专利名称：一种蔓越莓提取物的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物有效成分提取技术领域，特别涉及一种蔓越莓提取物。
背景技术：
蔓越莓,又称蔓越橘、小红莓,英文名Cranberry,是杜醇花科越橘属红莓苔子亚属(学名0XyCOCCOS，又名毛蒿豆亚属)的俗称，此亚属的物种均为常绿灌木，主要生长在北半球的凉爽地带酸性泥炭土壤中。花深粉红色，总状花序。红色浆果可做水果食用。目前在北美的一些地区被大量种植。蔓越莓植物所含的化学成分复杂，具有多种生物活性。近年来，国内外学者分别从不同角度对其药理作用、生物活性及临床方面作了较为深入的研究，为其临床疗效提供了
依据。但是至今仍未发现其具有诱导细胞凋亡、抗过敏和抗炎作用的蔓越莓提取物。
发明内容
本发明的所要解决的技术问题是提供一种蔓越莓提取物，本发明采用逆流提取法，能够更加充分地对蔓越莓中原花青素成分进行提取，与现有技术方法相比具有原料处理更加容易、节省溶剂、提取效率高、成本低等特点，适于工业化生产产；并且本发明的蔓越莓提取物中具有诱导嗜酸粒细胞凋亡并且活化MBP激酶的物质。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是一种蔓越莓提取物，采用逆流提取法进行提取得到，所述逆流提取法包括以下步骤步骤(I):取蔓越莓果实，粉碎；和步骤(2):加入PH值为I. 0-3. O、质量分数为65-85%的乙醇溶液，30-60°C下逆流提取4-6h，过滤后合并收集滤液，浓缩，得所述蔓越莓提取物。本文所述“浓缩”为低温真空浓缩，其温度控制在1(T20°C。浓缩的程度是使所得最终的蔓越莓提取物的固形物含量控制在其重量的0. 49Tl%。进一步的，在所述步骤(2)中，加入PH值为I. O、质量分数为85%乙醇水溶液，在40°C下逆流提取6小时。进一步的，所述蔓越莓提取物具有诱导细胞凋亡的活性。进一步的，所述蔓越莓提取物具有诱导嗜酸粒细胞凋亡的活性。进一步的，所述蔓越莓提取物能够活化MBP激酶。本发明与现有技术相比，具有如下优点( I)本发明采用逆流提取法，能够更加充分地对原花青素成分进行提取，与现有技术方法相比具有原料处理更加容易、节省溶剂、提取效率高、成本低等特点，适于工业化生产。(2)本发明蔓越莓提取物在减少嗜酸粒细胞方面显示出较好的效果，即其可以有效地用于预防和治疗由过多的嗜酸粒细胞而引起的各种疾病。(3)本发明蔓越莓提取物可以作为细胞凋亡诱导剂、抗过敏、抗炎和保健食品。
图I是乙醇的质量百分数(％)与浸出液原花青素含量(mg)的关系图。图2是接触时间(h)与浸出液原花青素含量(mg)的关系图。图3是温度(V )与浸出液原花青素含量(mg)的关系图。图4是本发明一种蔓越莓提取物的制备方法使用的装置的示意图。
具体实施例方式一、提取工艺条件考察I、浸出条件实验(I)乙醇质量百分数对原花青素化合物浸出效果的影响工业生产中，由于原料中常含有一定的水分，乙醇经循环使用后亦含有一定水分，乙醇质量百分数对原花青素化合物的浸出存在很大的影响，故以不同质量百分数乙醇水溶液对原花青素物质进行浸出实验，以原花青素含量跟踪分析。在乙醇质量百分数对从原料中浸出原花青素的影响实验中，分别取5份原料，每份50. 00g，进行实验，以不同质量百分数、PH值为I. 0的乙醇水溶液各200. OOml,浸提6h，比较所得原花青素的量；同时比较乙醇质量百分数对浸出后的固液分离及渣含量的影响，其结果如图I和表I所示。由图I可知，相同条件下，浸出能力强弱依次为85% >80% >75% >70% >65%，因此，选择85%乙醇水溶液作为浸出剂。(2)接触时间对原花青素化合物浸出效果的影响分别取6份原料，每份50. 00g，各加入质量百分数为85%、PH值为I. 0的乙醇水溶液200. OOml进行浸出，接触时间分别为lh，2h，3h，4h，5h，6h，其浸出结果如图2所示。