专利名称：A型肉毒素重链刺激神经突起再生的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及A型肉毒素重链刺激神经突起再生的用途。
背景技术：
肉毒素(Botulinum Neurotoxin,BoNT)是由专性厌氧梭形芽孢杆菌-肉毒杆菌产生并释放的细菌外毒素。是一种致病力很强的天然生物毒素。根据其血清学特征肉毒素共有7种不同的类型，分别为血清型A、B、C、D、E、F和G，其中血清型A毒理最强，也是目前主要的市售肉毒素。A型肉毒素的化学成分为蛋白多肽，其分子由一条重链(heavy chain_HC，分子量为IOOkDa)和一条轻链(light chain-LC，分子量为50kDa)所组成，二者借二硫键相互连接。进入体内的A型肉毒素主要作用于运动神经终板(NMJs)的突触前膜，通过其分子中 重链羧基端与突触前膜相应蛋白受体结合形成毒素-受体复合物；同时通过毒素重链的氨基端介导内吞、使毒素轻链由细胞外转位进入细胞内。毒素-受体复合物经内吞作用进入胞浆形成内质体，由于内质体的酸性PH环境，毒素重链与轻链分离、轻链逸出进入胞衆。因此A型肉毒素的重链部分被称为毒素的结合亚单位；而肉毒素轻链则是一种金属锌依赖性蛋白水解酶，被称为毒素的催化亚单位。轻链随重链进入胞浆后主要裂解胞浆内 SNARE (soluble NSF attachment protein receptor)成分之一—SNAP-25,使后者丧失参与突触囊泡在突触前膜的停靠及其融合的功能。当神经冲动到达运动终板时，裂解的SANP-25不能与其他SNARE蛋白(syantaxin and synaptobrevin)形成突触蛋白复合体，因此突触囊泡不能在突触前膜停靠并与突触前膜融合，从而阻断神经递质乙酰胆碱释放至突触间隙，受累的神经因此不能刺激所支配肌肉发生收缩，引起肌肉松弛性麻痹。肉毒素的这种毒性作用主要是通过其分子中的轻链的酶活性而实现的。据报道除乙酰胆碱外，肉毒素还可以阻断其它神经递质的释放，譬如谷氨酸、甘氨酸、去甲肾上腺素、多巴胺、血清素及神经多肽等。临床实践中正是利用了 A型肉毒素的这种毒力作用，将其小剂量局部注射而达到某种治疗效果。肉毒素注射治疗起始于上个世纪40年代，开始时主要用于控制一些与肌肉收缩紊乱有关的病症(斜视、眨眼症、斜颈、面肌痉挛及脑瘫引起的外周肌肉强直等)。继而，肉毒素注射被广泛地用于美容科皮肤去皱、治疗多汗症、各种慢性疼痛等。近些年来，A型肉毒素在其他一些领域的临床应用及实验探讨也开始引起了人们对肉毒素研究的浓厚兴趣，譬如研究发现局部A型肉毒素注射可以抑制纤维母细胞增生及胶原产生、减少创伤愈合过程中疤痕的形成；通过肉毒素注射局部血流量增加可延长植皮皮瓣的存活。有些体内及体外的研究也曾经发现A型肉毒素全毒素局部注射引起肌肉麻痹后的恢复期可伴有肌肉组织内新的运动终板样结构形成(即神经末梢的再生)、可以刺激培养之运动神经元突起增长、数目增加等。然而，A型肉毒素上述临床或实验疗效远远不能仅用轻链对突触蛋白的裂解作用而解释。A型肉毒素重链部分与突触前膜结合所导致的细胞内信号转导通路激活及膜上其他受体蛋白构像的改变势必对上述毒素的临床不同疗效起着重要的启动作用。
中枢神经系统损伤后由于神经细胞的再生能力极低，因此常不能完全再生而恢复原有功能，即使神经细胞本身存活，但是由于其神经突起断裂后不能与周围细胞形成新的突触关系而致功能永久性丧失，所以寻找能够刺激中枢神经元和神经突起再生的新药制剂是医学领域的重要任务之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种A型肉毒素重链新的用途，具体的涉及到A型肉毒素重链刺激神经突起再生的用途，用来解决恢复神经细胞的再生能力的问题。我们取生后5天的小鼠脊髓，将其制备成富含运动神经元的细胞悬液后，接种于预先铺被了多聚赖氨酸/层粘连蛋白的培养板，在培养箱中培养I小时，待细胞完全贴壁后，加入不同剂量的A型肉毒素重链溶液继续培养24小时，然后用固定细胞，磷酸缓冲液冲洗，透膜后，5%正常羊血清室温封闭I小时，加入抗PGP9. 