专利名称：荔枝核黄酮类化合物在制备抗腺病毒药物上的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及荔枝核黄酮类化合物在制备抗腺病毒药物上的用途，属于医药技术领域。
背景技术：
腺病毒感染所导致的呼吸道传染病——腺病毒肺炎，常发生在6个月至2岁的婴幼儿，患儿出现高热、呼吸困难、口周紫绀、抽风、惊厥、昏迷等中毒症状，多因抢救不及时或不当而死亡，病死率约为20% 50%，严重威胁婴幼儿健康。现在临床上对于腺病毒肺炎的治疗，主要应用酚妥拉明、病毒唑、干扰素、聚肌胞注射液、左旋咪唑等，但均未获得明显效果。因此，研究和开发新的抗腺病毒药物具有重要的现实意义和社会意义。蒸枝核是无患子科植物蒸枝(Litchi chinensis Sonn)的干燥成熟种子,又名蒸仁或荔核，味甘、微苦，我国古代药典记载荔枝核性温、归肝、肾经、能祛寒止痛和行气散结； 荔枝核的化学成分有留类、皂苷、挥发油、鞣质、脂肪酸、聚合花色素、糖类、蛋白质以及无机盐。黄酮类化合物为荔枝核提取物中的主要成分，具有毒性低、副作用小等特点。荔枝核黄酮类化合物除具有降血糖、调血脂和抗氧化作用等多种功效外，还具有抗病毒作用，已有文献报道其具有体外抗乙型肝炎病毒(HBV)、流感病毒(IFV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、SARS病毒等多种病毒作用，但其对腺病毒的作用尚未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供荔枝核黄酮类化合物在制备抗腺病毒药物上的用途。本发明发现荔枝核黄酮类化合物能抑制腺病毒在细胞中的生物合成，临床上可用于腺病毒感染引起的肺炎的治疗。本发明采用的荔枝核黄酮类化合物的提取方法，其过程如下将荔枝核打碎成粉过40目筛，称取荔枝核粉，加入乙醇溶液，采用微波预处理，恒温提取并间歇震荡，经过两次提取后，将提取液过滤，浓缩后加两倍量的无水乙醇静置一段时间后，充分沉淀后过滤除去蛋白质等大分子杂质。减压回收乙醇，浓缩后转入水相，配制成用于树脂吸附的荔枝核浸出液。在带塞的磨口锥形瓶中加入预处理好的吸附树脂和上述制备的荔枝核浸出液，于室温下振荡，调节上柱液PH= 5.0左右，室温下以相应流速吸附饱和；解吸时先用水淋洗，再用乙醇解吸，控制脱附剂流速和脱附剂的用量，然后收集所需成分，浓缩除去有机溶剂，最后获得纯度更高，活性更好的荔枝核黄酮类化合物。荔枝核黄酮类化合物在体外具有明显抑制腺病毒的作用。具体体现在随药物浓度增高，典型AdV感染所致的细胞病变效应(CPE)逐渐减弱、病毒抑制率逐渐增高、病毒滴度逐渐降低，并呈明显的量效关系。本发明可从荔枝核中获得含量更高、纯度更高的黄酮类化合物。提取的黄酮类化合物能有效抑制腺病毒在细胞中的复制与增殖，可用于制备抗腺病毒药物。
图I.荔枝核黄酮类化合物对Hep-2细胞的毒性作用，A :正常 Hep-2 细胞；B 80mg · L-1 的 FLC 处理 Hep-2 细胞 24h(X400)。图2.荔枝核黄酮类化合物在Hep-2细胞中对AdV_7致细胞病变作用的抑制效应。 IOOTCId50腺病毒Adv-7感染!fep-2细胞，37°C吸附Ih后，弃病毒液，于培养孔中加入含不同浓度 FLC(40,20,10,5,2. 5,1. 25mg · Γ1) IOOul/孔，5% C02，37°C培养观察。A AdV-7 感染的 Hep-2 细胞；B 10mg · L^1FLC 处理的 AdV_7 感染 H印-2 细胞；C 80mg · T1FLC处理的AdV-7感染H印-2细胞。
