专利名称：京尼平苷的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种中药成分的应用，具体地，涉及京尼平苷在制备治疗预防电离辐射引起的放射性肺损伤药物中的应用。
背景技术：
随着国民经济及科学技术的迅速腾飞、人民生活水平的急剧提高，航空航天事业的飞速发展，核能和核技术等在医疗卫生、科学研究、工农业生产和国防中的大量应用，辐射与人们的工作和日常生活越来越密切，受辐射的人员也越来越多，损害也越来越严重，潜在的巨大危险不容忽视[丛悦，饶亚岚，陈肖华等。辐射诱导对小鼠巨噬细胞钙结合蛋白S100A8表达及调控影响的初步研究。解放军医学杂志，2009年第34期]。辐射对机体的损伤其本质是对细胞的灭活作用，当被灭活的细胞达到一定数量时，躯体细胞的损伤会导致人体器官组织发生疾病，最终可能导致人体死亡。躯体细胞一旦死亡，损伤细胞也随之消失 了，不会转移到下一代。在电离辐射或其他外界因素的影响下，可导致遗传基因发生突变，当生殖细胞中的DNA受到损伤时，后代继承母体改变了的基因，导致有缺陷的后代。胸部恶性肿瘤如肺癌、食管癌、乳腺癌等是我国最常见的恶性肿瘤，发病率呈逐年上升的趋势，是我国居民最主要的死亡原因之一。作为肿瘤治疗的基本手段之一，放射治疗应用历史已逾百年，其目的在于对确定的肿瘤给予精确的电离辐射以达到杀伤肿瘤作用，同时使周围的正常组织受到最小的损伤，以最小的代价取得最佳的治疗效果，提高患者的生活质量和生存期[王淑莲，刘跃平，孙倩.放射肿瘤学治疗策略与实施，天津天津科技翻译出版公司，2001年第I期]。近年来，由于超高压治疗机的使用，辅助工具的改进和经验的积累，治疗效果得到显著提高，其局部控制率和生存率都显著提高，目前已成为癌症治疗中最重要的手段之一。据统计，我国约有70%以上的癌症需用放射治疗，美国统计也有50%以上的癌症需用放射治疗。然而，放射线在放疗杀伤肿瘤细胞的同时也会无选择性的损伤正常组织细胞，引起一系列全身和局部的副反应，而且放化疗后，肿瘤患者的免疫力低下，肿瘤细胞很容易卷土重来，导致癌细胞转移和扩散。因此，我们需采取相应的措施来防治及减少一些放疗后副作用对机体的损伤，做好肿瘤放疗护理。人类的活动空间正不断扩大，已经走向太空，建立月球基地和飞往火星已被列入21世纪的航天计划，而宇航员会受到地球带电粒子、太阳宇宙射线等各种电离辐射的照射，造成不同程度的损伤。即使是处于低地轨道上，各种辐射对健康造成损伤的机会也要比地球表面大50倍。而在更远的太空里，充满了宇宙射线，由于失去了天然的防护，辐射对人的影响会更严重。总体而言，太空面临的辐射危险有两种。一种是长期、低剂量的银河系宇宙射线，主要是质子和重离子对人体的损伤；另一种是有可能遇到偶发的、高剂量的太阳高能粒子辐射。这两种辐射可能引起组织的物理损伤如引起皮肤、肠、骨髓、肺及其他组织的急性损伤，引起白内障和杀死人体细胞，降低人的免疫能力，增加癌症的发病率和基因的破坏。如果不加防护装置，在太阳的辐射下，航天员所受的辐射剂量可高达几百拉德。美国航宇局已经认识到累积的辐射剂量“将有可能成为人类太空探险中的最大限制因素。”为了防止空间辐射对航天员健康的影响，在以往的飞行中以物理防护为主，普遍采用的方法是增加舱壁的厚度。舱壁厚度增加，可以降低舱内的辐射剂量。此外，还有选择合适的发射时间，进行飞行辐射危险性分析，及时检测辐射环境的辐射剂量等。实验证明一些药物具有减轻辐射损伤的作用。在航天飞行中配备这些药物，在辐射剂量超限时服用，可以阻止或减轻由于暴露于质子及重离子而产生的生物效应，包括由这些类型电离辐射引起的癌症、免疫抑制和神经系统疾病等的诱导效应[雷筱芬，陈木森.黄酮类化合物抗辐射研究进展。江西农业大学学报，2007年第29期]。由于受到飞船载荷的限制及宇航员出舱工作时，单靠屏蔽等物理防护很难实现，所以应采用物理、药物等综合措施，来提高机体对辐射的抵抗能力，这是对抗辐射影响的一种积极有效的方法。