专利名称：广防风苷a及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及制药领域，具体涉及一种从广防风根中提取分离获得的新化合物-广防风苷A及其制备和应用。
背景技术：
对更年期综合征的治疗，长期以来都是使用雌激素类制剂，但由于激素有诸多的副作用及不良反应，甚至可能导致癌症，不易被广大妇女所接受。因此，就目前来说，在临床上尚无较为理想的药物。
广防风，又名防风草，拉丁名Epimeredi indica(L.)Rothmalex，在《中药大辞典》中有记载，为唇形科植物防风草的全草，主要用于治疗感冒身热，呕吐，腹痛，筋骨疼痛，疮疡，湿疹，痔疾等；在中华人民共和国卫生部部颁标准《中药成方制剂》第二十册的贯防感冒片，是组方中的一味药。
本发明申请人已在中国专利申请02110522.7中公开了广防风根的新用途。广防风根具有改善卵巢功能和调节雌激素和孕激素的作用，可用于制备治疗预防与雌激素、孕激素平衡失调有关的疾病的药物或保健品。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是对广防风根进行进一步研究，分离纯化其有效部位，提供一种广防风根主要活性成份单体广防风苷A。
本发明公开的广防风苷A具有下述式I结构
化学名3-(4-羟基-3-甲氧基-苯基)-丙烯酸5-羟基-6-[2-(4-羟基-3-甲氧基-苯基)-乙氧基]-2-羟甲基-4-鼠李糖-四氢吡喃-3-酯根据化合物的UV、IR、ESI、HRESI、NMR、2D-NMR(COSY、HMQC、HMBC、NOESY)鉴定化合物广防风苷A，分子式为C13H40O15，分子量为652，熔点139～142℃，其结构式如式1；信号归属如表1。广防风苷A核磁共振13C谱见图1，广防风苷A核磁共振1H谱见图2，广防风苷A红外图谱见图3，广防风苷A紫外图谱见图4，广防风苷A质谱见图5。
表1化合物广防风苷A的1H NMR、13C NMR数据(CD3OD，500MHz)Ferulic acid δC ΔH AglyconeΔC δH1127.68 1 132.692111.667.15(d，2)2 117.00 6.69(d，2)3150.64 3 147.474149.36 4 147.335116.476.80(d，8)5 112.81 6.65(d，8)6124.277.02(dd，8，2)6 121.11 6.61(dd，8，2)7147.107.62(d，16) α 36.71 2.80(t，7)8115.286.39(d，16) β 72.31 3.5---4.29169.07 OCH355.40 3.76(s)OCH355.44 3.86(s)
GlucoseδC ΔH Rhamnose ΔC δH1 104.39 4.33(d，8) 1102.735.18(d，1)2 75.663.5---4.2272.34 3.5---4.23 84.083.53(m) 372.25 3.5---4.24 70.543.5---4.2473.99 3.5---4.25 75.373.5---4.2570.05 3.5---4.26 64.684.41(m) 617.88 1.25(d，6)本发明广防风苷A是通过下述技术方案获得的取广防风根粗粉6Kg，加10倍量的水加热提取3次，回收水至600ml，加水饱和的正丁醇萃取3次(400ml/次)，回收正丁醇至干，加蒸馏水500ml溶解后上大孔树脂(AB-8)，依次用20％，50％，95％的乙醇洗脱，回收50％的乙醇洗脱液至干，加适量50％的甲醇-水(v/v)溶解，上C-18硅胶柱，用50％的甲醇-水(v/v)洗脱，分部收集，薄层检查，合并，回收，得广防风苷A。
本发明所要解决的另一技术问题在于公开上述广防风苷A在制备治疗预防与雌激素、孕激素平衡失调有关疾病药物中的应用，以及作为广防风根活性成份提取物含量检测标示物的应用。
