专利名称：防治胰岛素抵抗和糖尿病的方法和试剂的制作方法
防治胰岛素抵抗和糖尿病的方法和试剂技术领域
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及防治胰岛素抵抗和糖尿病的方法和试剂。
背景技术：
糖尿病主要分为I型糖尿病和2型糖尿病两种类型。I型糖尿病是由于自身免疫系统紊乱，引起胰腺中胰岛β细胞受损，导致胰岛素分泌不足。2型糖尿病是糖尿病的主要形式，90%以上的糖尿病患者属于2型糖尿病，其特点是胰岛素刺激的靶组织出现胰岛素抵抗症状，即胰岛素相对不足。在正常情况下，胰岛β细胞分泌的胰岛素对于血糖水平的动态平衡起着重要作用。胰岛素通过促进肌肉组织和脂肪组织对葡萄糖的吸收，同时抑制肝脏组织的糖异生来降低血糖水平。而在胰岛素抵抗情况下，正常浓度的胰岛素不能达到预期的降糖效果，机体不得不产生更多的胰岛素来补偿，从而维持血糖浓度的稳定。当β细胞分泌的胰岛素不能满足这种补偿时，就会引起高血糖症，表现为糖耐量和空腹血糖值异常，继而引发胰岛β细胞凋亡，最终发展成为2型糖尿病。可见，胰岛素抵抗在2型糖尿病的发生发展中起了至关重要的作用。
胰岛素抵抗与肥胖及静坐的生活方式密切相关，是一种涉及多个组织器官的代谢疾病，其发病机制目前还不是完全清楚。已有的研究认为，血液循环中的激素、细胞因子、来源于脂肪等组织的脂肪酸和葡萄糖等能源物质与胰岛素抵抗密切相关。例如，脂肪组织中脂质的过度积累，能诱导脂肪细胞本身对胰岛素抑制的脂解作用的抵抗，这将导致脂肪组织释放出更多脂肪酸和甘油进入血液循环，继而诱导肌肉和肝脏的胰岛素抵抗。2型糖尿病的动物模型中，自发突变型肥胖症的纯合子小鼠(ob/ob和db/db)被公认为具有重要价值， 它们会在出生后2-8周先后表现出高胰岛素血症、高血糖和β细胞功能下降等与人类2型糖尿病相似的症状。
在分子水平，胰岛素通过胰岛素信号通路行使其生物功能。胰岛素信号通路由一个复杂、高度整合的网络组成。概括起来，胰岛素结合到胰岛素受体后，激发其受体酪氨酸激酶活性，使其磷酸化胰岛素受体底物(Insulin receptor substrate, IRS),激活的IRS随后通过PI3K/Akt通路发挥其代谢调控作用。目前研究表明，胰岛素抵抗可能通过以下几种机制抑制胰岛素信号通路①蛋白水平的下调，包括促进通路中重要蛋白质的降解，抑制其转录或转录后翻译。例如有报道显示SREBP-Ic能抑制IRS-2的转录，导致IRS-2蛋白水平下调。②蛋白质的翻译后修饰，抑制其活性。例如胰岛素受体和IRS能被PKC、S6K1、ERK、 JNK及ΙΚΚβ等激酶磷酸化丝氨酸残基，抑制胰岛素信号的转导。③促进胰岛素信号通路抑制酶的酶活或表达，包括酪氨酸磷酸酶ΡΤΡ1Β、ΡΙΡ3的磷酸酶PTEN、SHIP等。④信号通路中的重要蛋白和其抑制蛋白的结合。例如炎性细胞因子IL-6等能上调细胞因子信号通路的抑制子(Suppressor of cytokine signaling, S0CS)的蛋白表达,SOCS能结合到胰岛素受体抑制信号转导。
阿尔茨海默病(AD)是老年痴呆病中最常见的一种，是一种以记忆能力减退、认知功能障碍、行为异常为特征的慢性进行性神经退行性疾病，其发病率随年龄增大而增加。
AD的主要病理特征是大脑内出现以沉积的Αβ为中心的淀粉样斑块(amyloid plaque),或称老年斑(senile plaque)和由高度磷酸化的微管相关蛋白tau蛋白形成的神经丝缠结(neurofibrillary tangle)。Αβ是细胞一种正常的代谢产物，能在其受体帮助下透过血脑屏障。健康人血液和脑脊液中的Αβ浓度处于一种平衡状态。大量证据支持Αβ是AD的主要致病因子。目前被广泛接受的淀粉样蛋白级联假说(Amyloid cascade hypothesis)认为,Αβ在AD的发生、发展中起着主导作用，脑中Aβ的生成和清除的失衡， 使得Αβ在脑中积累，进而导致神经元和其突触功能的损伤，最终造成认知的损害。
目前认为A β主要由脑中的神经元产生。A β由APP经过β -分泌酶和Y -分泌酶酶解形成。由于Y-分泌酶的切割位点不同，主要产生两种形式Αβ40和Αβ42。Αβ42 的聚集能力较强因而毒性也较大。APP和Y-分泌酶分布都相对广泛，在很多组织中都有表达。分泌酶最初认为只在脑中的神经元高表达，但近来有研究显示，分泌酶也表达在神经胶质细胞和其它外周的细胞，例如脂肪细胞和肝细胞，这提示外周组织也可能产生 A β ο