核辐射，或通常称之为放射性，存在于所有的物质之中，这是亿万年来存在的客观事实，是正常现象。核辐射是原子核从一种结构或一种能量状态转变为另一种结构或另一种能量状态过程中所释放出来的微观粒子流。核辐射可以使物质引起电离或激发，故称为电离辐射。核辐射在我们生活的地球上无处不在。除来自宇宙的各种放射性射线外，在空气中(氡)、地球表面(岩石和土壤)、建筑物、地板和墙壁、食物和水，以及我们身体的各 种组织器官内都存在放射性物质。自然界中存在的这些放射性物质的辐射，包括宇宙射线的福射，统称为天然福射，也称本底福射[Uniter Nations Scientific Committee onthe Effects of Atomic Radiation. Sources and Effects of Ionizi ng Radiation.UNSCEAR,2000, Report to the General Assembly, United Nations, New York, 2001]。自有地球以来，天然辐射就一直存在，人类正是在这种核辐射环境中生存、进步和发展。放射性肺损伤是胸部恶性肿瘤放射治疗最主要的并发症，是影响肿瘤治愈患者生活质量的主要原因之一，是胸部肿瘤放射治疗的主要剂量限制因素，也是航空航天事业和核工业发展的主要并发症之一。文献资料显示，5%-20%的肺癌患者放疗后出现放射性肺损伤，而在胸部淋巴瘤或食管癌的患者放疗后放射性肺损伤的催患率为10%-30%。尽管国内外学者对放射性肺损伤的研究已有一百余年的历史，对其病变发生规律进行了多角度多层次的研究，然而对其发病机理尚未完全阐明，到目前为止，主要分为三种假说①小血管及肺II型细胞损伤学说；②自由基学说；③细胞因子学说。但是，任何一种学说都不能解释放射性肺损伤的整个病理生理过程〔Yang KY, Liu Li, Zhang Tao, et al. Inereasedexpressions of MMP-2 and MMP-9 in lung following 12Gy local irradiation. Chin JRadiol Med Prot, 2006 ； Yang K, Liu L, Zhang T, et al. TGF-betal transgenic mousemodel of thoracic irradiation: Modulation of MMP-2 and MMP-9 in the lung tissue.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci. 2006〕。然而幸运的是,放射性肺损伤的病理学特征却有比较一致的结论放射性肺损伤的发生过程中，肺泡基底膜的损伤导致炎症因子和细胞在肺泡腔内及肺间质聚集，肺泡上皮细胞脱落、表面活性物质的丢失及胶原的沉积最终导致了肺泡塌陷及肺间质纤维化。显然，在这一演变过程中，以IV型胶原为主要成分的肺泡基底膜损伤对于肺间质纤维化的形成是十分必要的，是放射性肺泡炎和肺间质纤维化病理变化的关键事件。而包括肺泡基底膜在内的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的代谢失衡在放射性肺损伤的发生过程中可能发挥了关键作用，这是通过调节ECM合成与分解代谢实现的。综上所述，研究电离辐射引起的放射性肺损伤的发生发展机制，并以此为基础寻找预防或治疗放射性肺损伤的途径，是目前国内外肿瘤放射治疗学者热切期待解决的问题〔RubinP, JohnstonCJ, WilliamsJP, et al. A Perpetual caseade of cytokinespostirradiation leads to Pulmonary fibrosis.Int J Radiat oncol Biol Phys. 1995 ；ShapiroDL, FinkelsteinJN, RubinP, et al. Radiation indueed secretion ofsurfactant from cell cultures of type II Pneumocytes: an invitro model ofradiation toxicity. Int J Radiat oncol Biol Phys. 1984]。