广防风根提取物是由广防风根部经水提、浓缩后获得的浸膏，广防风根苷A是广防风根提取物中的主要活性成份，同样具有改善卵巢功能和调节雌激素和孕激素的作用，可用于制备治疗预防与雌激素、孕激素平衡失调有关疾病的药物。
同时广防风根提取物及其制剂在采用HPLC法测定含量方法中，采用广防风苷A作为含量的标示物，可准确、灵敏地确定提取物的活性成份含量，以方便地控制所述药物的使用剂量。
以广防风苷A作为含量的标示物测定广防风根提取物含量的方法包括a、仪器与材料仪器Aglient1100高效液相色谱仪对照品广防风苷A试剂甲醇、乙腈、蒸馏水等所有试剂为分析纯样品广防风根提取物b、色谱条件
色谱柱DiscoveryC18(250*4.6mm，5um)流动相乙腈∶水＝27∶73流速1.0ml/min 柱温室温检测波长320nm 进样量20ulc、标准曲线①标准储备液的制备精密称取对照品4.95mg，加甲醇超声溶解，定量到25ml；②标准曲线的绘制精密吸取对照品储备液各0.4，0.8，1.2，1.6，2.0于2ml容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，分别得浓度为39.6ug/ml，79.2ug/ml，118.8ug/ml，158.4ug/ml，198ug/ml的Y1标准液，采用以上色谱条件，进样20ul。以峰面积(Y)为纵坐标，Y1浓度(X)为横坐标，进行线性回归，得回归方程Y＝20.139X-154.35；R2＝0.9994，线形范围0.792～3.96ug，Y1出峰时间为9.55mind、样品测定对照品溶液配制精密称取对照品一定量，加甲醇超声溶解，定容，分别吸取供试品溶液20ul，按上诉液相条件测定，记录峰面积，并用标准曲线计算Y1的含量；供试液的制备取广防风根提取物粉末，精密称取170.5mg，置于离心管中，加水超声提取两次，离心，取上清液，残渣再用水洗，合并上清液和洗液，定容至10ml容量瓶中，进样前用0.45μm滤膜过滤；取以上供试液在色谱条件下进样，按双点校正法计算样品中所含组分的含量，计算公式如下Y＝20.139X-154.35Y为峰面积值；X为样品的浓度μg/ml；则样品中广防风苷A的含量为X*10/取样量*100％。
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
图1广防风苷A核磁共振13C谱图2广防风苷A核磁共振1H谱图3广防风苷A红外图谱图4广防风苷A紫外图谱图5广防风苷A质谱图6广防风苷AHPLC7广防风根提取物HPLC图
具体实施例方式实施例1、广防风苷A制备(1)取广防风根，粉碎，加10倍量的水，煎煮2小时，滤液待用，残渣加8倍量水，煎煮2小时，滤过，合并滤液，滤液浓缩，喷雾干燥或真空干燥，得广防风根提取物。
(2)取广防风根提取物6Kg，加10倍量的水加热提取3次，回收水至600ml，加水饱和的正丁醇萃取3次(400ml/次)，回收正丁醇至干，加蒸馏水500ml溶解后上大孔树脂(AB-8，天津南开大学化工厂)，依次用20％，50％，95％的乙醇洗脱，回收50％的乙醇洗脱液至干，加适量50％的甲醇-水(v/v)溶解，上C-18硅胶柱，用50％的甲醇-水(v/v)洗脱，分部收集，薄层检查，合并，回收，得广防风苷A。
根据化合物的UV、IR、ESI、HRESI、NMR、2D-NMR(COSY、HMQC、HMBC、NOESY)鉴定化合物广防风苷A，分子式为C13H40O15，分子量为652，熔点139～142℃，其结构式如式1；信号归属如表1，广防风苷A核磁共振13C谱见图1，广防风苷A核磁共振1H谱见图2，广防风苷A红外图谱见图3，广防风苷A紫外图谱见图4，广防风苷A质谱见图5。。
表1化合物广防风苷A的1H NMR、13C NMR数据(CD3OD，500MHz)
