专利名称：流脑多糖-蛋白质缀合疫苗及制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别是涉及ー种流脑多糖-蛋白质缀合疫苗及制备方法。
背景技术：
奈瑟氏脑膜炎球菌(Neisserza meningitides)是全球细菌性脑膜炎的主要原因。在最近的30年中，地方性脑膜炎球菌疾病的发病率在发展中国家为每100,000人中10到25人(Reido，F.X.等人，1995)。病例致死率在10到20%之间。病原脑膜炎球菌被多糖荚膜所包被，附着在生物体外膜表面。基于荚膜多糖的免疫学特异性，已经鉴定出13种不同的脑膜炎球菌血清型。这13个血清型中的5个引起了大部分脑膜炎球菌疾病；它们包括血清型A、B、C、W-135和Y。血清型A引超大部分流行性疾病。血清型B、C和Y引起大多数地方性疾病和疾病的区域性爆发。人类是唯一已知的脑膜炎奈瑟氏球菌的天然携帯者。脑膜炎球菌可被持续携带几个月，脑膜炎球菌通过直接接触或通过空气飞沫传播。对入侵的脑膜炎球菌的宿主防御依赖于补体介导的溶菌作用，而在其中发挥作用的血清抗体大部分是针对荚膜多糖的。基于脑膜炎球菌多糖的疫苗已经被描述，其引起针对荚膜多糖的免疫应答。这些抗体可以对血清型特异性脑膜炎球菌引起补体介导的溶菌作用。脑膜炎球菌多糖疫苗显示对儿童和成人有效，但对于婴儿和幼儿其效能有限。对年幼群体，此多糖的后继给药产生弱加强应答或无加强应答。脑膜炎球菌多糖疫苗的保护期不能持续很长，并且据估计对成人和大于4岁的儿童而言为3到5年。对I至4岁的儿童而言保护期少于3年。多糖能与主要组织相容性复合体分子結合，而这是抗原呈递和刺激T-辅助淋巴细胞的前提条件，也即它们是非T。细胞依赖性抗原。多糖能够不需T-辅助淋巴细胞的辅助而刺激B淋巴细胞产生抗体。由于对B淋巴细胞的非T-细胞依赖性刺激，这些抗原免疫后缺乏记忆诱导。在成人体内，多糖抗原可以产生非常有效的非T-细胞依赖性应答，但在婴儿和幼儿的不成熟免疫系统中这些非T-细胞依赖性应答却很弱。非T-细胞依赖性多糖抗原可以通过将多糖共价连接至蛋白质分子(“载体”或“载体蛋白质”)上而转变为T-细胞依赖性抗原。与缀合疫苗的多糖组分结合的B细胞可以被肽特异的T辅助细胞激活，所述肽为缀合的载体蛋白质的一部分。对载体蛋白质的T-辅助细胞应答可以增加针对多糖的抗体的产生。目前国外已经上市的流脑结合疫苗中，W-135型及Y型流脑多糖均在片段化后采用连接接头与载体蛋白进行连接(如中国专利CN100556459C描述的以TT为载体和W性或Y型寡糖结合的疫苗，中国专利CN1889975A描述的以CRM197为载体和W型或Y型寡糖结合的疫苗)。由于载体蛋白和天然多糖并没有活性基团可以反应，连接接头上是一种有机分子，一端具有和蛋白反应的化学活性，另一端具体和多糖连接的化学活性。已经被采用的接头有己ニ酸ニ酰肼，1，4-丁ニ胺，N-こ酰高半胱氨酸硫内酯等，有些接头和蛋白或多糖连接反应之前，必须对蛋白和多糖进行衍生。这些接头一般是惰性的，也就是不会与人体蛋白质或其他大分子在生理条件下产生化学反应，而且在结合疫苗的制备エ艺中也会被尽量的去除，但是这些接头存在于结合产物中，可引起人体免疫系统来针对这些接头产生免疫反应，会产生相应的无效抗体。目前用于流脑多糖结合疫苗不但采用接头的エ艺，而且需要对多糖进行解聚以降低其分子量，但是在这个过程中，多糖会有损失，从而增加了产品的总体生产成本。中国专利CN1889975A描述的以CRM197为载体和W型或Y型寡糖结合的疫苗的分子量一般在200KD以下。一般认为大分子量的免疫原会产生更强的免疫反应。