面对这种现象，各种化学药物和生物制剂应运而生，天然药物制剂也在预防和治疗辐射副反应中发挥了积极的作用，研究发现许多天然药物及其代谢产物具有明显的辐射防护作用[潘自强。辐射防护的现状与未来.北京原子能出版社，1997年][赵斌，张军帅，刘培勋。辐射防护剂研究现状及其进展，核化学与放射化学。2012年第I期]。京尼平苷(geniposide),别名桅子苷,轻异桅子苷,桅子糖苷,异桅子苷等，白色结晶，分子式C17H24Oltl,分子量388. 37,是一种从杜仲科植物杜仲(Mucommia uImoides0/iMr )叶中提取的环烯醚萜葡萄糖苷，易溶于水，是桅子的主要药效成分，含量随产地的不同在3%-8%左右，广泛存在于植物组织细胞中，如杜仲科杜仲属植物杜仲的皮、叶和雄花，茜草科植物龙船花叶和小枝，桅子的果实，伞房花耳草等[杨轶舜，张彤，于筛成。京尼平 的研究进展及其药理价值。中成药，2011年第I期]，目前，京尼平苷的提取方法一般采用氯仿、无水乙醇等有机溶剂在索氏提取瓶中提取，得到桅子中总的活性成分桅子总苷，然后再上硅胶柱分离，用一定比例的甲醇、氯仿混合液洗脱，洗脱液在丙酮中进行重结晶得京尼平苷晶体，一般IOOg桅子果中可分离得到4. Og左右的京尼平苷[朱冬春，黄赵刚，夏泉等。桅子中京尼平苷提取方法考察。时珍国医国药，2009年第7期]。京尼平苷结构如下
HO。
HO V ,°
i 々ο
.. W HO\ b^.CH
京尼平苷具有缓泻、镇痛、利胆、抗炎、治疗软组织损伤以及抑制胃液分泌和降低胰淀粉酶等作用[倪慧艳，朝晖，傅海珍.桅子的研究与开发概述.中国中药杂志，2006年第31期]，不同条件的发酵，可以制成天然食用着色剂桅子蓝和桅子红，也是用于治疗心脑血管、肝胆等疾病及糖尿病的原料药物。现代研究表明，京尼平苷及其代谢产物对消化系统、心血管系统和中枢神经系统疾病均有显著疗效[张陆勇，秀慧芳。桅子西红花总甙对神经、心血管及呼吸系统的影响。中国药科大学学报。2000年第31期]，此外，京尼平苷及其代谢产物还有一定的抗炎和治疗软组织损伤的作用[谭玉林，鲍同柱，柳琴等。京尼平苷对大鼠软骨细胞增殖的影响。中国组织工程研究与临床康复，2011年第41期]。京尼平苷除了药用以夕卜，在其它领域也得到广泛的应用，如可用作植物增产剂、生物检测剂等。京尼平苷及其代谢产物具有很强的药理活性，近十几年来，国内外学者在京尼平苷的有效成份、提取物分析、药理及应用方面做了大量的研究，取得了可喜的成绩，但有关京尼平苷及其代谢产物对胸部肿瘤放射治疗、航空航天和核辐射等电离辐射引起的放射性肺损伤影响的相关研究至今未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种京尼平苷的新应用京尼平苷在制备治疗预防电离辐射引起的放射性肺损伤药物中的应用。京尼平苷作为制备治疗预防航空航天，核辐射和胸部肿瘤放射治疗时电离辐射引起的放射性肺损伤，增强机体免疫力从而减轻辐射损伤的药物，可为航空航天事业，核科技发展和胸部肿瘤放射治疗引起的放射性肺损伤提供一种可供选择的辐射防护思路。为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案