Ferulic acid δC ΔH AglyconeΔC δH1127.68 1 132.692111.667.15(d，2)2 117.00 6.69(d，2)3150.64 3 147.474149.36 4 147.335116.476.80(d，8)5 112.81 6.65(d，8)6124.277.02(dd，8，2)6 121.11 6.61(dd，8，2)7147.107.62(d，16) α 36.71 2.80(t，7)8115.286.39(d，16) β 72.31 3.5---4.29169.07 OCH355.40 3.76(s)OCH355.44 3.86(s)Glucose δC ΔHRhamnoseΔC δH1104.39 4.33(d，8) 1 102.73 5.18(d，1)275.663.5---4.2 2 72.34 3.5---4.2384.083.53(m)3 72.25 3.5---4.2470.543.5---4.2 4 73.99 3.5---4.2575.373.5---4.2 5 70.05 3.5---4.2664.684.41(m)6 17.88 1.25(d，6)实施例2、广防风根提取物含量测定a、仪器与材料仪器Aglient1100高效液相色谱仪对照品广防风苷A(实施例1方法获得)试剂甲醇、乙腈、蒸馏水等所有试剂为分析纯样品广防风根提取物(实施例1步骤(1)获得)b、色谱条件色谱柱DiscoveryC18(250*4.6mm，5um)流动相乙腈∶水＝27∶73流速1.0ml/min 柱温室温检测波长320nm 进样量20ulc、标准曲线①标准储备液的制备精密称取对照品4.95mg，加甲醇超声溶解，定量到25ml②标准曲线的绘制精密吸取对照品储备液各0.4，0.8，1.2，1.6，2.0于2ml容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，分别得浓度为39.6ug/ml，79.2ug/ml，118.8ug/ml，158.4ug/ml，198ug/ml的Y1标准液，采用以上色谱条件，进样20ul。以峰面积(Y)为纵坐标，Y1浓度(X)为横坐标，进行线性回归，得回归方程Y＝20.139X-154.35；R2＝0.9994，线形范围0.792～3.96ug，Y1出峰时间为9.55min峰面积
d、样品测定对照品溶液配制精密称取对照品一定量，加甲醇超声溶解，定容，分别吸取供试品溶液20ul，按上诉液相条件测定，记录峰面积，并用标准曲线计算Y1的含量；见图6供试液的制备取广防风根提取物粉末，精密称取176.35mg，置于离心管中，加水超声提取两次，离心，取上清液，残渣再用水洗，合并上清液和洗液，定容至10ml容量瓶中，进样前用0.45μm滤膜过滤；取以上供试液在色谱条件下进样，见图7，按双点校正法计算样品中所含组分的含量，Y＝452.136，根据Y＝20.139X-154.35，计算得X＝30.115ug/ml，则样品中广防风苷A的含量为X*10/取样量*100％＝0.17％。
实施例3、广防风根胶囊含量测定a、仪器与材料仪器Aglient1100高效液相色谱仪样品广防风根胶囊(含广防风根提取物，0.39g/粒，由上海药港生物技术有限公司生产)对照品广防风苷A(实施例1方法获得)试剂甲醇、乙腈、蒸馏水等所有试剂为分析纯b、色谱条件色谱柱DsicoveryC18(250*4.6mm，5um)
流动相乙腈∶水＝27∶73流速1.0ml/min 柱温室温检测波长320nm 进样量20ulc、标准曲线的建立(同实施例2)d、样品测定对照品溶液配制精密称取对照品一定量，加甲醇超声溶解，定容，分别吸取供试品溶液20ul，按上诉液相条件测定，记录峰面积，并用标准曲线计算Y1的含量；供试液的制备取广防风根胶囊内容物，研磨成粉末，过40目筛，精密称取0.5g，置于离心管中，加甲醇超声提取两次，离心，取上清液，残渣再用水洗，合并上清液和洗液，定容至10ml容量瓶中。进样前用0.45μm滤膜过滤。
