重庆医科大学实验动物中心。I. 2 试剂RNAiso Plus>PrimeScript RT reagent Kit、加A尾试剂盒、pMD19_T vector>EcoR
I和 Xho I 限制性内切酶 Premix Taq Version 2. O, SYBR Premix Ex Taq II,DLIOOODNAMaker购自大连宝生物公司；pAAV-IRES_HnGFP质粒为Stratagene公司产品。2 方法参照本课题组研究，用RNAiso Plus从新鲜小鼠肾脏组织提取总RNA，用PrimeScript RT reagent Kit按使用说明，用Klotho特异性下游引物替代随机引物和Oligo dT引物逆转录。从NCBI GenBank获取小鼠Klotho mRNA编码区序列(ΝΜ_013823· 2),设计小鼠Klotho特异性引物上游 5' ccggaattcatgctagcccg 3',下游51 gccgctcgagttacttataacttctc 31。取 2 μ L 逆转录产物，25 μ L 体系扩增小鼠 Klotho编码序列。PCR产物加A尾后连接至pMD19-T载体，EcoR I and Xho I双酶切及宝生物公司基因测序鉴定。EcoR I and Xho I双酶切pMD19_T. mKL,获得小鼠Klotho全长cDNA,亚克隆至pAAV-IRES-HnGFP多克隆位点EcoR I和Xho I之间，获得质粒AAV. mKL (pAAV. mKL)，经测序鉴定pAAV. mKL符合实验要求。pAAV. mkl与RC、Phelpr质粒共转染AAV-293细胞包装 AAV. EGFP rAAV. mKL ;pAAV_IRES-HnGFP 空质粒与 RC、Phelpr 质粒共转染 AAV-293 细胞包装rAAV. EGFP，rAAV. EGFP做为空白对照病毒。3 结果成功获得rAAV. mKL和rAAV. EGFP，测定rAAV. mKL和rAAV. EGFP的滴度分别为3 X 10nvg/ml 和 I X 1012vg/ml。两次基因测序结果与NCBI GenBank中小鼠Klotho mRNA蛋白编码区(⑶S)序列(编号NM—013823. 2，网址http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/NM—013823. 2)完全
—致111-3155，atg起始，taa结束。测序结果与以下序列一致。I gataatcatt gctcgtgggg cggcgggagc gggggtgggc accgcgtagggagggcggcg61 gggcgcgggc atataggggc gcggcgcggt gccctcccgg ctcccgcagc atg ctagccc121 gcgcccctcc tcgccgcccg ccgcggctgg tgctgctccg tttgctgttgctgcatctgc181 tgctgctcgc cctgcgcgcc cgctgcctga gcgctgagcc gggtcagggcgcgcagacct 241 gggctcgctt cgcgcgcgct cctgccccag aggccgctgg cctcctccacgacaccttcc301 ccgacggttt cctctgggcg gtaggcagcg ccgcctatca gaccgagggcggctggcgac361 agcacggcaa aggcgcgtcc atctgggaca ctttcaccca tcactctggggcggccccgt421 ccgactcccc gatcgtcgtg gcgccgtcgg gtgccccgtc gcctcccctgtcctccactg481 gagatgtggc cagcgatagt tacaacaacg tctaccgcga cacagaggggctgcgcgaac541 tgggggtcac ccactaccgc ttctccatat cgtgggcgcg ggtgctccccaatggcaccg601 cgggcactcc caaccgcgag gggctgcgct actaccggcg gctgctggagcggctgcggg661 agctgggcgt gcagccggtg gttaccctgt accattggga cctgccacagcgcctgcagg721 acacctatgg cggatgggcc aatcgcgccc tggccgacca tttcagggattatgccgagc781 tctgcttccg ccacttcggt ggtcaggtca agtactggat caccattgacaacccctacg841 tggtggcctg gcacgggtat gccaccgggc gcctggcccc gggcgtgaggggcagctcca901 ggctcgggta cctggttgcc cacaacctac ttttggctca tgccaaagtctggcatctct961 acaacacctc tttccgcccc acacagggag gccgggtgtc tatcgccttaagctcccatt1021 ggatcaatcc tcgaagaatg actgactata atatcagaga atgccagaagtctcttgact1081 ttgtgctagg ctggtttgcc aaacccatat ttattgatgg cgactacccagagagtatga1141 agaacaacct ctcgtctctt ctgcctgatt ttactgaatc tgagaagaggctcatcagag1201 gaactgctga cttttttgct ctctccttcg gaccaacctt gagctttcagctattggacc1261 ctaacatgaa gttccgccaa