5—抗。将培养板放入湿盒置于4° C冰箱孵育过夜，弃去一抗，磷酸缓冲液洗涤，加入Alexa 488标记的羊抗兔IgG 二抗室温、避光孵育，磷酸缓冲液再次洗涤后将培养板置于荧光倒置显微镜下观察并摄影，对所摄 取的荧光显微镜图片中的神经细胞突起进行测定分析。通过测定结果，我们认为A型肉毒素重链具有刺激中枢神经元神经突起再生的作用。给予A型肉毒素重链处理的神经元其表面突起更具有神经细胞的特征树突和轴突样突起明显可变，轴突长、直、少分支；树突相对短且多分支。而且由于单独使用A型肉毒素重链避免了肉毒素全毒素的毒性作用，因此使用过程安全，无毒副作用，而且很小剂量既可达到刺激神经突起再生的作用，譬如重链采用剂量为O. I O. OOlnmol / L时，神经突起增长总长度较未采用重链处理组的细胞增加2倍以上，且与相对较大剂量组相比较效应基本一致，甚至更为突出。因此其促神经突起增生(再生)的效果非常显著。A型肉毒素重链对小鼠脊髓运动神经元具有促进其突起明显增生作用，其促增生作用主要表现在(I)A型肉毒素重链可促进胚胎脊髓运动神经元突起的增生；(2)A型肉毒素重链可促进生后5 7天小鼠脊髓运动神经元突起的再生；(3) A型肉毒素重链可使运动神经元突起延长；(4) A型肉毒素重链可使神经元突起的数量明显增加。由此可见A型肉毒素重链具有刺激中枢脊髓运动神经元突起再生的能力，有望成为发掘新型治疗中枢神经系统损伤再生的新药制剂的选择之一。本发明的优点在于(I)本发明对已知制剂A型肉毒素重链开发出新的临床用途，开拓了一个新的应用领域。(2)本发明所采用的A型肉毒素由于去除了毒素分子中的轻链部分，具有安全无毒、药理作用明显，而且由于毒素重链具有与神经末梢特异性结合的机制，具有对神经系统的特异性，预示着具有较好的临床应用前景。(3)本发明所采用的A型肉毒素重链已经可以通过基因工程合成，制剂来源可靠，无毒副作用并可制作成注射针剂使用。(4)本发明所采用的A型肉毒素重链对神经突起生长具有明显促增生作用，临床意义重大，市场前景广阔。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明。图I为在不同浓度A型肉毒素重链作用下，培养的脊髓运动神经元突起生长的变化。图2为在不同剂量A型肉毒素重链对脊髓运动神经元突起长度增长的影响，其中*p〈0. 05，与 H-CaO'lOAKT1。)组相比；其中 ***p〈0. 001，与 H-C(1(T8，10_9，10_1Q)组相比。图3为在A型肉毒素重链对小鼠脊髓运动神经元神经突起分支数量的影响，其中***p〈0. 01，p〈0. 001，与!《(10-8，10-9，10,)组相比。
具体实施例方式下面给出一种根据本发明制备的非限定性的实施例。将用市售A型肉毒素重链制剂作为促进神经突起再生的刺激剂。I.美国ListBiological Laboratories公司基因重组A型肉毒素重链产品产品号612A，包装大小50μ g。产品中重链重组的436个氨基酸序列基于原毒素的第872 1296氨基酸序列。分子重量为51kDa。重组的A型肉毒素重链仍然具有抗原性，可与抗A型肉毒素抗体发生反应；并具有与神经细胞膜上GTlb及SV2结合的能力。2.本发明所采用实验对象为啮齿类动物中枢神经系统，来自胚胎或生后5 10天的动物大脑皮层、海马及脊髓组织。将其制备成富含运动神经元的细胞悬液后，以O.IXlO6 / ml接种于预先铺被了多聚赖氨酸/层粘连蛋白的培养板在37° C孵箱(95%CO2 / 5% O2)内培养I小时，待细胞完全贴壁后，加入不同剂量的A型肉毒素重链溶液(制剂浓度范围为10_7 10_12M / L)后继续培养I 7天。为了对照比较，另设正常对照组-未给予A型肉毒素重链组。各组每次实验均设定4各培养孔为一组，每孔内所含细胞数约为5000个左右。