由图2可知，室温下(26°C )，浸出时间为6h，浸出反应基本达到平衡；延长浸出时间，浸出率基本不变。(3)温度对原花青素化合物浸出效果的影响分别取6份原料粉料，每份50. 00g，各加入200. OOml质量百分数为75%、PH值为1.0的乙醇水溶液，在不同的温度下浸出，浸出时间为2h，取样检测浸出液中蔓越莓原花青素含量，结果如图3所示。由图3可知，随着浸出温度的增加，原花青素的浸出率也相应的增加；在温度达到40°C时，增加温度，原花青素的浸出率增加趋于缓慢。2、四段逆流渗漉法(工艺简图见图4)共安装了 6根￠25. 4mmX IOOOmrn玻璃括口管，做为四段逆流渗漉浸出实验的浸出器(浸出柱)，其中四根运行，两根做周转用。每根柱中装入150. OOg蔓越莓原料粉碎料(简称原料，以下同)，用计量泵将浸出剂(65-85%乙醇水溶液)，以约5ml mirT1的流量打入第一根浸出柱中，乙醇液以约Icn^mirT1速度渗漉，当第一柱流出450ml浸出液后，将第一柱与第二柱接通。计量泵打入的新浸出剂经第一柱，流出进入第二柱；与上相同，当第二柱流出450ml黑色浸出液后，将第二柱与第三柱接通。依此类推，等到第四根柱流出450ml流出液后，将第四根柱与第五根柱接通。同时，将计量泵出口管从第一柱上端移至第二柱上端与第二柱接通(第一柱从系统中撤出)。此时，新的浸出剂，经计量泵进第二柱，经三、四、五柱后，从第五柱流出，同样取450ml浸出液；此后，新浸出剂进第三柱，从第六柱出浸出液。依此类推，不断循环进行四段逆流渗漉浸出实验至达到浸出平衡。本试验中第九柱开始至第十二柱止，这四根柱流出的浸出液已近似平衡时的浸出液，故当新的浸出剂从从第九根柱进，经十、^ 、十二柱，而从第十二柱下流出450ml黑色浸出液后,停止浸出试验。将九、十、十一、十二柱流出的浸出液取样，送检，测定原花青素的含量。(注柱体均为循环使用，九，十，十一，十二仅代表标号，不具实际意义)3、四段逆流渗漉浸出试验结果如上述的逆流法进行试验。每份样品为150. Og,以85%乙醇为浸出液，40°C下浸提6h，液固比为5。取九、十、十一、十二柱流出的浸出液进行测定，其结果如表I所示。表I四段逆流渗漉浸出试验结果·
浸出柱号浸出液体积浸出原花青素总殳浸出原花青素总量手均值得率(平均值) ' (ml)(mg)fmg)(%)
945(107424
H)4 S ().074.6974,47().()5
11450.074.38
12450.074.58从表I可知，曼越毒中原花青素平均得率为0. 05% (以原花青素计)。原花青素检测方法为采用HPLC法检测,标准品为儿茶素,色谱柱为C18亲脂性柱,流动相A项为0. 4%磷酸、B项为95%甲醇和5% 0. 4%磷酸，流量为lml/min，进样量为10^1，柱温为30°C，检测波长为280nm ；洗脱梯度为0-38min :79% A21 % B 到 35% A65% B 的双溶剂线性梯度；38-60min 35% A65% B ；60_70min :100%的甲醇。二、实施例以下通过具体实施例，对本发明作进一步的详细描述。实施例I :取蔓越莓果实500g，粉碎，加入PH值为3. O、质量分数为65%的乙醇溶液2. 5L，30°C下逆流提取4h，过滤后合并收集滤液，浓缩，得蔓越莓提取物61.56g。所述“浓缩”为低温真空浓缩，其温度控制在15°C。浓缩的程度是使所得最终的蔓越莓提取物的固形物含量控制在其重量的0. 5%。实施例2 取蔓越莓果实500g，粉碎，加入PH值为I. O、质量分数为75%的乙醇溶液2. 5L，40°C下逆流提取6h，过滤后合并收集滤液，浓缩，得蔓越莓提取物62.37g。所述“浓缩”为低温真空浓缩，其温度控制在15°C。浓缩的程度是使所得最终的蔓越莓提取物的固形物含量控制在其重量的0. 5%。实施例3 取蔓越莓果实500g，粉碎，加入PH值为I. O、质量分数为85%的乙醇溶液2. 5L，60°C下逆流提取6h，过滤后合并收集滤液，浓缩，得蔓越莓提取物61. 47g。所述“浓缩”为低温真空浓缩，其温度控制在15°C。浓缩的程度是使所得最终的蔓越莓提取物的固形物含量控制在其重量的0. 5%。实施例4嗜酸粒细胞性细胞凋亡诱导试验和MBP激酶活性实验嗜酸粒细胞性细胞凋亡诱导试验试验根据Vermes等的方法(Journal of