具体实施例方式实施例I :荔枝核黄酮类化合物的提取与纯化将荔枝核打碎成粉过40目筛，称取一定量的荔枝核粉，按照料液比I : 12加入相应体积的浓度为60vol %乙醇溶液，在700W频率微波下作用150S后，恒温提取并间歇震荡，经过两次提取后，将提取液过滤，浓缩后加两倍体积量的无水乙醇静置一段时间，充分沉淀后过滤除去蛋白质等大分子杂质。减压回收乙醇，浓缩后转入水相，配制成用于树脂吸附的荔枝核浸出液。在带塞的磨口锥形瓶中加入600mg预处理好的X-5吸附树脂和450ml 上述制备的荔枝核浸出液，并调整上样液质量浓度为O. 5mg/ml，于室温25°C下振荡(180r/ min) 24h,调节上柱液pH = 5. O,室温下以流速2ml/min吸附饱和；解吸时先用水淋洗，再用 85vol%乙醇解吸，控制脱附剂流速为O. 5ml/min，脱附剂的用量为50ml/批，然后收集所需成分，浓缩除去有机溶剂。实施例2 :荔枝核提取物中黄酮的定性鉴定和含量测定I)首先取荔枝核提取物，溶于60vol%乙醇，与HCl-Mg，AlCl3, Pb (Ac)3反应均为阳性，表明荔枝核提取物中含有黄酮类化合物。2)以60vol %乙醇为溶剂，以NaNO2-Al (NO3)3-NaOH作为显色剂，分别作芦丁标准品及荔枝核提取物的吸收曲线，二者均在508nm有一强吸收峰，故选择508nm为测定波长。准确称取芦丁标准品5. OOmg,用50vol %乙醇溶解后定容至50ml容量瓶中，配制成芦丁标准溶液(100 μ g/ml)。精确量取芦丁标准溶液 O. 00、I. 00,2. 00,3. 00,4. 00,5. 0,6. O、 7. Oml分别置于25ml容量瓶中，各加入5wt%亚硝酸钠溶液Iml摇匀，放置6min，加IOwt % 硝酸铝溶液1ml，摇匀放置6min，加4wt%氢氧化钠溶液10ml，然后用60vol%乙醇稀释至刻度，摇匀放置15min，试剂为空白作参比，测定吸光度，显色测定吸光度A，用最小二乘法得到回归方程为=A = O. 0049C(y g/ml)+0. 0027。取荔枝核提取物Iml置于25ml容量瓶中，依次加入5wt%亚硝酸钠溶液Iml,摇勻,放置6min,加IOwt%硝酸招溶液Iml,摇勻,放置6min,加4wt%氢氧化钠溶液IOml,然后用60vol %乙醇定容,摇勻，放置15min,以不含荔枝核提取物的上述试剂作参比液，在508nm处测定吸光度，得到黄酮类化合物的浓度为 13. 33333mg · mL—1，从而推知荔枝核中黄酮类化合物含量为I. 98%。实施例3 :荔枝核黄酮类化合物体外抗腺病毒作用I、荔枝核黄酮类化合物对Hep-2细胞的细胞毒性Hep-2细胞经胰酶消化后，以含10%胎牛血清的DMEM培养液制成细胞悬液，加到96孔培养板中，每孔105/100 μ 1，待细胞长满80%后每孔加入100μ I不同稀释浓度的荔枝核黄酮类化合物(160，80，40，20，IOmg · Γ1)。每一药物浓度均重复4孔，置培养箱中37°C 连续培养24小时后，MTT法测H印-2细胞的存活率。Hep-2细胞存活率=药物组平均吸光度值(OD)/细胞对照组ODX 100%荔枝核黄酮类化合物对Hep-2细胞毒性作用表现为细胞粘连、变圆、壁厚、破碎脱落，胞质内颗粒增加(见图I)，折光性增强并且吸光值明显下降。随着荔枝核黄酮类化合物的浓度增加细胞存活率呈递减趋势，用SPSS 19. O的Probit回归法计算、经直线回归分析，药物浓度与细胞存活率之间存在直线相关关系(R2 = O. 99，P < O. 05)，荔枝核黄酮类化合物半数毒性浓度TC5tl为116. 83mg · L'荔枝核黄酮类化合物在80mg · I/1范围内均未见明显的细胞毒性，从而确定该浓度为抗病毒实验的最高允许浓度。结果见表I。表I.荔枝核黄酮类化合物对Hep-2细胞的毒性作用
权利要求
1.荔枝核黄酮类化合物在制备抗腺病毒药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了荔枝核黄酮类化合物在制备抗腺病毒(AdV)药物中的应用。荔枝核黄酮类化合物在体外具有显著抑制AdV的作用，具体体现在随药物浓度增高，典型AdV感染所致的细胞病变效应(CPE)逐渐减弱、病毒抑制率逐渐增高、病毒滴度逐渐降低，并呈明显的量效关系。
文档编号A61K36/77GK102579659SQ201210070589
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月16日 优先权日2012年3月16日
发明者侯炜, 彭璇, 朱丹, 李立, 杨艳, 罗凡 申请人:武汉大学