京尼平苷在制备治疗预防电离辐射引起的放射性肺损伤药物中的应用。具体地，所述电离辐射为X射线照射。具体地，所述电离辐射为重离子照射。具体地，所述电离辐射为Y射线照射。具体地，所述治疗预防电离辐射引起的放射性肺损伤药物的剂型为片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊、悬浮液、溶液、糖浆、注射剂、霜剂、软膏、凝胶剂、喷雾剂、口嚼剂或贴剂。本发明所述的京尼平苷是从中药杜仲叶中提取分离获得，可采用任何已公开文献或专利方法提取制备。本发明具有以下有益效果
本发明的有益效果是本发明所述的京尼平苷采用任何适合的方式应用于航空航天，核辐射和放射治疗联合应用于患者，都可以减轻因电离辐射所致的放射性肺损伤症状，如组织水肿、炎症、疼痛、造血功能异常(如白细胞降低)、腺体功能障碍、致癌等等多种典型不良反应症状；并可明显缓解航空航天，核辐射和肿瘤放射治疗时引起的放射性肺损伤，增强机体免疫力，从而减轻辐射损伤的药物，为航空航天事业，核科技发展和胸部肿瘤放射治疗提供一种可供选择的辐射防护思路。
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中
图I是京尼平苷对X射线照射所致小鼠放射性肺损伤的组织病理学变化 在图I中，A:正常肺组织B:京尼平苷100 mg/kg C:单纯放疗组D:京尼平苷100mg/kg+ 放疗；
图2是京尼平苷对12C6+束照射所致小鼠放射性肺损伤的组织病理学变化 在图2中，A:正常肺组织B:京尼平苷100 mg/kg C:单纯放疗组D:京尼平苷100mg/kg+ 放疗；
图3是京尼平苷对X射线照射所致小鼠正常肺组织损伤的病理学变化 在图3中，A:正常肺组织B:京尼平苷100 mg/kg C:单纯放疗组D:京尼平苷100·mg/kg+放疗。
具体实施例方式以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。实施例I :京尼平苷对X射线照射治疗恶性肿瘤时引起的放射性肺损伤、机体免疫力下降的缓解作用。I. I实验材料
京尼平苷，购自上海源叶生物科技有限公司，纯度> 98%(HPLC法测定)。Lewis肺癌细胞株，购自中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)，接种于C57BL/6小鼠右腋部皮下传代保存。I. 2实验方法
于超净工作台上，取荷瘤传代鼠脱颈椎处死，固定于板上。用碘酊及酒精消毒动物皮肤，切开皮肤，选择肿瘤生长良好、无坏死或液化的瘤组织，加入无菌生理盐水，用组织匀浆器制成含3000万/ml左右的细胞悬液，于120只C57BL/6小鼠右后肢腹股沟部位皮下接种上述瘤细胞悬液0.2 ml/只，接种部位皮肤先用碘酊及酒精消毒。接种后10天，选择已有肿瘤组织生长且瘤组织直径大于Icm的小鼠，随机分为9组，每组12只，分别为荷瘤对照组、单纯放疗组、顺钼组、京尼平苷I mg/kg组、京尼平苷10 mg/kg组、京尼平苷100 mg/kg组、京尼平苷I mg/kg+放疗组、京尼平苷10 mg/kg+放疗组、京尼平苷100 mg/kg+放疗组。分组后放疗各组小鼠每日以深部X射线治疗机全身照射(Philips公司，德国)，照射剂量2Gy，照射后京尼平苷各组小鼠灌胃给予相应剂量京尼平苷，其余各组灌胃给予等体积蒸馏水。每天一次，连续5天。末次照射后24小时，脱颈椎处死小鼠，断开气管获取全肺，取部分左肺中部组织放入4%中性甲醛固定，石蜡包埋，用于HE染色，观察组织病理学变化，部分右肺用于羟脯氨酸，DNA损伤以及细胞凋亡等生化检测。羟脯氨酸的测定采用南京建成生物技术公司的碱水解试剂盒，按照产品说明书进行操作。简而言之，取30-100 mg肺组织，加入I ml水解液在100°C裂解20min，用活性炭吸附有色杂质后，离心，取上清I ml，依次加入试剂I、2、3，充分反应后取上清Iml在550 nm处，Icm光径，蒸馏水调零，比色，测各管吸光度。