取以上供试液在色谱条件下进样，按双点校正法计算样品中所含组分的含量，Y＝221.61，根据Y＝20.139X-154.35，计算得X＝18.67ug/ml，则样品中广防风苷A的含量为X*10/取样量*100％＝1.06％。
权利要求
1.一种广防风苷A，具有式I结构
2.根据权利要求1所述的广防风苷A的制备方法，其特征在于该化合物通过下述方法获得取广防风根粗粉6Kg，加10倍量的水加热提取3次，回收水至600ml，加水饱和的正丁醇萃取3次，回收正丁醇至干，加蒸馏水500ml溶解后上AB-8大孔树脂，依次用20％，50％，95％的乙醇洗脱，回收50％的乙醇洗脱液至干，加适量50％的甲醇-水(v/v)溶解，上C-18硅胶柱，用50％的甲醇-水(v/v)洗脱，分部收集，薄层检查，合并，回收，即得。
3.根据权利要求1所述广防风苷A在制备治疗预防与雌激素、孕激素平衡失调有关疾病的药物和作为含量标示物在广防风根提取物及其制剂用HPLC法测定含量方法中的应用。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于其中所述的广防风苷A作为含量标示物在广防风根提取物及其制剂用HPLC法测定含量方法包括下述步骤a、仪器与材料仪器Aglient1100高效液相色谱仪对照品广防风苷A试剂甲醇、乙腈、蒸馏水等所有试剂为分析纯样品广防风根提取物b、色谱条件色谱柱Discovery C18，250*4.6mm，5um流动相乙腈∶水＝27∶73流速1.0ml/min 柱温室温检测波长320nm 进样量20ulc、标准曲线①标准储备液的制备精密称取对照品4.95mg，加甲醇超声溶解，定量到25ml；②标准曲线的绘制精密吸取对照品储备液各0.4，0.8，1.2，1.6，2.0于2ml容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，分别得浓度为39.6ug/ml，79.2ug/ml，118.8ug/ml，158.4ug/ml，198ug/ml的Y1标准液，采用以上色谱条件，进样20ul，以峰面积Y为纵坐标，Y1浓度X为横坐标，进行线性回归，得回归方程Y＝20.139X-154.35；R2＝0.9994，线形范围0.792～3.96ug，Y1出峰时间为9.55mind、样品测定对照品溶液配制精密称取对照品一定量，加甲醇超声溶解，定容，分别吸取供试品溶液20ul，按上诉液相条件测定，记录峰面积，并用标准曲线计算Y1的含量；供试液的制备取广防风根提取物粉末，精密称取，置于离心管中，加水超声提取两次，离心，取上清液，残渣再用水洗，合并上清液和洗液，定容至10ml容量瓶中，进样前用0.45μm滤膜过滤；取以上供试液在色谱条件下进样，按双点校正法计算样品中所含组分的含量，计算公式如下Y＝20.139X-154.35Y为峰面积值；X为样品的浓度ug/ml；则样品中广防风的含量为X*10/取样量*100％。
全文摘要
本发明涉及一种从广防风根中提取分离获得的新化合物一广防风苷A及其制备和应用。本发明所述的广防风苷A具有右述式I结构，广防风根苷A是广防风根提取物中的主要活性成分，具有改善卵巢功能和调节雌激素和孕激素的作用，可用于制备治疗预防与雌激素、孕激素平衡失调有关疾病的药物。同时广防风苷A还可作为广防风根提取物及其制剂在HPLC法测定含量中的标示物，可准确、灵敏地确定提取物的活性成分含量，以方便地控制所述药物的使用剂量。本发明还提供了广防风苷A的制备方法。
文档编号A61K36/53GK1597689SQ0315099
公开日2005年3月23日 申请日期2003年9月19日 优先权日2003年9月19日
发明者黄寰 申请人:上海药港生物技术有限公司