专利名称：表达巢蛋白的肾源干细胞或祖细胞的制作方法
技术领域：
本发明属于干细胞与组织工程领域，涉及一种表达巢蛋白(Nestin)的肾源干细胞或祖细胞(Nestin+RSPCs)、分离该肾源干/祖细胞的方法，以及该肾源干/祖细胞的用途。本发明特别涉及巢蛋白-绿色突光蛋白(Nestin-Green Fluorescent Protein,Nestin-GPF)转基因小鼠通过流式分选技术分离Nestin+肾源干/祖细胞(Nestin+RSPCs)，并验证其自我更新能力和增殖能力；随后细胞移植到肾缺血损伤动物模型体内，鉴定Nestin+RSPCs在体内的分化特性和损伤修复的功能。
背景技术：
肾源干细胞的研究起步较晚，对其生物学特性的认识有很大局限性。近几年研究报道了成体肾组织分离具有干/祖细胞潜能细胞的方法，但大多数属于回顾性研究，分离得到的细胞很难鉴定是否真正的干细胞。有研究报道发现肾小管(tubules)和肾乳头间质(interstitium of renalpapilla)中的一些低更新率(slow-cycling)的细胞,存在某些干/祖细胞特性(Hong KU,Reynolds SDj Giangreco A, et al. Clara cell secretory protein-expressing cellsof the airway neuroepithelial body microenvironment include a label-retainingsubset and are critical for epithelial renewal after progenitor cell depletion.Am J Respir Cell Mol Biol. 2001. 24: 671-681 )，但后来被证实它们只是具有某些干/ 袓细胞特性的已分化的细胞(Maeshima A, Yamashita S，Nojima Y. Identificationof renal progenitor-like tubular cells that participate in the regenerationprocesses of the kidney. J Am Soc Nephrol. 2003. 14: 3138-3146)。该类细胞与肾其它不同更新速率细胞的分化程度没有区别(Bruno S，Bussolati B，Grange C，et al. Isolation and characterization of resident mesenchymal stem cells inhuman glomeruli. Stem Cells Dev. 2009. 18: 867-880)，并且成体分化了的上皮细胞(epithelial cell)也有形成克隆和自我更新的能力(Cicero SAj Johnson D，ReyntjensS， et al. Cells previously identified as retinal stem cells are pigmentedciliary epithelial cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2009. 106:6685-6690)。 ImaiN等在特定培养条件下获的类似干细胞的细胞，但该细胞却不能修复缺血再灌注损伤的肾组织(Imai N，Hishikawa K，Marumo Tj et al. Inhibition of histone deacetylaseactivates side population cells in kidney and partially reverses chronic renalinjury. Stem Cells. 2007. 25: 2469-2475)。Thiery JP 等研究提不，Imai N 等得到的细胞可能是由于体外培养导致上皮细胞产生上皮-间质转化(epithelial-mesenchymaltransitions, EMT)而产生的，这种状态下的细胞表现出某些袓细胞样的特性，但不产生相应的袓细胞功能(Thiery JPj Acloque H，Huang RYj et al. Epithelial-mesenchymaltransitions in development and disease. Cell. 2009.139: 871-890)。