专利名称：包含潜伏感染阶段期间所表达的抗原的结核疫苗的制作方法
技术领域：
本发明公开了饥饿诱导的抗原，或者基于饥饿期间诱导的得自结核分枝杆菌的多肽的免疫原性多肽的新的融合多肽，一种或多种本发明的融合多肽或者饥饿诱导的抗原用于制备用来给予人/动物的免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物的用途，以及这样的免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物。
背景技术：
由结核分枝杆菌(M. tuberculosis)所引起的人肺结核是一个严重的全球性健康问题，根据WHO的数据，其造成每年约3百万人死亡。在二十世纪60年代和70年代期间，全世界新的肺结核(TB)发生病例已经下降，但在近年中，部分由于AIDS的来临和结核分枝杆菌的耐多元药物(multidrug)菌株的出现,这种趋势已经发生明显的改变。目前唯一可供用于临床使用的疫苗是BCG(卡介苗)，该疫苗的效力仍然有些争议。BCG通常在TB动物模型中诱导高水平的获得抗性，并在人群中给予抗传播类型结核如脑脊膜炎(meningitis)和粟粒性结核保护。当给予低龄孩子BCG时,它在几年之内能起到抗结核的保护作用，但之后效力发生变化。比较不同的对照实验(controlled trial),揭示BCG在成人中的保护效力在无效至80%保护的效力范围内显著地变化。这使得开发新的和改良的抗结核分枝杆菌的疫苗成为非常迫切的事情，其已经被世界卫生组织(WHO)给予非常高的优先权。已经有了很多对保护性分枝杆菌物质进行阐述的尝试，不同的研究者已经报导了在试验性接种疫苗后获得提高的抗性。结核分枝杆菌具有并分泌一些潜在的适合用于产生新的结核分枝杆菌疫苗的蛋白质。对候选分子的搜索主要集中在从区分的细菌(dividingbacteria)中释放出来的蛋白质。尽管大量这种蛋白质已经被表征，但其中只有少数在动物模型中被证实作为亚单元疫苗诱导保护性的免疫应答，其中最显著的是ESAT-6和Ag85B(Brandt等，2000 )。然而，还没有获得具有BCG潜力或加强BCG预防接种人中的能力的特定长期保护性免疫应答的示例(demonstration)。充其量使用BCG的BCG加强没有效果[Colditz，1994]。尽管与单独使用BCG相比没有什么显著的改善，但在近交小鼠品系中用Ag85a进行BCG加强免疫后还是会引起一定的保护作用(Brooks等IAI2001 ;W00204018)。由于BCG需要区分和分泌蛋白质以诱导保护性的免疫应答，故强化免疫效果的缺乏主要是由于环境分枝杆菌的敏感性或来自初次BCG接种的剩余免疫应答。两者均引起抗BCG的急性免疫应答和由此对生长的快速抑制，以及对BCG的清除。结核分枝杆菌传染的过程主要经历三个时期。在急性期，细菌在器官中增殖，直到免疫应答增强。特定敏化的CD4T淋巴细胞介导传染的调节，最重要的介导分子似乎是Y干扰素(IFN-γ)。细菌负荷(bacterial load)开始减少，在细菌负荷稳定维持在低水平时形成潜伏期。在这个时期，结核分枝杆菌由活跃的増殖趋于休眠，基本上转变为非复制状态并维持在肉芽肿内。在某些情况下，传染趋于再活化时期，休眠的细菌重新开始复制。已经掲示出结核分枝杆菌从初次传染到潜伏期的转变伴随着基因表达的变化(Honer zuBentrup, 2001 )0在免疫应答的抗原-特异性方面也有可能发生变化，因为从活跃的复制到休眠的转变期间，细菌调节着基因表达。控制潜伏性感染免疫应答的所有特性和引起再活化的因素基本上是未知的。然而，有一些证据证明与主导细胞(dominant cell)类型中的转变有夫。虽然CD4T细胞对急性期的感染控制是必要的和足够的，但研究掲示CD8T细胞反应在潜伏期更为重要。1998年，Cole等公开了结核分枝杆菌的完整基因组序列，并预测其中存在大约4000个开放阅读框，披露了核苷酸序列和推定的蛋白序列(Cole等，1998)。然而重要地是，这个序列信息不能用于预测该DNA是否在体内被翻译和表达成蛋白。众所周知，结核分枝杆菌的ー些基因在模拟潜伏期的条件下是正调节的。然而，这些是潜伏性感染期间总的基因表达的有限子集。另外，本领域的技术人员将会容易地理解，ー种基因的表达还不足以使其成为ー种好的候选疫苗。确定ー种蛋白在结核分枝杆菌潜伏感染期间是否被免疫系统识别的唯一方法是制备出这种给定的蛋白，并按照这里描述的适当试验对该蛋白进行测试。ー些蛋白质特别重要并有潜力成为晚期抗原(潜伏感染期间识别的抗原)，这 是由于在感染后，它们大部分表达了相对较长的时间，而此时免疫系统已经发动了最初的适应性防御，并且环境也变得对分枝杆菌更加敌对。模拟低氧压カ的体外缺氧的培养条件此前已显露与这方面相关，现在已经被用于分析基因表达方面的变化。已经发现在这些条件下可以诱导或者显著地正调节ー些抗原，例如16kDa抗原α -晶体蛋白(a -crystalin)(Sherman，2001 )、Rv2660c 和 Rv2659c (Betts, 2002)(我们自己的申请)。另ー个有可能特别感兴趣的环境刺激是饥饿，其设计反映出营养物被局限于肉芽肿内(潜伏感染的位点)以及在饥饿下基因表达产物被正调节，因此有可能成为特别感兴趣的感染潜伏期中的抗原靶。在超过20000种已知在初次感染期表达并作为疫苗被测试的抗原中，少于半打的抗原表现出明显的潜力。迄今为止仅有ー种抗原已经被证实具有作为治疗性疫苗的所有潜质(Lowrie，1999)。然而这个疫苗仅在作为DNA疫苗施用时起作用并被证明是有争议的，因为有其它组声称使用该方案接种诱导了非特异性的保护甚至使疾病恶化(Turner，2000)。相反，如在提供的实施例中所显示的，使用最佳识别的接种疫苗技术，本发明描述的融合多肽可以被掺入疫苗。