羟脯氨酸含量(yg/mg)=(测定管吸光度一空白管吸光度)/(标准管吸光度一空白管吸光度)X标准管含量X水解液总体积/组织质量；剩余部分冰冻保存，用于细胞因子TNF-a，TGF-β的ELISA检查，测定采用南京建成生物技术公司的羟脯氨酸测定试剂盒，按照产品说明书进行操作。具体操作步骤如下分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50 μ 1，待测样品孔中先加样品稀释液40μ1，然后再加待测样品10μ I (样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。用封板膜封板后置37°c温育30分钟。将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用，小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。每孔加入酶标试剂50 μ 1，空白孔除外。37°C温育30分钟，将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用，小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干，每孔先加入显色剂Α50μ 1，再加入显色剂Β50μ 1，轻轻震荡混匀，37°C避光显色15分钟，每孔加终止液50 μ 1，终止反应(此时蓝色立转黄色)。以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光(OD值)。小鼠肺组织细胞DNA损伤检测采用碱性单细胞电泳分析法(Single cell microgel electrophoresis (SCGE),或称comet assay)。这是一种测定单个哺乳动物细胞DNA损伤的快速、简便和灵敏的方法[McKelvey-Martin VJ, Green MH, Schmezer P,Pool-Zobel BL, De Meo MP, Collins A. The single cell gel electrophoresis assay(comet assay) : a European review. Mutat Res. 1993 ;288 (I) :47-63.]。实验按Franke等[Franke SI, Pra D, da Silva J, et al. Possible repair action of Vitamin Con DNA damage induced by methyl methanesulfonate, cyclophosphamide, FeS04 andCuS04 in mouse blood cells in vivo. Mutat Res. 2005 ；583(1) :75-84.]方案进行。具体内容如下在砂纸打磨过的或磨砂载玻片上涂一层O. 5%的常熔点琼脂糖(normalmelting agarose, NMA) ,4° C下使其凝固。小鼠肺组织细胞10 μ I与100 μ I低融点琼脂糖(LMA，O. 75% in PBS)在37° C混合均匀，滴在载玻片上。加上盖玻片后于4° C放置一 段时间使其凝固。去掉盖玻片，再加一层LMA并加盖玻片，凝固后小心去掉盖玻片。将包埋了细胞的载玻片小心置入细胞裂解液(内含1%月桂酰肌氨酸钠、2. 5mol/L NaClUOOmmol/L EDTA-Na2 和 10mmol/L Tris-HCl，pHIO，临用前加入 10%DMS0 和 l%Triton X-100)中，于4° C下放置约I小时。取出载玻片置于水平电泳槽中，加入电泳缓冲液(内含Immol/L EDTA-Na2和300mmol/L NaOH)，放置20分钟后，调整缓冲液液面使电压达25V，电流达300mA,电泳20min。电泳完毕，小心将载玻片浸于中和液(O. 4mol/L Tris-HCl，pH7. 