有研究人员利用⑶133、⑶24、干细胞抗原-I (Sca-I)和受体酪氨酸蛋白激酶等表面标志物，在肾间质(interstitium)和肾小球囊的泌尿极中分离鉴定干细胞(Lazzeri Ej CrescioliC， Ronconi E, et al. Regenerative potential of embryonic renal multipotentprogenitors in acute renal failure. J Am Soc Nephrol. 2007. 18: 3128-3138)。但进一步研究发现，这些表面标志物在分化的上皮细胞中均有很高的表达。因而，利用这些非特异性的表面标志物得到的细胞，很难区分是真正的干细胞，还是有某些祖细胞特性的上皮细胞，或者是间质/基质细胞(mesenchymal stromal cell)。因而，利用特异表面标志是寻找分离肾源干细胞的最有效方法。Dekel B等比较人胚胎肾细胞和小儿肾恶性Wilms’瘤的表达谱，鉴定的胚胎肾源干细胞表面标志基因包括神经细胞粘附分子I (neural cell adhesion molecule I, NCAM1, CD56),聚唾液酸神经细胞粘附分子 I (poly-sialated neural cell adhesion molecule 1PSA-NCAM1)，FZD7, FZD2, DLKl, ACVRIIB 和 NTRK2 (Dekel B, Metsuyanim S, Schmidt-Ott KM, etal. Multiple imprinted and sternness genes provide a link between normal andtumor progenitor cells of the developing human kidney. Cancer Res. 2006. 66:6040-6049)。Metsuyanim S等根据Dekel B等的研究结果,利用NCAMl成功定位并分离了人胚胎的肾干细胞(Metsuyanim S，Harari-Steinberg O, Buzhor E, et al. Expressionof stem cell markers in the human fetal kidney. Plos One. 2009. 4: e6709)o 然而，由于本发明人对成体肾源干细胞生物学特性以及基因表达特点认识的匮乏，迄今仍无法利用特异表面标志物对其进行直接高效的分离。这也限制了成体肾源干细胞在肾疾病治疗研究的开展。巢蛋白(Nestin)作为中间丝蛋白家族成员之一，在胚胎发育过程中广泛表达，最早的表达时间出现在胚胎发育第7. 5天(E7. 5)的单细胞神经外胚层上(Kawaguchi A,Miyata T, Sawamoto K, et al. Nestin-EGFP transgenic mice: visualization ofthe self-renewal and multipotency of CNS stem cells. Mol Cell Neurosci. 2001.17: 259-273),随后在体节前胚胎中胚层(presomitic mesoderm)和肌节层(myotomelayer)也有表达(Sejersen T, Lendahl U. Transient expression of the intermediatefilament nestin during skeletal muscle development. J Cell Sci. 1993. 106:1291-1300)。但是，巢蛋白表达最丰富的区域仍然是在神经系统。此外，巢蛋白在中肾间质细胞、胰腺上皮祖细胞、视网膜米勒细胞、新生血管内皮细胞、肝卵圆细胞等组织细胞中也有分布。在早期胚胎发育阶段，大多数巢蛋白阳性细胞代表了增殖旺盛的干/祖细胞群。而这群细胞一旦开始分化或者停止分裂，巢蛋白表达开始下降并逐渐被其它组织特异性的中间丝蛋白所取代。巢蛋白阳性细胞在成体组织中也有一定分布，例如中枢神经系统的侧脑室下区(Subventricular zone, SVZ)、海马齿状回颗粒细胞层下区(HippocampalSubgranual Zone, SGZ)、嗅球神经上皮祖细胞等，在一定条件下这些细胞可以增殖、分化和迁移，具有成体干细胞的特性。