因此有必要开发出分子量较大的免疫缀合物。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种流脑多糖-蛋白质缀合疫苗。本发明的第二个目的是提供一种流脑多糖-蛋白质缀合疫苗的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种多价流脑多糖-蛋白质缀合疫苗。本发明的技术方案概述如下流脑多糖-蛋白质缀合疫苗，其特征是用[S-C]n-[N_P]m表不,其中S表不一种流脑多糖分子，C表示该流脑多糖分子中引入醛基的C原子，P表示CRM197蛋白分子，N表示该蛋白分子中赖氨酸侧链氨基的N原子；n和m大于I且小于10 ;所述S的分子量>100KD ；所述[S-C]n-[N-P]m的平均分子量在200KD到2000KD之间，所述流脑多糖为W-135型和Y型流脑多糖中的至少ー种，所述流脑多糖为奈瑟氏脑膜炎球菌荚膜多糖的简称。所述[S-C]n-[N-P]m的分子量优选为200KD到700KD之间。多价流脑多糖-蛋白质缀合疫苗，包括上述流脑多糖-蛋白质缀合疫苗，还包括A型流脑多糖与载体蛋白结合的缀合物和C型流脑多糖与载体蛋白结合的缀合物。流脑多糖-蛋白质缀合疫苗的制备方法，包括如下步骤(I)将纯化的流脑多糖溶解于水或こ酸钠缓冲液中，按照流脑多糖与高碘酸盐质量比为I :0. 02-0.2的比例加入高碘酸盐，活化反应后，超滤或透析去除未反应的高碘酸盐，使流脑多糖上相邻的双羟基被氧化成醛基，得到引入醛基的活化流脑多糖；(2)按质量比为0. 5-3 1的比例将步骤(I)获得的活化流脑多糖和纯化的载体蛋白CRM197溶解于磷酸盐缓冲液中，调节pH到6. 5和8. 5之间，以氰基硼氢化钠醛基摩尔比5-10的比例加入氰基硼氢化钠，进行还原胺反应18-48小时，使活化流脑多糖的醛基和CRM197表面赖氨酸上的氨基产生联接；(3)加入硼氢化钠封闭活化流脑多糖上未反应的醛基；通过硫铵沉淀或者疏水柱层析的方法去除未与载体蛋白CRM197产生反应的游离流脑多糖，得到纯化的流脑多糖-蛋白质缀合疫苗；所述流脑多糖血清型为W-135和Y至少ー种，所述流脑多糖为奈瑟氏脑膜炎球菌荚膜多糖的简称。上述疫苗还可以包括佐剂。佐剂选自铝佐剂、弗氏佐剂、单磷酰脂A、CpG、QS-21、霍乱毒素或甲酰甲硫氨酰肽。铝佐剂为磷酸铝或氢氧化铝。上述疫苗还可以包含药学可接受的防腐剤。防腐剂选自苄醇、对羟苯甲酸酷、硫柳汞、氯代丁醇或苯扎氯铵。本发明的流脑多糖-蛋白质缀合疫苗，Y型和W-135型流脑多糖未经解聚エ艺过程，并且和蛋白质之间的连接不通过连接头。因此本发明的エ艺流程简单，收率高，生产成本低，且多糖蛋白比相对稳定，并可在这一水平范围内进行相対的人为控制，大大提高了疫苗的质量稳定性。
图I为抗血清5倍稀释时，针对流脑Y型多糖的免疫酶联反应OD值。图2为抗血清5倍稀释时，针对流脑W-135型多糖的免疫酶联反应OD值。图3为抗血清3125倍稀释后与各型多糖的免疫酶联反应OD值。
具体实施例方式荚膜多糖可以通过本领域技术人员公知的标准技术制备。在本发明中荚膜多糖制备自奈瑟氏脑膜炎球菌血清型A、C、W-135和Y。在相关的实施方案中，这些脑膜炎球菌血清型缀合物分别制备然后配制成单ー剂量形式。例如，从奈瑟氏脑膜炎球菌血清型A、C、W-135和Y分别纯化荚膜多糖，而后分别与载体蛋白进行连接。在本发明的优选实施方案中利用温和氧化条件将来源于奈瑟氏脑膜炎球菌血清型A和C荚膜多糖部分解聚并活化，对奈瑟氏脑膜炎球菌血清型W-135和Y直接进行活化而不进行解聚エ艺。由于反应參数决定了产品的分子特性，如多糖和蛋白的比例及分子量。因此，我们研究了不同參数条件下结合反应获得的产品的免疫原性，而确定合适的エ艺条件和最終的反应物。流脑Y型多糖的活化反应以及产生的产物由下列的反应式所表示。