进ー步地，由于TB疫苗不引起杀菌免疫性而是控制感染在亚临床(subclinical)水平(从而导致随后的潜伏感染的确立)，故本发明描述了将具有预防和治疗活性的成分联合的多期(multiphase)疫苗。常规的预防接种后,初次免疫应答的逃逸(evasion)和潜伏性疾病的随后发展或许至少部分地是由于侵袭细菌的抗原轮廓(antigenic profile)的改变。因此，用与潜伏TB相关的抗原进行接种，应该能预防或者減少潜伏感染的形成，并因此将混合了细菌在第一对数生长期和潜伏发病期间所表达的抗原的疫苗，用作预防性疫苗时，能改善长期的免疫性。由于这种多期疫苗显然也可以作为有效的治疗疫苗，因此可以解决将要接受未来TB疫苗的第三世界的大部分人可能已经被潜伏地感染的问题。发明概述本发明涉及用于预防或/和治疗由结核分枝杆菌复合群(complex)(结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌等)的物种所引起的感染的免疫原性組合物、疫苗或者药物组合物(包括加强接种疫苗和多期疫苗)，该免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物含有饥饿诱导的抗原或包含一种或多种饥饿诱导的結核分枝杆菌抗原的融合多肽，其中融合多肽的単元是结核分枝杆菌抗原。本发明还涉及像这样的融合多肽和编码该融合多肽的核酸序列。更进一歩地，本发明涉及通过合成或重组制备的短重叠(多个)肽或者长重叠(多个)肽或者不重叠的(多个)肽的用途。更进一歩地，本发明涉及饥饿诱导的抗原或者本发明的融合多肽序列或者核酸序列用于制备所述免疫原性組合物、疫苗或者药物组合物的用途，以及由该方法制备的疫苗或者药物组合物。进ー步地，本发明涉及包含本发明饥饿诱导的抗原或融合多肽序列或核酸序列的疫苗用于制备所述免疫原性組合物、疫苗或者药物组合物的用途，所述疫苗同时与BCG给予，也可以与BCG混合或者在不同的位置或以不同的途径单独给药。更进一歩地，本发明涉及包含饥饿诱导的抗原或者融合多肽序列或者核酸序列的疫苗作为BCG加强剂的用途。进ー步地，通过包含天然感染期间早期和晩期均表达的抗原，疫苗将引起两步的免疫应答以使得免疫系统抵御病原体，无论该病原体带有包括潜伏期间的某时间点上的何种最有效表位。发明细述 本发明公开了包含饥饿诱导的抗原或者含有一种或多种饥饿诱导的抗原的融合多肽的免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物。这些饥饿诱导(在饥饿期间超过6. 5倍正调节或者与饥饿诱导的基因遗传性相连)抗原的氨基酸和核酸序列如以下所示出现在序列表中
权利要求
1.一种免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物，其包含多肽RV1284或含有与RV1284至少80%序列同一性的免疫原性多肽。
2.根据权利要求I所述的免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物，用于预防疾病用途、治疗用途、多期疫苗，或者用于加强在先卡介苗接种的免疫性。
3.根据权利要求广2中任一项所述的免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物，其是皮内给药、经皮给药、皮下给药、肌内给药或粘膜给药。
4.根据权利要求f3中任一项所述的免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物在制备用于预防疾病用途、治疗用途、或者前述两者、多期疫苗的药物、或者用于加强在先卡介苗接种的免疫性的药物中的应用。
5.根据权利要求f3中任一项所述的免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物在制备用于治疗由毒性分枝杆菌引起的活跃性结核病或者潜伏性结核病的药物中的应用，或者在制备用于加强在先卡介苗接种的免疫性的药物中的应用。
6.根据权利要求广3中任一项所述的免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物在制备用于预防毒性分枝杆菌的感染的药物中的应用。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其中，所述分枝杆菌选自结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、麻风分枝杆菌或溃瘍分枝杆菌。
8.根据权利要求f3中任一项所述的免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物在制备用于抗分枝杆菌的预防接种、加强接种、多期接种或者治疗性接种的组合物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其中，所述分枝杆菌选自结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、牛分枝杆菌、麻风分枝杆菌或溃疡分枝杆菌。
全文摘要
本发明涉及包含潜伏感染阶段期间所表达的抗原的结核疫苗，具体涉及一种免疫原性组合物、疫苗或者药物组合物，其包含多肽Rv1284或含有与Rv1284至少80%序列同一性的免疫原性多肽。
文档编号A61K39/04GK102836425SQ201210332759
公开日2012年12月26日 申请日期2006年6月20日 优先权日2005年6月23日
发明者克劳斯·奥高, 卡里纳·温斯波-伦德贝里, 彼得·安德森 申请人:国家血清研究中心