值得关注的是，在组织损伤发生时，可以观察到部分巢蛋白阴性细胞可重新表达巢蛋白并进入细胞增殖和迁移状态。值得关注的是，有研究发现在小鼠肾发育过程中有巢蛋白表达，而且出生后小鼠肾中仍有一定量的巢蛋白表达，这提示巢蛋白可能是寻找肾源性干细胞的重要标志物(Chen J, Boyle S，Zhao M, etal.Differential expression of the intermediate filament protein nestin duringrenal development and its localization in adult podocytes. J Am Soc Nephrol.2006 . 17:1283-1291)。目前尚未见研究报道以巢蛋白为标记物分离和鉴定肾源干细胞的相关研究。
发明内容
本发明的第一个方面是提供一种分离肾源干细胞或祖细胞的方法，其中所述细胞表达巢蛋白。该方法是基于所述细胞产生受巢蛋白增强子控制的绿色荧光蛋白来分离获得的。本发明所述的分离肾源干细胞或祖细胞的方法，其中所述细胞表达巢蛋白，所述方法包括提供一种以C57BL/6为遗传背景的巢蛋白-绿色荧光蛋白(Nestin-GFP)转基因小鼠模型；饲养所述转基因小鼠模型的小鼠至I周龄或以上，分离小鼠肾，用胶原酶IV和胰蛋白酶消化，过滤消化后的细胞悬液，筛除肾结缔组织、肾小管和细胞团块，获得单个细胞，所述细胞产生受巢蛋白增强子控制的增强型绿色突光蛋白(Enhanced Green FluorescentProtein，EGFP);将上述单个细胞通过流式细胞仪进行分选，用C57B/6小鼠细胞做阴性对照细胞，收集表达绿色荧光蛋白的荧光强度是阴性对照细胞的荧光强度的10倍或以上的细胞，从而分离出所述表达巢蛋白的肾源干细胞或祖细胞。 根据本发明所述的方法的进一步特征，所述巢蛋白-绿色荧光蛋白转基因小鼠模型包含以巢蛋白启动子驱动表达增强型绿色荧光蛋白的质粒，其中，包括上游翻译位点的启动子区域长2. 5kb，包含第二个外显子3’到第三个内含子5’的增强子区域长I. 8kb，多聚腺苷化位点与增强型绿色荧光蛋白cDNA连接。根据本发明所述的方法的进一步特征，该方法进一步包括在培养基中培养所述分离的肾源干细胞或祖细胞以致产生自我更新和增殖的细胞。经实验表明，单纯在DMEM/F12基础培养基培养分离的Nestin+RSPCs细胞不增殖，容易分化，在第四代细胞即不能传代。因此，本发明在DMEM/F12基础培养基的基础上进行改良，优选的培养基为无血清培养基，其成分包括DMEM/F12基础培养基、10X浓度的1%(v/v) N-2添加物、5 X浓度的2% (v/v) B27增殖添加物、25ng/ml纯化EGF、40ng/ml牛重组bFGF和10U/ml青霉素/链霉素。实验表明，将该培养用于本发明所述的肾源干/祖细胞的培养，细胞增殖效果非常好。本发明的第二个方面是提供一种分离的肾源干细胞或祖细胞，所述细胞表达巢蛋白。所述细胞是基于巢蛋白的表达来分离的，所述细胞产生受巢蛋白增强子控制的绿色荧光蛋白。本发明所述的分离的肾源干细胞或祖细胞，是根据本发明所述的上述方法分离的肾源干细胞或祖细胞。本发明进一步提供了所述的肾源干细胞或祖细胞在培养基中培养获得的自我更新和增殖的细胞。所述的培养基优选为无血清培养基，其成分包括DMEM/F12基础培养基、IOX浓度的1% &八)^2添加物、5父浓度的2% (v/v)B27增殖添加物、25ng/ml纯化EGF、40ng/ml牛重组bFGF和10U/ml青霉素/链霉素。本发明的第三个方面是提供了所述的肾源干细胞或祖细胞的用途，具体是将本发明所述的分离的肾源干细胞或祖细胞用于制备治疗肾损伤修复的组合物，以及进一步将本发明所述的在培养基中培养获得的自我更新和增殖的细胞用于制备治疗肾损伤修复的组合物。本发明不仅提供了小鼠成体肾的取材和消化方法，以及基于绿色荧光蛋白(GFP)表达情况的流式分选方法，而且提供了表达巢蛋白(Nestin)的肾源干细胞或祖细胞(Nestin+RSPCs)的培养方法和条件。本发明将Nestin+ RSPCs与早期干细胞和重编程特异标志0ct4、特异性胚胎抗原-I、特异性胚胎抗原_4，生后肾原基细胞特异标志成对盒蛋白，细胞增殖相关特异标志PH3和内皮细胞特异标志CD31的抗体，分别与巢蛋白的抗体对克隆球进行免疫荧光染色，从分子水平分析巢蛋白阳性细胞的自我更新能力和细胞干性的分子生物学特点，从而对该种干细胞进行鉴定。