研究表明，在外周组织能检测到Αβ。Joachim等最先报道在AD病人的血管、皮肤、皮下组织和肠等非神经组织检测到Αβ沉积，在一部分正常的老年个体中也能在非神经组织检测到Αβ的沉积。Lee等报道在正常人皮下脂肪和内脏脂肪中都能检测到Αβ的沉积。另外，包涵体肌炎的病灶处也能检测到Αβ。这些沉积的Αβ，可能是由脑中产生，再经过循环系统运送到外周，也有可能是由外周的细胞产生的。但目前的研究都只检测到外周Αβ，而它们有什么功能还不清楚，血浆中的Αβ浓度本身也并不适合作为AD的生物标记 (Liu, J. K. , et al. , J Alzheimers Dis. 2010; 20 (4) : 1233-42.)。
除Αβ外目前还发现多种淀粉样蛋白(Amyloid protein),其在各种器官和组织的异常沉积会造成系列病变。截至2010年，已知的淀粉样蛋白有27种，其中公认为与糖尿病有密切关系的是胰岛淀粉样多肽(IAPP)，IAPP是胰岛β细胞分泌的一种正常产物，含37 个氨基酸，但与Αβ在序列和剪切机制上大为不同。尸体病理解剖检验发现，90%的2型糖尿病患者胰岛中有IAPP沉积，伴β细胞数量减少，且胰岛淀粉样变性程度与糖尿病的病变程度一致，说明IAPP与2型糖尿病发病相关。人源IAPP可诱导β细胞凋亡，且二者呈剂量相关性。转入人源IAPP基因的纯合子肥胖小鼠在高糖、高脂饮食、生长激素或糖皮质激素处理后胰岛内很快出现大量IAPP变性沉积，β细胞凋亡水平大于复制水平，数量下降， 最终发展为2型糖尿病。这些证据表明，IAPP在胰岛中变性沉积，导致β细胞凋亡，数量减少是2型糖尿病致病机制之一。但没有在先证据显示，同为淀粉样蛋白的Αβ在胰岛素的靶组织如肝脏等能诱导2型糖尿病的另一特征胰岛素抵抗，或者A β在2型糖尿病的发病中具有与IAPP类似的功能。
流行病学的研究显示，糖尿病患者相对于正常人有高约两倍的罹患AD的风险。虽然其机理目前仍不清楚，有人认为糖尿病能影响A β的代谢。例如Ho等报道在AD模型小鼠中用高脂诱导胰岛素抵抗能显著增加Αβ 40和Αβ 42的生成，同时脑中老年斑的沉积加剧，学习记忆能力的损害也恶化。Cao等报道在AD模型小鼠中用糖水诱导胰岛素抵抗，脑中老年斑的沉积也加剧，主要是由于脑中沉积的A β 42增高了约2倍，水迷宫实验结果也显示了学习记忆能力的损害恶化。但是Takeda等的研究表明，AD模型小鼠与2型糖尿病模型小鼠杂交的后代，显示学习记忆能力的损害发生加剧，脑中Αβ的总量没有变化，而是显示脑血管出现炎性并伴随淀粉样血管病变。
综上，尽管现有技术中对于糖尿病或胰岛素抵抗与AD的关系有过研究，然而还没有明确的、可信的结论，在机理也不明确。因此，本领域还需要进一步地研究Aβ与糖尿病或胰岛素抵抗的相关性，并找到有用的、适于药物开发的靶点。发明内容
本发明的目的在于提供防治胰岛素抵抗和糖尿病的方法和试剂。
在本发明的第一方面，提供抑制JAK2/STAT3-S0CS-1信号通路激活，抑制JAK2/ STAT3-S0CS-1信号通路蛋白表达或活性，或抑制淀粉样蛋白β的表达或活性的抑制剂的用途，用于制备防治或缓解胰岛素抵抗或糖尿病的药物。
在另一优选例中，所述的JAK2/STAT3-S0CS-1信号通路蛋白包括JAK2蛋白， STAT3蛋白或S0CS-1蛋白。
在另一优选例中，所述的JAK2/STAT3-S0CS-1信号通路激活是淀粉样蛋白 β (Αβ)导致的JAK2/STAT3-S0CS-1信号通路激活。
在另一优选例中，所述的淀粉样蛋白β (Αβ)包括全长的淀粉样蛋白β，或其蛋白片段。更佳地，所述的蛋白片段选自Αβ40、Αβ42、Αβ 25-35等。
在另一优选例中，所述的抑制剂包括(但不限于)
特异性干扰JAK2/STAT3-S0CS-1信号通路蛋白表达的干扰分子(如小干扰RNA分子或反义核苷酸)；或
特异性与JAK2/STAT3-S0CS-1信号通路蛋白结合的结合分子(如抗体或配体)； 或
抑制JAK2 的 AG490 ;或
特异性干扰淀粉样蛋白β或其前体蛋白表达的干扰分子(如小干扰RNA分子或反义核苷酸)；或
特异性与淀粉样蛋白β结合的结合分子(如抗体或配体)；或
β -分泌酶抑制剂、Y -分泌酶抑制剂和调节剂或抗淀粉样蛋白聚集剂。
在另一优选例中，所述的干扰分子是siRNA，其序列选自SEQ ID N0:2_SEQ IDNO:7 的一种或多种。