权利要求
1.流脑多糖-蛋白质缀合疫苗，其特征是用[S-C]n-[N_P]m表不,其中S表不一种流脑多糖分子，C表示该流脑多糖分子中引入醛基的C原子，P表示CRM197蛋白分子，N表示该蛋白分子中赖氨酸侧链氨基的N原子；11和111大于I且小于10 ;所述S的分子量>100KD ；所述[S-C]n-[N-P]m的平均分子量在200KD到2000KD之间，所述流脑多糖为W-135型和Y型流脑多糖中的至少一种，所述流脑多糖为奈瑟氏脑膜炎球菌荚膜多糖的简称。
2.根据权利要求I所述的流脑多糖-蛋白质缀合疫苗，其特征是所述[S-C]n-[N-P]m的平均分子量在200KD到700KD之间。
3.多价流脑多糖-蛋白质缀合疫苗，其特征是包括权利要求I或2流脑多糖-蛋白质缀合疫苗，还包括A型流脑多糖与载体蛋白结合的缀合物和C型流脑多糖与载体蛋白结合的缀合物。
4.流脑多糖-蛋白质缀合疫苗的制备方法，其特征是包括如下步骤 (1)将纯化的流脑多糖溶解于水或乙酸钠缓冲液中，按照流脑多糖与高碘酸盐质量比为I :0. 02-0. 2的比例加入高碘酸盐，活化反应后，超滤或透析去除未反应的高碘酸盐，使流脑多糖上相邻的双羟基被氧化成醛基，得到引入醛基的活化流脑多糖； (2)按质量比为O.5-3 1的比例将步骤(I)获得的所述活化流脑多糖和纯化的载体蛋白CRM197溶解于磷酸盐缓冲液中，调节pH到6. 5和8. 5之间，以氰基硼氢化钠醛基摩尔比5-10的比例加入氰基硼氢化钠进行还原胺反应18-48小时，使活化流脑多糖的醛基和CRM197表面赖氨酸上的氨基产生联接； (3)加入硼氢化钠封闭活化流脑多糖上未反应的醛基；通过硫铵沉淀或者疏水柱层析的方法去除未与载体蛋白CRM197产生反应的游离流脑多糖，得到纯化的流脑多糖-蛋白质缀合疫苗；所述流脑多糖血清型为W-135和Y至少一种，所述流脑多糖为奈瑟氏脑膜炎球菌荚膜多糖的简称。
5.根据权利要求1，2或3所述的疫苗，其特征是还包括佐剂。
6.根据权利要求5所述的疫苗，其特征是所述佐剂选自铝佐剂、弗氏佐剂、单磷酰脂A、CpG> QS-21、霍乱毒素或甲酰甲硫氨酰肽。
7.根据权利要求6所述的疫苗，其特征是所述铝佐剂为磷酸铝或氢氧化铝。
8.根据权利要求1，2或3所述的疫苗，其特征是还包含药学可接受的防腐剂。
9.根据权利要求8所述的疫苗，其特征是所述防腐剂选自苄醇、对羟苯甲酸酯、硫柳汞、氯代丁醇或苯扎氯铵。
全文摘要
本发明公开了一种流脑多糖-蛋白质缀合疫苗及制备方法，所述疫苗是用[S-C]n-[N-P]m表示，其中S表示一种流脑多糖分子，C表示该流脑多糖分子中引入醛基的C原子，P表示CRM197蛋白分子，N表示该蛋白分子中赖氨酸侧链氨基的N原子；所述流脑多糖为W-135型和Y型流脑多糖中的至少一种，本发明的疫苗，Y型和W-135型流脑多糖未经解聚工艺过程，并且和蛋白质之间的连接不通过连接头。因此本发明的工艺流程简单，收率高，生产成本低，且多糖蛋白比相对稳定，并可在这一水平范围内进行相对的人为控制，大大提高了疫苗的质量稳定性。
文档编号A61K47/48GK102861326SQ20121035160
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月19日 优先权日2012年9月19日
发明者朱涛, 宇学峰, 刘正, 邵忠琦, 毛慧华, 邱东旭 申请人:天津康希诺生物技术有限公司