本发明还进行了 Nestin+ RSPCs的克隆形成实验,结果表明，Nestin+ RSPCs呈球状克隆生长，并有较强的GFP荧光。本发明还进行了 CCK8细胞增殖实验，用CCK8试剂盒检测细胞增殖情况。本发明进一步利用小鼠缺血性肾损伤模型，观察Nestin+ RSPCs在小鼠肾损伤组 织中的修复作用。所述小鼠肾损伤模型是用C57小鼠为实验对象，对其进行肾缺血再灌注的方式造模，并静脉注射Nestin+ RSPCs，利用测血肌酐浓度、冰冻切片免疫荧光染色的方法来观察Nestin+ RSPCs移植对小鼠肾损伤的修复作用。
在这里，仅通过与实施例结合附图的方式来描述本发明的内容，与以下的附图有关
图I是出生7天的Nestin-GFP小鼠肾中Nestin+ RSPCs细胞流式分选图。左图为对照C57小鼠阳性率，右图为Nestin-GFP小鼠分选阳性率。图2是通过荧光显微镜观察到的流式分选后的细胞图，左边为白光图，右边为荧光图。PO代表原代细胞，P20代表第20代细胞。图3是Nestin+RSPCs球巢蛋白与干细胞增殖重新编程有关的标志物的免疫荧光共染色图。第一排为巢蛋白阳性细胞；第二排为干细胞增殖重新编程有关的各种标志物的单独染色，其中肾病蛋白(Nephrin),波形蛋白(Vimentin),特异性胚胎抗原-I (SSEA-I),特异性胚胎抗原-4 (SSEA-4)和碱性磷酸酶3 (PH3)表达阳性，受体酪氨酸蛋白激酶(c-kit),成对盒蛋白2 (Pax2)和0ct4不表达；第三排为共染色(Merged)
图4是Nestin+RSPCs克隆球形成情况图。其中，图4A显示I X IO3个单细胞形成克隆球的数量，直径为40-79um的克隆球将近400个，直径为80_150um的克隆球将近100个。图4B显示克隆球的形态。图5是CCK - 8细胞增殖活性检测结果图。图6是肾缺血再灌注后血肌酐的测定图。图7是肾损伤组织中PKH26阳性细胞与巢蛋白，肾病蛋白和波形蛋白免疫荧光染色图。第一排为PKH26阳性细胞表达巢蛋白；第二排为PKH26阳性细胞表达肾病蛋白；第三排为PKH26阳性细胞表达波形蛋白。
具体实施例方式实施例一小鼠成体肾巢蛋白阳性细胞的分离本实施例选择从小鼠成体肾中分离获得表达巢蛋白(Nestin)的肾源干细胞或祖细胞，也就是，从小鼠成体肾中分离巢蛋白阳性细胞。巢蛋白-GFP小鼠本实验的转基因小鼠是来自于日本京都大学医学院生理学教研室构建的特异性标记巢蛋白-绿色荧光蛋白(Nestin-GFP)转基因小鼠模型(YamaguchiMj Saito H，Suzuki Mj Mori K. Visualization of neurogenesis in the centralnervous system using nestin promoter—GFP transgenic mice. Neuroreport 2000.11:1991-1996.)。但也可选用其他巢蛋白-GFP小鼠，它们的共同特征是包含以Nestin启动子驱动表达GFP的质粒，包括上游的翻译位点的启动子区域长2. 5kb，包含第二个外显子3’到第三个内含子5’的增强子区域长I. 8kb，多聚腺苷化位点与增强型GFP (EGFP) cDNA连接。本发明对该动物模型的研究发现，不同年龄小鼠肾中存在巢蛋白阳性细胞(即表达受巢蛋白增强子控制的绿色荧光蛋白)，主要分布在肾小球区。本发明进一步利用流式分选技术，成功分离得到肾源性的Nestin+细胞。分离方法具体如下
a.选取巢蛋白-GFP小鼠和C57BL/6J小鼠，分离I周龄小鼠肾，用生理盐水冲洗干净。将肾剪碎，加胶原酶IV (collagenase IV)和DNase I，37°C震荡水浴消化30分钟，转移上清液，下层组织中加O. 05%胰蛋白酶(trysin)，37°C震荡水浴消化10分钟。 b.消化后的细胞悬液分别用100 μ m和40 μ m的滤网进行过滤，筛除肾结缔组织、肾小管和细胞团块等，最终获得单个细胞。c. C57BL/6J小鼠的细胞做阴性对照，通过流式细胞仪分选获得巢蛋白阳性细胞。巢蛋白-GFP小鼠细胞的荧光强度是C57BL/6J小鼠细胞10倍或以上的细胞收集，即为目的Nestin+ 细胞。