5)，放置5分钟，再换新的中和液，同样放置5分钟，以排除碱对EB (溴化乙锭)染色的干扰。取出后用20μ8/πι1ΕΒ染色，加盖玻片，并尽快在荧光显微镜下进行观察和拍照。荧光显微镜下激发光波长为515-560nm，滤光片波长为590nm。未损伤肺细胞的DNA为圆形，而受到损伤的肺细胞DNA带有彗星样尾巴。每只小鼠照片中随机选用100个细胞，利用CASP软件对DNA损伤情况进行分析。此软件分析结果中拖尾细胞的平均尾长和拖尾率作为DNA损伤评价指标[Konca K, Lankoff A, Banasik A, et al. A cross-platform public domain PCimage-analysis program for the comet assay. Mutat Res. 2003]。细胞平均尾长=Σ每个细胞拖尾长度/测定细胞数
细胞凋亡检测采用流式细胞分析法。具体方法是将新鲜肺组织用眼科剪尽量剪碎，200目筛过滤。PBS洗涤2次后用75%冷乙醇在4° C冰箱固定24 h以上。离心除去固定液，力口碘化丙唆(Propidiumiodide, PI)染色液 O. 5mL(含 O. 3 mg/mL RNAase, 20 μ g / mL PI),常温避光染色30min后，FASCan型流式细胞仪(USA)检测，激发光波长为488nm，每个样品测定10000个细胞。采用分析软件FlowJo7. I(CA)计算出凋亡细胞的百分比。以t检验进行组间统计学分析。I. 3实验结果
结果表明(表1)，X射线照射可致小鼠肺组织细胞DNA损伤，细胞凋亡率明显升高，京尼平苷本身对DNA损伤和细胞凋亡率没有明显影响，但1-100 mg/kg的京尼平苷能够抑制X射线照射所致肺组织细胞DNA损伤和细胞凋亡率的增加，且有明显的剂量效应关系。此外，研究结果也表明(表2)，X射线照射可致小鼠肺组织中羟脯氨酸含量急剧升高，肺损伤关键细胞因子TNF-α和TGF-β含量迅速提高，京尼平苷本身对肺组织没有损伤和副作用，但1-100 mg/kg的京尼平苷能够抑制X射线照射所致肺组织中羟脯氨酸含量的提高，并抑制细胞因子TNF-α和TGF-β含量的升高，且有明显的剂量效应关系；组织病理学结果也显示(如图I所示)，X射线照射可小鼠肺组织产生一定程度的损伤，肺泡壁有所增厚，产生大量炎性细胞(C)，京尼平苷本身对肺组织没有损伤和副作用(B)，但和正常对照组相比，
1-100 mg/kg的京尼平苷能够明显减轻X射线照射所致肺组织的损伤程度(D)。表明京尼平苷对X射线照射所致的放射性肺组织电离损伤有明显的保护作用。
权利要求
1.京尼平苷在制备治疗预防电离辐射引起的放射性肺损伤药物中的应用。
2.根据权利要求I所述的应用，其特征在于，所述电离辐射为X射线照射。
3.根据权利要求I所述的应用，其特征在于，所述电离辐射为重离子照射。
4.根据权利要求I所述的应用，其特征在于，所述电离辐射为Y射线照射。
5.根据权利要求I所述的应用，其特征在于，所述治疗预防电离辐射引起的放射性肺损伤药物的剂型为片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊、悬浮液、溶液、糖浆、注射剂、霜剂、软膏、凝胶齐U、喷雾剂、口嚼剂或贴剂。
全文摘要
本发明公开了京尼平苷在制备治疗预防电离辐射引起的放射性肺损伤药物中的应用。京尼平苷作为制备治疗预防航空航天，核辐射和胸部肿瘤放射治疗时引起的放射性肺损伤，增强机体免疫力从而减轻辐射损伤的药物，可为航空航天事业，核科技发展和胸部肿瘤放射治疗等电离辐射引起的放射性肺损伤提供一种可供选择的辐射防护思路。
文档编号A61P11/00GK102908356SQ20121035130
公开日2013年2月6日 申请日期2012年9月20日 优先权日2012年9月20日
发明者武振华, 张红, 王振华, 王新宇 申请人:中国科学院近代物理研究所