在另一优选例中，所述的干扰分子具有以下结构
Seq 正向-X-Seq 反向；
其中，核苷酸序列如SEQ ID NO: 36所示;Seq反向为与Seqra互补的序列；
X为位于Seq1自和Seq反自之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq1自和Seq反向不互补。
在另一优选例中，所述的干扰分子是腺病毒表达载体。
在另一优选例中，所述的干扰分子可形成以下结构
权利要求
1.抑制JAK2/STAT3-S0CS-1信号通路激活，抑制JAK2/STAT3-S0CS-1信号通路蛋白表达或活性，或抑制淀粉样蛋白β的表达或活性的抑制剂的用途，用于制备防治或缓解胰岛素抵抗或糖尿病的药物。
2.如权利要求I所述的用途，其特征在于，所述的抑制剂包括特异性干扰JAK2/STAT3-S0CS-1信号通路蛋白表达的干扰分子；或特异性与JAK2/STAT3-S0CS-1信号通路蛋白结合的结合分子；或抑制JAK2的AG490 ;或特异性干扰淀粉样蛋白β或其前体蛋白表达的干扰分子；或特异性与淀粉样蛋白β结合的结合分子；或β-分泌酶抑制剂、Y -分泌酶抑制剂和调节剂或抗淀粉样蛋白聚集剂。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的干扰分子是SiRNA，其序列选自SEQ ID N0:2-SEQ ID NO:7的一种或多种；或所述的干扰分子具有以下结构Seq正向Ueq反向；其中，核苷酸序列如SEQ ID N0:36所示;Seq反向为与Seqra互补的序列；X为位于Seq1自和Seq反自之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq1自和Seqfi自不互补。
4.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的结合分子是抗淀粉样蛋白β的抗体或抑制淀粉样蛋白β的合成、剪切、聚集和沉积的分子。
5.如权利要求I或4所述的用途，其特征在于，所述的抗体包括3F5，BA27，BC05，1H3， 6C8, Solanezumab, Bapineuzumab, MABT5102A,Ponezumab,Intravenous Immunoglobulin。
6.抑制JAK2/STAT3-S0CS-1信号通路激活或抑制JAK2/STAT3-S0CS-1信号通路蛋白表达或活性的抑制剂，其是siRNA，其序列选自SEQ ID N0:2_SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:36。
7.淀粉样蛋白β用作检测胰岛素抵抗或糖尿病的血液标志物的用途。
8.一种特异性识别淀粉样蛋白β的试剂的用途，用于制备检测胰岛素抵抗或糖尿病的试剂或试剂盒。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的特异性识别淀粉样蛋白β的试剂选自特异性结合淀粉样蛋白β的结合分子；特异性扩增淀粉样蛋白β或其前体蛋白的编码基因或切割前体蛋白的蛋白酶的编码基因的引物；或特异性识别淀粉样蛋白β或其前体蛋白的编码基因或切割前体蛋白的蛋白酶的编码基因的探针。
10.一种检测血液中胰岛素抵抗或糖尿病的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有特异性识别淀粉样蛋白β的试剂。
全文摘要
本发明涉及防治胰岛素抵抗和糖尿病的方法和试剂。首次证实了胰岛素抵抗或糖尿病患者外周血中淀粉样蛋白或蛋白片段含量显著上升，为胰岛素抵抗和2型糖尿病的诊断提供了新的途径。并且，本发明还首次揭示了淀粉样蛋白β(Aβ)能诱导外周组织产生胰岛素抵抗，其是通过激活JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路而实现的。因此，可以以JAK2/STAT3-SOCS-1通路或其通路蛋白作为筛选药物的靶点，研究防治或缓解胰岛素抵抗或糖尿病的药物。
文档编号A61K45/00GK102921007SQ20121028280
公开日2013年2月13日 申请日期2012年8月9日 优先权日2011年8月9日
发明者翟琦巍, 张一 , 乐颖影 申请人:中国科学院上海生命科学研究院