图I是出生7天的巢蛋白-GFP小鼠肾中Nestin+ RSPCs细胞流式分选图。如图I所示，用C57B/6小鼠细胞做阴性对照细胞，巢蛋白-GFP小鼠肾中细胞荧光强度是对照的10倍或以上时收集细胞，为Nestin+ RSPCs，从图I中可以看出阳性率为4.67%。如图2所示，通过荧光显微镜可观察到，流式分选后的细胞在未完全贴壁时有强GFP荧光，被视为原代细胞(PO )，细胞在无血清培养基中，可以克隆球的形态悬浮生长，在第20代的细胞中仍具有较强的GFP荧光(P20)，在图2中，左边为白光图，右边为荧光图。其他哺乳类动物的表达巢蛋白(Nestin)的肾源干细胞或祖细胞，也可根据本实施例所揭示的原理和方法来获得。实施例二 巢蛋白阳性细胞自我更新和增殖能力的鉴定
本实施例是在实施例一的基础上，对所获得的巢蛋白阳性细胞自我更新和增殖能力进行鉴定。a.巢蛋白阳性细胞自我更新能力的鉴定
将从小鼠成体肾中分选获得的单个巢蛋白阳性细胞分别置于6孔板的各个单孔中进行培养。培养液成分包括DMEM/F12基础培养基，1%&八別-2添加物(10\浓度)，2%(v/v)B27增殖添加物(5X浓度)(25ng/ml),牛重组bFGF (40ng/ml)和青霉素/链霉素(10U/ml)。观察细胞克隆的形成情况，当细胞克隆大小达到50um以上、密度达到70%，用370C的O. 05%胰蛋白酶-EDTA对细胞消化30秒，进行传代。应用免疫荧光染色的方法进行包括0ct4、Nanog、特异性胚胎抗原_1、特异性胚胎抗原_4、成对盒蛋白和⑶24、⑶133、⑶31、增殖相关标志物PH3和肾小球足细胞标志物肾病蛋白，波形蛋白以及肾干细胞标志物成对盒蛋白等表面标志物的染色，细胞切片用4%多聚甲醛固20 min, PBS缓冲液中浸洗5 minX3次，O. 2% Triton-X-IOO穿透30分钟，正常山羊血清室温孵育20分钟，加一抗，湿化盒中4°C过夜，加二抗，室温孵育I小时，荧光显微镜观察结果。图3显示了 Nestin+RSPCs球巢蛋白与上述干细胞增殖重新编程有关的标志物的免疫荧光共染色结果。结果表明，表达巢蛋白的Nestin+RSPCs球与肾病蛋白、波形蛋白、SSEAl和SSEA4共定位，但并没有⑶31、成对盒蛋白、受体酪氨酸蛋白激酶和0ct4的表达。b.巢蛋白阳性细胞增殖能力的鉴定
将CCK8试剂按1:10的比例加入细胞培养基，37°C继续培养细胞两小时后用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值。绘制细胞生长曲线，计算DT值。图4显示了 Nestin+RSPCs克隆球形成情况。如图4所示,Nestin+RSPCs可以形成较均一的克隆球，图4A显示I X IO3个细胞形成克隆球的数量，图4B显示克隆球的形态。结果表明，Nestin+RSPCs具有较强的自我更新能力。图5显示了 CCK-8细胞增殖活性检测结果。结果表明，Nestin+RSPCs具有较强的细胞增殖能力。实施例三观察巢蛋白阳性细胞在肾损伤修复中作用
a.小鼠缺血性肾损伤模型的建立
将28只小鼠根据处理不同随机分为正常对照组(n=4)、缺血组(n=12)、细胞组(n=12).小鼠术前8 12 h禁食，应用三溴乙醇溶液(200 mg/kg)经腹腔内注射麻醉。实验组沿腹正中线做I. 5^2. O cm的切口，逐层分离皮肤、腹膜，进入腹腔，将肠道推向一侧，找到肾蒂后用无损伤微型动脉夹迅速阻断左右肾蒂，可见肾脏由鲜红变紫黑色，表示夹闭成功，持续夹闭肾蒂15分钟，去除动脉夹，恢复血流灌注，可见肾脏迅速由紫黑色变为鲜红，恢复原来颜色，术毕分层缝合关闭腹腔。术后小鼠于24 29°C的环境保暖，补充水与饲料。术中应用生理盐水使小鼠保持充分的水化。正常对照组同法打开腹并找到肾蒂，但不夹闭肾蒂。细胞组在手术第二天，静脉缓慢注射PKH26标记的2X IO6细胞/200 μ I PBS,注射一次。缺血组和正常对照组静脉给予200 μ I PBS。术后分别在O天，2天，4天，7天采血，取肾组织进行组织化学分析。b.分别于零、二、四、七天时取出外周血，分离血清，观察两组小鼠的肾功能的生化指标，检测血肌酐(Cr)浓度，评判肾功能的恢复程度；同时分离相应时间段小鼠的肾，进行冰冻切片，观察其组织，特别是肾小球的损伤修复情况。