ttggagtctc ccaacctgag gcagcttctgtcttggatag1321 atctggaata taaccaccct ccaatattta ttgtggaaaa tggctggtttgtctcgggaa1381 ccaccaaaag ggatgatgcc aaatatatgt attatctcaa gaagttcataatggaaacct1441 taaaagcaat cagactggat ggggtcgacg tcattgggta caccgcgtggtcgctcatgg1501 acggtttcga gtggcatagg ggctacagca tccggcgagg actcttctacgttgactttc1561 tgagtcagga caaggagctg ttgccaaagt cttcggcctt gttctaccaaaagctgatag1621 aggacaatgg ctttcctcct ttacctgaaa accagcccct tgaagggacatttccctgtg1681 actttgcttg gggagttgtt gacaactacg ttcaagtgga cactactctctctcagttta1741 ctgacccgaa tgtctatctg tgggatgtgc atcacagtaa gaggcttattaaagtagacg1801 gggttgtagc caagaagaga aaaccttact gtgttgattt ctctgccatccggcctcaga1861 taaccttact tcgagaaatg cgggtcaccc actttcgctt ctccctggactgggccctga1921 tcttgcctct gggtaaccag acccaagtga accacacggt tctgcacttctaccgctgca1981 tgatcagcga gctggtgcac gccaacatca ctccagtggt ggccctgtggcagccagcag2041 ccccgcacca aggcctgcca catgcccttg caaaacatgg ggcctgggagaacccgcaca2101 ctgctctggc gtttgcagac tacgcaaacc tgtgttttaa agagttgggtcactgggtca
2161 atctctggat caccatgaac gagccaaacacacggaacatgacctatcgtgccgggcacc2221 acctcctgag agcccatgcc ttggcttggcatctgtacgatgacaagtttagggcggctc2281 agaaaggcaa aatatccatc gccttgcaggctgactggatagaaccggcctgccctttct2341 ctcaaaatga caaagaagtg gccgagagagttttggaatttgatataggctggctggcag2401 agcctatttt tggttccgga gattatccacgtgtgatgagggactggctgaaccaaaaaa2461 acaattttct tttgccctat ttcaccgaagatgaaaaaaagctagtccggggttcctttg2521 acttcctggc ggtgagtcat tacaccaccattctggtagactgggaaaaggaggatccga
2581 tgaaatacaa cgattacttg gaggtacaggagatgactgacatcacatggctcaactctc2641 ccagtcaggt ggcagtggtg ccttgggggctgcgcaaagtgctcaactggctaaggttca2701 agtacggaga cctcccgatg tatgtgacagccaatggaatcgatgatgacccccacgccg2761 agcaagactc actgaggatc tattatattaagaattatgtgaatgaggctctgaaagcct2821 acgtgttgga cgacatcaac ctttgtggctactttgcgtattcacttagtgatcgctcag2881 ctcccaagtc tggcttttat cgatatgctgcgaatcagtttgagcccaaaccatctatga2941 aacattacag gaaaattatt gacagcaatggcttcctgggttctggaacactgggaaggt3001 tttgtccaga agaatacact gtgtgcaccgaatgtggattttttcaaacccggaagtctt3061 tgctggtctt catctcgttt cttgtttttacttttattatttctcttgctctcatttttc3121 actactccaa gaaaggccag agaagttata ag taa tgtga acgtctgcctggccattcgc。
权利要求
1. Klotho腺相关病毒在制备治疗SHR大鼠高血压心脏病药物中的应用。
全文摘要
本发明为一种Klotho腺相关病毒在制备治疗SHR大鼠高血压心脏病药物中的应用。通过实验研究结果显示，通过Klotho基因转导可以控制SHR大鼠血压进一步升高，减轻高血压心脏病心脏损害即可以保护SHR大鼠心脏，至少可以持续12周，Klotho腺相关病毒完全可以作为制备治疗SHR大鼠高血压心脏病药物对高血压及相关心血管疾病进行治疗。
文档编号A61K48/00GK102886051SQ20121027913
公开日2013年1月23日 申请日期2012年8月8日 优先权日2012年8月8日
发明者马厚勋, 李宝善, 王艳娇, 吴平, 邓明洪, 罗玉梅, 李运奎, 周婷, 杨秋晨, 邓小琴 申请人:重庆医科大学附属第一医院