待培养至一定期限(1、2、3、4一7天)时，用4%多聚甲醛固定细胞(室温下I小时)，磷酸缓冲液冲洗，O. 1% Triton X-100透膜10分钟，5%正常羊血清室温封闭I小时，加入抗PGP9. 5) 一抗(神经元及神经突起标记蛋白。将培养板放入湿盒置于4° C冰箱孵育过夜。弃去一抗，磷酸缓冲液洗涤3次，每次5分钟，加入荧光标记的二抗后室温、避光孵育I小时，磷酸缓冲液再次洗涤后将培养板置于荧光倒置显微镜下观察，每孔随机选择6个高倍视野摄影(40X)，每组共采集24个视野。对所摄取的荧光显微镜图片中的神经细胞突起(每组共测定细胞数为50个)进行测定分析。同样实验重复三次。三次实验所得结果为本发明所陈述结果。3.通过测定结果我们认为A型肉毒素重链具有刺激中枢神经元神经突起再生的作用。给予A型肉毒素重链处理的神经元其表面突起更具有神经细胞的特征树突和轴突样突起明显可变，轴突长、直、少分支；树突相对短且多分支(图I)。而且由于单独使用A型肉毒素重链避免了肉毒素全毒素的毒性作用，因此使用过程安全，无毒副作用，而且很小剂量既可达到刺激神经突起再生的作用，譬如重链采用剂量为0. I 0. OOlnmol / L时，神经突起增长总长度较未采用重链处理组的细胞增加2倍以上，且与相对较大剂量组向比较效应基本一致，甚至更为突出。因此其促神经突起增生(再生)的效果非常显著(图1，2)。
另外，给予A型肉毒素重链处理后，神经细胞突起分支也明显增多，大剂量组与小剂量组之间对于神经突起分支的作用基本一致，因此，可以采用小剂量应用而避免今后临床长期应用或多次应用所导致耐受性或免疫反应的反应的发生，使疗效更为稳定，长久(图 3)。除神经突起长度明显增长外，在A型肉毒素重链作用下，脊髓运动神经元细胞突起数量也比对照组明显增多，主要表现为二级突起数量增加及细胞周围突起的总数量显著增加(图3)。由于A型肉毒素重链的细胞膜结合蛋白(GTlb及SV2)广泛存在，同时脊髓运动神经元是形态结构发育最为完善的中枢神经细胞之一，因此，A型肉毒素重链刺激其神经突起增生反应代表了中枢神经元的共同特征。基于此点，可以推测A型肉毒素重链对其他部位的中枢神经细胞具有同样的效应。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式
，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可 轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
权利要求
1.A型肉毒素重链刺激神经突起再生的用途。
2.根据权利要求I所述的用途，其特征在于所述的A型肉毒素重链，为重组的氨基酸序列，其重组的436个氨基酸序列基于原毒素的第872 1296氨基酸序列，分子重量为51kDa，具有抗原性。
3.根据权利要求I所述的用途，其特征在于所述的神经为啮齿类动物中枢神经系统。
4.根据权利要求2或3所述的用途，其特征在于所述的A型肉毒素重链，其用量为IO-7 KT12M / し
5.根据权利要求2或3所述的用途，其特征在于所述的A型肉毒素重链，其用量为10べ0 KT12M /し
全文摘要
本发明公开了一种A型肉毒素重链新的用途，具体的涉及到A型肉毒素重链刺激神经突起再生的用途；其促增生作用主要表现在A型肉毒素重链可促进胚胎脊髓运动神经元突起的增生，A型肉毒素重链可促进生后5～7天小鼠脊髓运动神经元突起的再生，A型肉毒素重链可使运动神经元突起延长，A型肉毒素重链可使神经元突起的数量明显增加；由此可见A型肉毒素重链具有刺激中枢脊髓运动神经元突起再生的能力，有望成为发掘治疗新型中枢神经系统损伤再生的新药制剂的选择之一。
文档编号A61P25/02GK102861318SQ20121036998
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月29日 优先权日2012年9月29日
发明者李夏青, 王志茹, 王晨亮, 张宏, 齐超 申请人:山西医科大学