通过免疫荧光染色检测PKH26阳性细胞与肾病蛋白、波形蛋白、CD31和巢蛋白共定位情况，观察在体内PKH26阳性细胞的分化与修复中起到的作用。图6显示了肾缺血再灌注后血肌酐的测定结果。如图6所示，损伤引发血清肌酐水平明显增加，在第4天达高峰，而Nestin+RSPCs移植组小鼠血清肌酐水平明显降低。图7显示了肾损伤组织中PKH26阳性细胞与巢蛋白，肾病蛋白和波形蛋白免疫荧光染色结果。如图7所示，PKH26阳性细胞与足细胞标记物肾病蛋白和Vementi共表达，而不与巢蛋白共定位，说明Nestin+RSPCs细胞在体内可分化为足细胞。本实施例的实验结果表明，对于产生肾损伤修复的疾病来说，可以考虑将本发明 所述的表达巢蛋白的肾源干细胞或祖细胞用于干细胞治疗，具体是将包含本发明所述的细胞的组合物用于制备治疗肾损伤修复的组合物。
权利要求
1.一种分离肾源干细胞或祖细胞的方法，其中所述细胞表达巢蛋白，所述方法包括 提供一种以C57BL/6为遗传背景的巢蛋白-绿色荧光蛋白转基因小鼠模型； 饲养所述转基因小鼠模型的小鼠至I周龄或以上，分离小鼠肾，用胶原酶IV和胰蛋白酶消化，过滤消化后的细胞悬液，筛除肾结缔组织、肾小管和细胞团块，获得单个细胞，所述细胞产生受巢蛋白增强子控制的增强型绿色荧光蛋白； 将上述单个细胞通过流式细胞仪进行分选，用C57B/6小鼠细胞做阴性对照细胞，收集表达绿色荧光蛋白的荧光强度是阴性对照细胞的荧光强度的10倍或以上的细胞，从而分离出所述表达巢蛋白的肾源干细胞或祖细胞。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述巢蛋白-绿色荧光蛋白转基因小鼠模型包含以巢蛋白启动子驱动表达增强型绿色荧光蛋白的质粒，其中，包括上游翻译位点的启动子区域长2. 5kb，包含第二个外显子3’到第三个内含子5’的增强子区域长1.8kb，多聚腺苷化位点与增强型绿色荧光蛋白cDNA连接。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于进一步包括在培养基中培养所述分离的肾源干细胞或祖细胞以致产生自我更新和增殖的细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的培养基为无血清培养基，其成分包括DMEM/F12基础培养基、IOX浓度的1% (v/v) N-2添加物、5X浓度的2% (v/v)B27增殖添加物、25ng/ml纯化EGF、40ng/ml牛重组bFGF和10U/ml青霉素/链霉素。
5.根据权利要求I所述的方法分离的肾源干细胞或祖细胞，所述细胞表达巢蛋白。
6.根据权利要求5所述的肾源干细胞或祖细胞进一步在培养基中培养获得的自我更新和增殖的细胞。
7.根据权利要求6所述的细胞，其特征在于，所述的培养基为无血清培养基，其成分包括DMEM/F12基础培养基、IOX浓度的1% (v/v) N-2添加物、5X浓度的2% (v/v)B27增殖添加物、25ng/ml纯化EGF、40ng/ml牛重组bFGF和10U/ml青霉素/链霉素。
8.根据权利要求5所述的分离的肾源干细胞或祖细胞在制备治疗肾损伤修复的组合物中的用途。
9.根据权利要求6所述的细胞在制备治疗肾损伤修复的组合物中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种表达巢蛋白的肾源干细胞或祖细胞、分离该细胞的方法，以及该细胞的用途。本发明所述的方法包括提供一种以C57BL/6为遗传背景的巢蛋白-绿色荧光蛋白转基因小鼠模型；饲养小鼠至1周龄或以上，分离肾，用胶原酶IV和胰蛋白酶消化，过滤消化后的细胞悬液，筛除肾结缔组织、肾小管和细胞团块，获得单个细胞；通过流式细胞仪进行分选，收集表达绿色荧光蛋白的荧光强度是阴性对照细胞的荧光强度的10倍或以上的细胞，从而分离出所述表达巢蛋白的肾源干细胞或祖细胞。本发明提供了根据上述方法分离的肾源干/祖细胞，以及进一步在培养基中培养获得的自我更新和增殖的细胞，并且提供了将这些细胞用于制备治疗肾损伤修复的组合物的用途。
文档编号A61K35/23GK102864124SQ201210331539
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月10日 优先权日2012年9月10日
发明者项鹏, 姜美花 申请人:广东江源生物科技有限公司