Immunological Methodsl84卷39-51页1995年)进行。使嗜酸粒细胞性细胞HL-60细胞悬浮于RPMI1640培养基中，细胞浓度为1-3 X IO6细胞/ml。向该细胞悬浮液500 中添加被检测物质(上述实施例1-3中最后收集得到的蔓越莓提取物)或培养基，使蔓越莓提取物在细胞悬浮液中的浓度为100 u g/ml，在37°C、5%C02的条件下培养6小时或24小时。离心洗净后，加入磷脂酞结合蛋白(Annexin) V缓冲液,然后添加5ul磷脂酞结合蛋白V-FITC。通过流动血细胞计数法，以磷脂酞结合蛋白V阳性细胞作为细胞凋亡诱导细胞，用相对总细胞数的百分比评价。MBP激酶活性试验试验根据De Souza等的方法(Blood99卷3432-3438页2002年)进行。将嗜酸粒细胞性细胞HL-60细胞悬浮于RPMI1640培养基，细胞浓度为1_3X IO6细胞/ml。该细胞悬浮液500 ill中添加被检测物质或培养基，使浓度为IOOii g/ml，在37 °C、5%C02的条件下培养6小时或24小时。离心洗净后，添加可溶解缓冲液，溶解细胞，使用含有MBP5mg/ml的凝胶进行电泳。凝胶经脱变性、再变性处理后，用32P-ATP标记，实施3小时的磷酸化反应。凝胶干燥后，使用图象分析仪解析放射活性。在36kDa生长出标记带时,记做MBP激酶活化阳性(+)。蔓越莓提取物在HL-60细胞中观察到了浓度依赖性的细胞凋亡诱导。另外进行凝胶MBP激酶分析(In-gel MBP kinase assay)时，蔓越莓提取物激活36kDa MBP激酶。以上结果提示。蔓越莓提取物对嗜酸粒细胞能诱导细胞凋亡，该细胞凋亡与36kDa MBP激酶有关。由此推断蔓越莓提取物中含有可以用于抗嗜酸粒细胞性炎症作用药物的成分。所得结果如下表2所示确认实施例2和3具有强的细胞凋亡诱导活性，并伴有MBP激酶的活化。表 权利要求
1.一种蔓越莓提取物，其特征在于，采用逆流提取法进行提取得到，所述逆流提取法包括以下步骤 步骤(I):取蔓越莓果实，粉碎；和 步骤(2):加入PH值为I. 0-3. O、质量分数为65-85%的乙醇溶液，30-60°C下逆流提取4_6h，过滤后合并收集滤液，浓缩，得所述蔓越莓提取物。
2.如权利要求I所述一种蔓越莓提取物，其特征在于，在所述步骤(2)中，加入PH值为I.O、质量分数为85%乙醇水溶液，在40°C下逆流提取6小时。
3.如权利要求I或2所述的一种蔓越莓提取物，其特征在于，所述蔓越莓提取物具有诱导细胞凋亡的活性。
4.如权利要求I或2所述的一种蔓越莓提取物，其特征在于，所述蔓越莓提取物具有诱导嗜酸粒细胞凋亡的活性。
5.如权利要求I或2所述的一种蔓越莓提取物，其特征在于，所述蔓越莓提取物能够活化MBP激酶。
全文摘要
本发明公开了一种蔓越莓提取物，其特征在于，采用逆流提取法进行提取得到，所述逆流提取法包括以下步骤步骤(1)取蔓越莓果实，粉碎；和步骤(2)加入PH值为1.0-3.0、质量分数为65-85%的乙醇溶液，30-60℃下逆流提取4-6h，过滤后合并收集滤液，浓缩，得所述蔓越莓提取物。本发明采用逆流提取法，能够更加充分地对蔓越莓中原花青素成分进行提取，与现有技术方法相比具有原料处理更加容易、节省溶剂、提取效率高、成本低等特点，适于工业化生产产；并且本发明的蔓越莓提取物中具有诱导嗜酸粒细胞凋亡并且活化MBP激酶的物质。
文档编号A61K36/45GK102784189SQ201210279489
公开日2012年11月21日 申请日期2012年8月8日 优先权日2012年8月8日
发明者季进军 申请人:宁波杰顺生物科技有限公司